aula HPLC jul2014

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Cromatografia líquida 
de alta eficiência
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Universidade Federal de Santa Catarina
Departamento de Química
Aula de: Michelle Barcellos
Professor: Ivan Gonçalves de Souza
Cromatografia líquida de alta 
eficiência
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Modalidades e Classificação
Cromatografia
Gasosa (CG)
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Fase Fase 
MMóóvelvel
Líquida
Gás
Cromatografia
Líquida
Fator GC HPLC
Requisito p/ amostra Volátil e termicamente estável Solúvel na fase móvel
Tipos de amostra Gases, líquido e sólidos Líquidos e sólidos
Introdução à cromatografia 
líquida
• Versatilidade
• Sensibilidade
• Resultados quantitativos
• Espécies não-voláteis e termolábeis
• Automatização
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Vantagens da técnica
• Alto custo do instrumento
• Alto custo de operação
• Falta de detector universal sensível
• Necessidade de experiência no seu 
manuseio
Limitações da técnica
Comparações entre CG e HPLC
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Equipamento de HPLC
Introdução à cromatografia líquida
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Instrumentação para HPLC
Introdução à cromatografia líquida
fase mfase móóvelvel
InjetorInjetor
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Instrumentação para HPLC
Introdução à cromatografia líquida
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Instrumentação para HPLC
Fase móvel
Reservatório da Fase Móvel
Características da fase móvel
• Alto grau de pureza ou fácil purificação;
• Dissolver a amostra sem decompor seus componentes;
• Não decompor ou dissolver a fase estacionária;
• Ter baixa viscosidade;
• Ser compatível com o tipo de detector;
• Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da 
amostra.
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Instrumentação para HPLC
Fase móvel
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Bomba
Instrumentação para HPLC
Bomba para HPLC
Sistema de bombeamento
REQUISITOS:
• Vazão contínua, sem pulsos 
(ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos);
• Vazões de 0,1 a 10 ml/min 
• Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 %;
• Inércia química: componentes resistente à corrosão.
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Instrumentação para HPLC
Bomba para HPLC
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Injetor
Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC
• Loop de 0,5 a 500 µL
• Reprodutível
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Sistema de injeção Loop
Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC
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Preenchendo o Loop (Load)
Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC
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Injetando no Loop
Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC
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Coluna
Instrumentação para HPLC
Colunas para HPLC
• Pequena e de constituição similar à da coluna analítica
• Retém:
• Material particulado
• Contaminantes do solvente
• Componentes da amostra que se ligam irreversivelmente à fase estacionária.
• Custo reduzido
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Pré-colunas
Instrumentação para HPLC
Colunas para HPLC
Geralmente em aço inox
Coluna empacotada
Preço: > R$ 1.500,00
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Características das colunas de HPLC
Instrumentação para HPLC
Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl
Si
OH
silanol livre
•• Ciano (-C2H4CN)
Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
Amina (–C3H6NH2)
R = 
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Tipos de interação soluto/fase estacionária
Fase normal
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Tipos de interação soluto/fase estacionária
Fase reversa – Fase ligada
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Tipos de interação soluto/fase estacionária
Cromatografia Quiral
Separação de isômeros ópticos
�Fase estacionária: ciclodextrinas, éteres de coroa;
� Fase móvel: tampões, solventes polares, seletores quirais;
A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou 
mistura de solventes).
Se um solvente não propiciar uma eluição 
suficientemente rápida de todos os componentes, então 
pode ser utilizada uma eluição por gradiente.
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação isocrática ou por gradiente
Tipos de eluição
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação isocrática
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação isocrática
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação isocrática
Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir.
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação por gradiente
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação por gradiente
30% ACN 
32% de THF40 % MeOH
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Monógrafo 
Porcentagem de volume de solvente com mesma força.
29Detector
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC
A sensibilidade deve ser compatível com a concentração do analito na amostra.
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Características ideais para o detector
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC
Detector universal
Detector seletivo:
� Permite detectar uma de duas ou mais espécies que coeluam.
� Em geral, melhor linha base.
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Características ideais para o detector
Ampla faixa linear:
�Maior comodidade no dimensionamento do volume de amostra.
� Analisar em uma mesma corrida cromatográfica espécies de concentrações diferentes.
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC
Baixo volume interno
Grande volume: Alargamento dos picos registrados.
Resposta Rápida
� Sinal que represente o exato instante de detecção.
� Detector lento: Picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.
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Detector por espectrofotometria UV-visível
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC
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Detector por arranjo de diodos - DAD
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC
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Resultado da detecção - Cromatograma
Instrumentação para HPLC
Detector por arranjo de diodos - DAD
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Resultado da detecção – Cromatograma em 3D
Instrumentação para HPLC
Detector por arranjo de diodos - DAD
Referências 
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1. COLLINS, C.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Fundamentos de 
Cromatografia. 1ª reimpressão.. Editora da UNICAMP - Campinas: 
Editora da UNICAMP, 2007.
2. SKOOG, D. A., WEST, D. N. Fundamentos de Química Analítica. 
Barcelona : Reverte, 1974.
3. SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A. Principles of 
instrumental analysis. Philadelphia: Saunders College Publishing , 
c1998