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TÉCNICAS DE IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Novembro/2017
INTRODUÇÃO
PROTEÍNAS
São macromoléculas que tem múltiplas funções dentro da célula. Praticamente todas as reações que ocorrem no interior da célula, envolvem as proteínas. Elas constituem a maior parte da matéria seca da célula.
 As proteínas podem ter diversas funções:
Proteínas estruturais, onde oferecem suporte mecânico para células e tecidos como exemplo o colágeno, que ajuda a célula a interagir para formar tecidos; 
Toda enzima é uma proteína. As enzimas tem a função de diminuir a energia de ativação das reações. Tem algumas enzimas que fazem parte do metabolismo da células. As lipases, por exemplo;
Papel de transporte nas células também. A hemoglobina, por exemplo, transporta o oxigênio. Alguns canais que se formam na membrana plasmática, também são de natureza proteica; 
Papel motriz, onde gera movimento nas células e tecidos. Ex: Miosina;
Papel de reserva que armazena pequenas moléculas e íons. Ex: Caseína, que está presente no leite, e é uma fonte de aminoácidos para os mamíferos;
Sinalizadores, onde transmite sinais de uma célula a outra, como a insulina;
Receptora, que utiliza as células para detectar sinais e transmiti-los para a maquinaria celular de resposta. Ex: Rodopsina, proteína que absorve a luz;
Podem ter papel de defesa, como os anticorpos, que são de natureza proteica.
Toda proteína tem como unidade básica os aminoácidos e estão unidos entre si por uma ligação covalente (ligação peptídica). Com isso, formam uma sequencia de aminoácidos. Essa cadeia é chamada de polipeptídio. 
Todo aminoácido é formado por um átomo de carbono (carbono alfa), que faz ligação com uma amina, um ácido carboxílico, um átomo de hidrogênio e uma cadeia lateral. O que difere um aminoácido do outro é a cadeia lateral. 
A forma da proteína é determinada pela sequencia de aminoácidos.
COMO AS PROTEÍNAS DESEMPENHAM SUAS FUNÇÕES
As proteínas são moléculas que muitas vezes estão envolvidas no processo reativo da célula. Toda reação química envolve uma proteína ou enzima que vai catalisar essa reação ou seja vai fazer com que a reação ocorra de uma forma mais rápida. 
Toda proteína, frequentemente, se liga a outras moléculas para desempenhar sua função. Essa ligação é altamente seletiva e específica. Essas ligações são ligações fracas não covalentes, podendo ser Pontes de Hidrogênio, Ligações iônicas, força de Van Der Waals e interações hidrofóbicas. Qualquer substância que se liga a proteína, seja ela um íon, uma macromolécula ou uma molécula pequena, é denominada ligante da proteína. 
Para que haja uma boa interação entre as duas moléculas, a conformação espacial do ligante tem que ser apropriado. O ligante deve ser complementar s superfície da proteína. 
A região que a proteína se liga ao seu ligante é chamada de sítio de ligação e esse local representa uma cavidade na superfície da proteína que ocorre devido a um arranjo particular dos aminoácidos. Esses aminoácidos que fazem parte do sítios da ligação estão mais distantes entre si e só se aproximam a partir do momento que a proteína tende a se compactar. Assim, as cadeias laterais dos aminoácidos, fazem então as pontes fracas com a molécula de ligante, formando então um complexo proteína-ligante.
MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO E SEPARAÇÃO DAS PROTEÍNAS
Normalmente as proteínas estão associadas a outras moléculas e para que possamos fazer a separação de mistura de uma proteína com outra molécula ou de várias proteínas juntas, ós temos que levar em consideração algumas características dessa proteína.
As proteínas podem ser separadas e fracionadas com base:
Seu tamanho e forma;
Carga;
Hidrofobicidade;
Afinidade por outras moléculas. 
Existem diversos métodos de separação, e falaremos de alguns deles:
Eletroforese Em gel de poliacrilamida É o método mais utilizado atualmente. Aplica-se um campo elétrico (Normalmente éutilizado o detergente STS-PAGE, que dá uma carga negativa ao sistema) em uma solução contendo moléculas de proteínas; Com isso, as moléculas migram em uma direção (polo positivo) e com uma velocidade que pode refletir em sua carga líquida e seu tamanho. 
O gel é preparado pela polimerização de monômeros e o tamanho do poro de gel pode ser ajustado com o objetivo de ser suficientemente pequeno para retardar a migração das moléculas proteicas de interesse.
É utilizado o detergente STS-PAGE, que dá uma carga negativa ao sistema . 
Basicamente, as proteínas que são maiores ficam mais próximas do local onde é aplicado o gel. Elas correm com uma velocidade menor, ficando retidas.
As menores, consegue atravessar a peneira e conseguem migrar mais facilmente em direção ao polo positivo. 
O gel, da eletroforese, é incolor. O ideal é que se adicione uma coloração para que possa se fazer a leitura das bandas de proteínas. As bandas que são majoritárias, as proteínas em maior quantidade, aparece bem nas leituras de bandas. As que estão em menor quantidade, se recomenda adicionar um corante prata, para se poder ler mais facilmente. 
Focalização isoelétrica Leva em consideração o pH isoelétrico da proteína. Nela, é feita uma eletroforese porém o gel tem um gradiente de pH.
Toda proteína tem um ponto isoelétrico que é típico dela. Ao aplicar a proteína no gel, se ela tiver pH acido, ela vai com uma carga positiva; próximo ao pH básico ela vai estar com uma carga negativa. 
Se submete esse gel a um campo elétrico e as proteínas começam a migrar. As que estão negativas, vão para o polo positivo e as que estão negativas, vão para o polo positivo. No equilíbrio, é exatamente o pH que corresponde ao ponto isoelétrico . Nesse ponto ela não tem uma carga líquida. A partir daí se consegue ir fracionando e separando por essa características do ponto isoelétrico, onde as cargas se igualam.
Eletroforese Bidimensional Existem misturas proteicas que precisam que haja o acoplamento das duas técnicas citadas acima.
Primeiro, Se submete a mistura proteica a eletroforese da esquerda para direita, num gel de gradiente de pH. E depois se submete essa proteína no SDS PAGE que corre perpendicular, de cima pra baixo e juntando esses dois dados, o gel forma manchas. Cada mancha corresponde a uma proteína. 
Consegue-se aproximas o peso molecular e o ponto isoelétrico. 
Cromatografia Método muito empregado. Utiliza-se uma resina, que são grãos minúsculos. Elas estão em uma coluna que pode ser de vidro ou plástico.
Dependendo da característica da molécula de proteína, podemos optar por alguns tipos de cromatografias. Como por exemplo: 
Cromatografia de Troca-Iônica Se minha proteína tem polaridade. A associação entre uma proteína e resina depende do pH e da força iônica da solução que passa pela coluna. 
Cromatografia de gel-filtração Para se separar por tamanho; As proteínas que são menores conseguem entrar nos poros e ficam mais tempo no sistema. As que são maiores vão logo sendo eliminadas da resina.
Cromatografia de afinidade Se quero separar uma determinada proteína pelos grãos (quando ela passa, ela se liga ao substrato que está preso a minha resina); Quando a proteína passa, ela reconhece seu ligante e forma um complexo. As proteínas que não se ligam ao substrato, saem logo do sistema. Para fazer a dissociação do complexo, deve-se mudar o pH ou uma solução salina concentrada para poder quebrar as ligações e chegar ao resultado final do processo.
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Pressão O solvente entra na coluna com pressão, acelerando o processo. Tem uma fase estacionaria e uma fase móvel. Temos a resina empacotada numa coluna e é aplicada a amostra. Se aplica também um eluente para empurrar e impulsionar a mistura a andar pela coluna), com isso as proteínas vão se separando por tamanho. Algumas ficam retidas nos poros, outras saem mais facilmente. 
É muito utilizada na indústria, pois por ter alta pressão as indústrias consegue acelerar o processo. Ela é usada para identificação, quantificação e purificaçãoda proteína. 
Espectrometria de Massa Serve para identificar proteínas e para sequenciar aminoácidos. As proteínas são inicialmente quebradas em peptídeos curtos e ai são misturadas com ácidos orgânicos e submetidos a um laser, para que se tornem ionizados. Com isso, os peptídeos ionizados são submetidos a um campo elétrico, se deslocando em direção a um detector. A massa e a carga determina o tempo que ela leva para chegar ao detector.
Essa informação é utilizada para analisar banco de dados, nos quais as massas já tem um padrão e estão previamente organizados e conhecidos. 
Cada vez que clivo mais os peptídeos, e submeto novamente ao espectro, consigo sequenciar os aminoácidos inicias, podendo-se estudar o gene e até clonar o gene.
Sequenciamento de Aminoácidos Sequenciador Automático. Tem-se o peptídeo e acopla-se a ele um reativo químico. Submete-se esse complexo a um ácido fraco, onde ocorre a quebra do primeiro peptídeo ligado ao reativo químico. É um jeito de ir tirando um aminoácido por vez e ai detectamos um pico. 
Esse processo é feito sucessivamente e ai vai-se clivando até obter o seu produto. Depois, compara-se com aminoácidos padrões, já organizados e sequenciados anteriormente.
Cristalografia de Raio X Utilizado para desenhar a forma tridimensional da proteína. Ela se baseia no fato que se tiver o cristal da proteína pura e emitir raios x desse cristal, alguns desses raios, quando incidir nos átomos do cristal, vão ser difratados. O detector capta isso. E por um programa tridimensional, ele consegue fazer o desenho pelo raio captado.