Cromatografia Liquida Metodos Cromatograficos 2018 1

Prévia do material em texto

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
(CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO)
1
Características dos analitos X Análise 
cromatográfica
2
Fabricante: Agilent
Cromatógrafos Comerciais
3
Cromatógrafos Comerciais
Fabricante: Varian Fabricante: Shimadzu
4
Componentes de um cromatógrafo líquido
5
Componentes de um cromatógrafo líquido
6
FASE MÓVEL
• A fase móvel passa pela fase estacionária, que está
dentro de uma coluna (cromatografia em coluna), e os
componentes da amostra são separados pela
diferença de afinidade entre as duas fases.
FASE MÓVEL: SOLVENTES LÍQUIDOS
• Solventes orgânicos
• Solvente aquoso: água e soluções tampão.
• Misturas de solventes: é necessário verificar a
compatibilidade entre os solventes.
7
ESCOLHA DO SOLVENTE
Parâmetros devem ser considerados para a escolha do solvente:
• Viscosidade: Viscosidade elevada acarreta em dificuldades no
bombeamento e elevam a variação da pressão
• Compressibilidade
• Pressão de vapor
• Toxicidade
• Índice de Refração
• Corte de UV (cut off): espectro de absorção UV-VIS; comprimento
de onda abaixo do qual o solvente absorve mais que uma unidade
de absorbância em uma cela de 1 cm de caminho óptico; impurezas
podem alterar muito o valor do cut off
8
PROPRIEDADES DOS SOLVENTES
IR: índice de refração (muito importante quando utilizado o detector 
de índice de refração)
9
ESCOLHA DO SOLVENTE
• Os analitos devem se dissolver na FM para que sejam
transportados através da coluna
• Imiscibilidade com a FE
• Inércia química com a FE e os componentes da amostra
• Pureza condizente com o detector utilizado.
• Mistura de solventes devem produzir soluções homogêneas :
fator importante nas análises por gradiente
• Sistemas não miscíveis prejudicam o desempenho da bomba,
da coluna e induzem ruídos no detector além de alterar os
tempos de retenção e prejudicar as análises quantitativas.
10
ESCOLHA DO SOLVENTE
FORÇA DOS SOLVENTES
A interação das moléculas analisadas (analitos) com o
solvente (FM) e consequentemente suas solubilidades
depende basicamente das forças intermoleculares:
• Dispersão (van der Waals)
• Interação dielétrica (interação íon-dipolo)
• Dipolo – dipolo
• Ligação de hidrogênio
11
FASE MÓVEL - FILTRAÇÃO
• A fase móvel não pode conter partículas para evitar
danos à bomba, injetor e coluna: necessário a filtração
antes de armazenar a fase móvel no reservatório.
• A escolha do filtro é função da natureza da fase móvel.
Usualmente utiliza-se membranas de nylon (0,20 e
0,45 µm), celulose (0,22 µm) ou Teflon (1 e 1 ,5 µm).
12
FASE MÓVEL: 
REMOÇÃO DE GASES DISSOLVIDOS
• A fase móvel deve ser degaseificada para evitar a formação de
bolhas no processo de separação, o que pode interferir no
desempenho da análise.
As técnicas de degaseificação são:
i. Irradiação de ultrassom
ii. Refluxo com resistência de aquecimento
iii. Aplicação de vácuo (pressão negativa)
iv. Purga com gás hélio ou gás nitrogênio
v. Uso de membrana semipermeável e vácuo in line.
13
BOMBA CROMATOGRÁFICA 
• Transporta a fase móvel desde o reservatório, coluna e até aos
detectores
Características:
• Alta reprodutibilidade e exatidão de pressão, bombeamento e
mistura de solventes
• Vazão contínua de 0,01 a 10 mL min-1
• Vazão constante e independente da pressão na coluna
cromatográfica
• Alta resistência à corrosão: inércia química a solventes
• Opera em altas pressões (até 12000 psi, dependendo do fabricante)
14
BOMBA CROMATOGRÁFICA 
• A vazão constante é essencial para a separação de analitos
• Alta pressão é necessária para impulsionar o solvente através da
coluna cromatográfica, vencendo a enorme resistência imposta pela
fase estacionária.
• Normalmente, se utilizam bombas recíprocas com um ou dois
pistões para minimizar a pulsação
• Preferencialmente, devem operar com programação de vazão e
deve ser possível a interrupção do processo em pressões fora dos
limites máximos e mínimos pré-estabelecidos.
• É importante introduzir fatores de correção de compressibilidade
para a fase móvel utilizada, ainda que os líquidos tenham baixa
compressibilidade.
15
BOMBA CROMATOGRÁFICA 
16
Pistão de Safira para 
bomba de HPLC
BOMBA CROMATOGRÁFICA 
Princípio de funcionamento
17
BOMBA CROMATOGRÁFICA 
• BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO
• A composição da fase móvel é mantida
constante durante toda análise cromatográfica.
• Pode ser só um solvente ou uma mistura de
solventes.
18
BOMBA CROMATOGRÁFICA 
• BOMBEAMENTO POR GRADIENTE
• Alteração da composição da fase móvel, sem alteração da
vazão total, com a finalidade de diminuir tempo de análise
e/ou melhorar a separação dos analitos da amostra.
• O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão
ou a alta pressão.
• No caso de baixa pressão, utiliza-se uma única bomba e a
seleção do solvente ocorre através de válvula de múltiplas
vias.
• No caso do bombeamento de alta pressão, cada solvente tem
uma bomba específica.
19
INJETOR
• A injeção de amostra é realizada com auxílio de válvulas
especiais que permitem introdução com grande precisão
e exatidão de volumes que variam, em geral, de 5 a 20
µL.
Composição do injetor pode ser de:
i. Aço inoxidável
ii. PEEK (Poliéter-Éter-Cetona)
iii. Resina perfluorada
20
LOOP PARA INJEÇÃO DA AMOSTRA
Para colunaDa bomba Da bomba Para a coluna
Loop da amostra
Carregar a amostra Injetar a amostra
21
Seleção do tipo de modalidade cromatográfica em 
função da polaridade dos analitos medida pelo log P
22
FASE ESTACIONÁRIA 
• As FE são constituídas de material sólido, granulado,
finamente dividido e densamente empacotado dentro de um
tubo feito de material inerte, normalmente aço.
• O material sólido pode estar revestido ou ligado
quimicamente a um líquido.
23
FASE NORMAL = Fase Polar 
• Composição: sílica, alumina
FASE REVERSA = Fase Não Polar 
• Composição: sílica gel, C18, C8… 
FASE ESTACIONÁRIA 
24
FASE ESTACIONÁRIA 
Fase/Modo Uso (%)
Fase reversa 50,6
Fase normal 24,1
Troca Iônica 14,1
Exclusão por tamanho 6,6
Quiral 3,5
Hidrofóbica 1,1
25
CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL 
Hexano, diclorometano, isopropanol, metanol
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA 
Água, metanol, acetonitrila, tetrahidrofurano (THF)
FASE ESTACIONÁRIA 
Aumento da força do solvente
Aumento da força do solvente
26
FASE ESTACIONÁRIA NORMAL
• Grupos Funcionais Polares são ligados à matriz de
sílica. A técnica, em geral, substitui com
vantagens a Cromatografia por Adsorção.
Grupos funcionais mais comuns:
✓DIOL
✓CIANO
✓AMINO
27
Interações dos analitos com fase 
estacionária polar
28
Características da Fase Normal
29
Micrografia de 5 µm de sílica
30
Corte transversal do bastão cilíndrico 
de sílica monolítica e sua ampliação
31
Características da Fase Normal
32
Força de eluição em Fase Normal
• Retenção aumenta com aumento da polaridade dos solutos
• Agentes de supressão iônica melhoram a resolução
cromatográfica
# Ácido acético ou fórmico para analitos ácidos.
# Amônia ou trietilamina para analitos básicos
33
FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Fase estacionária menos polar que a fase móvel
Solventes mais comuns utilizados
• Água (solvente mais fraco)
• Acetonitrila (ACN)
• Metanol (MeOH)
• Tetrahidrofurano (THF)
34
Relação entre polaridade do solvente e tempo 
de retenção em modo de fase reversa
60/40
Eluente: Metanol / Água 
80/20
70/30
35
Fase estacionária reversa: orientações para a 
otimização da separação dos picos cromatográficos
36
FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Adequada para compostosnão iônicos, compostos
polares a mediamente apolares.
• Ordem de eluição (ordem crescente): Analitos mais
polares→ Analitos mais apolares
37
FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Os grupos funcionais ligados à base de sílica são
apolares. Os analitos são atraídos para a superfície
pelos seus grupos funcionais não polares. O analito
mais polar elui primeiro, seguidos pelos outros em
ordem decrescente de polaridade.
Grupos funcionais mais comuns:
• Butil
• Octil
• Fenila
• Octadecil: responsável pela maioria das separações
em fase reversa.
38
FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
• Composição da Fase Estacionária
39
Distribuição espacial dos componentes 
da fase estacionária (C18)
40
Efeito da temperatura na fase estacionária
41
NOVAS FASES ESTACIONÁRIAS (POLAR, APOLAR ??)
42
NOVAS FASES ESTACIONÁRIAS (POLAR, APOLAR ??)
43
NOVAS FASES ESTACIONÁRIAS (POLAR, APOLAR ??)
44
Interações entre analitos quirais
(enantiômeros) e a fase estacionária
45
Mecanismos de Separação
Em função da fase estacionária utilizada tem-se os
seguintes mecanismos de separação:
• Adsorção
• Partição
• Troca iônica
• Exclusão
• Bioafinidade
• Mistura de mecanismos
46
Mecanismos de Separação
47
Mecanismos de Separação
48
Fases Quimicamente Ligadas
49
50
Relação entre tempo de retenção e 
polaridade da fase estacionária e analitos
C18 (ODS) 
CH3
Strong
Weak
OH
MECANISMO DE EXCLUSÃO POR TAMANHO 
Fase 
Estacionária
O tamanho das moléculas do 
soluto determinam a entrada ou 
não nos poros da fase estacionária.
51
MECANISMO POR EXCLUSÃO
• Principais 
analitos: 
✓ Polímeros
✓ Proteínas
✓ Peptídeos
✓ Carboidratos
✓ Ácidos 
Nucleicos 
52
MECANISMO POR TROCA IÔNICA
• A separação baseia-se na interação eletrostática dos componentes da
amostras com grupos iônicos da FE.
• A FE é normalmente uma resina de poliestireno-divinilbenzeno a qual estão
ligados grupos iônicos, ou a FE é sílica recoberta com uma fina camada de
poliestirenodivinilbenzeno onde grupos iônicos estão ligados.
• Os grupos quimicamente ligados presentes em todo tipo de material de
troca iônica são:
• SO3
2- : trocadores fortes de cátions
• CO2
- : trocadores fracos de cátions
• NR3
+: trocadores fortes de ânions
• NH2R
+: trocadores fracos de ânions
53
MECANISMO DE ADSORÇÃO
• Utiliza partículas porosas em geral de 5 micra ou 10
micra
• Indicada para substâncias com massa molecular menor
que 2000 Daltons
• Solventes mais utilizados são de média e baixa
polaridade
• Adsorventes mais utilizados: alumina e principalmente
sílica.
54
CROMATOGRAFIA POR INTERAÇÕES 
HIDROFÍLICAS (HILIC)
• HILIC é considerada uma cromatografia de partição, mas não
de adsorção ou dessorção: utiliza elevados níveis de solventes
orgânicos e colunas especiais
• Usa a fase estacionária hidrofílica e fase móvel com mistura
de solvente orgânico e água
• HILIC permite reter compostos que são fracamente retidos
por cromatografia de fase reversa.
55
Fases estacionárias para HILIC
56
Relação entre HILIC e demais 
modalidades de cromatografia
57
Tipos de interações presentes na cromatografia 
por interações hidrofílicas (HILIC)
58
Pré-Coluna / Coluna de Guarda
É uma pequena coluna instalada antes da coluna analítica.
IMPORTANTE: Sempre usar pré-colunas para proteger e
aumentar a vida da coluna analítica
CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS:
• Protege a coluna analítica contra contaminações
químicas e reter materiais que por reações químicas
podem precipitar sobre a fase estacionária.
• Mesmo material de empacotamento da coluna
• Comprimento Típico: 25 mm
59
Pré-coluna e Coluna de Guarda
Coluna de Guarda
Pré-coluna
60
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
• A separação é efetuada nas colunas cromatográficas, feitas em aço
e resistentes a altas pressões (até 500 atm)
• Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária
conveniente, geralmente sílica ou seus derivados, com
granulometria de 3, 5, 7 ou 10 µm de diâmetro médio.
• Devido a queda de pressão elevada nos tubos, as colunas são
relativamente curtas e de paredes espessas.
COMPRIMENTO: 3 – 60 cm
DIÂMETRO INTERNO: 0,2 – 8 mm
61
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
• Como o tempo de retenção depende da temperatura, as
colunas devem ser mantidas termostatizadas em um
forno onde pode-se selecionar a temperatura apropriada
para a separação
• Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua
eficiência, estão sendo introduzidas colunas de diâmetro
interno de 1 – 3 mm, de forma que possa operar-se com
fluxos menores, resultando em diminuição substancial
do custo de operação e aumento de sensibilidade.
62
Influência do diâmetro interno da 
coluna na quantificação dos analitos
63
DERIVATIZAÇÕES: REAÇÕES PÓS-COLUNA
• Para a detecção de alguns componentes, principalmente a baixas
concentrações, é preciso transformá-los em derivados que apresentem maior
sensibilidade para um determinado detector.
• Isso é necessário quando o analito:
• Não é bom cromóforo
• Não é bom fluoróforo
• Não é eletroquimicamente ativo
Nestes casos efetua-se reações específicas, formando derivados que possam
apresentar algumas das seguintes propriedades:
➢ Alta constante de equilíbrio de formação
➢ Rápida velocidade de formação
➢ Espectro UV-VIS de alta sensibilidade
➢ Fluorescência
➢ Eletroquimicamente ativos
64
Derivatização pós-coluna
65
DETECTORES
• O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que
registra a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser
registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a
quantidade do analito analisado.
Um detector adequado deve possuir as seguintes características:
• Alta Sensibilidade
• Estabilidade: Mudanças de temperatura e vazão de fase móvel não
devem alterar o sinal
• Reprodutibilidade
• Resposta Linear A resposta do detector deve variar linearmente
com a concentração do analito numa extensa faixa de concentração
66
DETECTORES
• Resposta rápida aos analitos
• Não contribuir para o alargamento do pico: O volume da
cela do detector deve ser o menor possível para evitar a
perda de eficiência do sistema. Celas de baixo volume,
contribuem positivamente com a sensibilidade
• Confiabilidade
• Facilidade de manuseio
• Não destrutivo: Condição necessária para cromatografia
preparativa
• Seletividade: Habilidade relativa de um detector medir um
composto e não outro
67
DETECTORES
Os principais detectores utilizados em HPLC são:
➢ Índice de refração
➢Espectrometria UV-Visível
➢Fluorescência
➢Eletroquímico
➢Espectrometria de massa
68
Detector de Índice de Refração
• Na passagem do analito pelo detector pode ocorrer a alteração do índice
de refração (IR) da fase móvel.
• A detecção só é possível quando o índice de refração do analito é diferente
do IR da fase móvel.
• Em geral, pode ser utilizado quando os analitos não absorvem na região do
UV-VIS.
APLICAÇÃO: Análises de carboidratos em geral.
Apresenta as seguintes desvantagens:
❑ Baixa sensibilidade
❑ Não permite a utilização em análises por gradiente (pois o IR varia com a
composição da fase móvel)
❑ Temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura) 69
Detector de UV-Visível (UV-VIS)
• Baseia-se na absorbância da luz pelo analito ao passar pelo
detector.
• Detector seletivo, pois só detecta as substâncias que absorvem no
comprimento de onda em que o detector for ajustado.
• Detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das
substâncias absorvem radiação UV-Vis (entre 190 nm e 800nm).
APLICAÇÕES: olefinas, aromáticos, compostos contendo ligações
C=O, C=S, N=O.
70
Detector de UV-Visível (UV-VIS)
CONSIDERAÇÕES
➢ A fase móvel utilizada não pode absorver no comprimento de onda
selecionado
➢ A pureza da fase móvel é extremamente importante (traços de impurezas
podem absorver intensamente no comprimento de onda utilizado):
UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC
➢ Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto de
interesse absorve e outros não.
➢ Permite a utilização de análise por gradiente: escolha do comprimento de
onda onde os constituintes da fase móvel não apresentam variação de
absorbância.
➢ Permite obter o espectro de absorbância de cada componente separado
interrompendo o fluxo da fase móvel e assim selecionar o melhor
comprimento de
onda.
71
Detector DAD (REDE DE DIODOS)
• Nesse tipo de detector, toda a radiação passa pela cela.
• A radiação emergente é dispersada em uma grade
holográfica e os comprimentos de onda resultantes são focalizados
em uma rede de fotodiodos (256 a 1024 fotodiodos).
• Assim, todo o espectro do analito pode ser armazenado. Pode-se
reproduzir um cromatograma para um determinado comprimento de
onda ou produzir uma série de espectros em intervalos de tempo fixos.
APLICAÇÕES:
➢ Substâncias que absorvem na região do UV-Visível.
➢ Muito importante na determinação de impurezas nas sínteses e 
controle de qualidade de princípios ativos de produtos farmacêuticos.
72
Detector DAD (REDE DE DIODOS)
73
Detector Eletroquímico
No processo eletroquímico, um par de eletrodos é colocado na cela e
um potencial suficientemente elevado é aplicado provocando uma
reação de oxidação ou redução. Isto gera uma corrente elétrica que é
medida em um detector eletroquímico. A corrente gerada é
proporcional a concentração da substância.
Detector Amperométrico: O analito flui pela superfície do eletrodo
onde uma fração das espécies eletroativas é oxidada ou reduzida (15 a
20 %).
Detector Coulométrico: o analito flui através de um eletrodo de grafite
poroso onde praticamente 100 % das espécies eletroativas são
oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade é muito maior (10 15
fentomol)
74
Detector Eletroquímico
Aplicações:
Para possibilidade de muitas substâncias serem oxidados
ou reduzidos quando se aplica um potencial elétrico.
75
Detector ELSD – Espalhamento 
evaporativo de luz 
• Detector universal para substâncias não voláteis.
• Baseado na habilidade das partículas causarem espalhamento
(scattering) de fótons, quando atravessam um feixe de radiação
policromática.
• A fase móvel é primeiramente nebulizada e a mistura aerosol
resultante contendo as partículas dos analitos é dirigida a um feixe
de radiação com comprimento de onda previamente selecionado.
• As partículas causam espalhamento da radiação eletromagnética. É
gerado um sinal, que é proporcional à massa presente, e independe
da presença ou ausência de grupos cromóforos, fluoróforos ou
eletroativos.
76
Detector ELSD – Espalhamento 
evaporativo de luz 
▪ Qualquer analito não volátil pode ser detectado.
▪ Pode ser usado acoplado a um espectrômetro de
massa, para fornecer uma análise completa da amostra.
Aplicações:
Lipídeos, ácidos graxos, carboidratos, polímeros, 
esteroides, aminoácidos, aditivos de plásticos, produtos 
farmacêuticos...
77
Detector ELSD – Espalhamento 
evaporativo de luz 
78
Detector CORONA
❖ Superior em desempenho em relação aos outros detectores, exceto
espectrômetro de massas.
❖ O eluente é primeiramente nebulizado com nitrogênio, e as gotas são
secas para remover a fase móvel, produzindo as partículas dos
analitos.
❖ Uma corrente secundária de nitrogênio passa por um sistema de alta
voltagem e é carregado positivamente.
❖ Esta carga é transferida para as partículas do analito, que flui em
sentido oposto.
❖ A carga é transferida para um coletor onde é medida por um
eletrômetro altamente sensível, gerando um sinal que é diretamente
proporcional à quantidade de analito presente.
79
Detector CORONA
❖ O fator de resposta do analito é independente da
estrutura química.
APLICAÇÕES:
• Ideal para uma larga faixa de aplicações de substâncias
não voláteis e semi-voláteis: fármacos, drogas,
carboidratos, lipídios, esteróides, peptídeos, proteínas,
polímeros.
80
Detector CORONA
81
COMPARAÇÃO DE DETECTORES
Note: The table indicates general characteristics. There are exceptions.
Selectivity Sensitivity
Possibility of 
Gradient System
Absorbance
Light-absorbing 
substances
ng Possible
Fluorescence Fluorescent substances pg Possible
Differential 
refractive index
None µg Impossible
Evaporative light 
scattering
Nonvolatile substances µg Possible
Electrical 
conductivity
Ionic substances ng Partially possible
Electrochemical
Oxidizing / reducing 
substances
pg Partially possible
82
Comparação de Detectores
83
Técnicas de preparo de amostras 
acopladas com LC
84
SPE online - LC
85
SP online - LC
86
MODULAÇÃO DA FASE ESTACIONÁRIA EM CROMATOGRAFIA 
LÍQUIDA ATRAVÉS DO ACOPLAMENTO DE COLUNAS
87
MODULAÇÃO DA FASE ESTACIONÁRIA EM 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ATRAVÉS DO 
ACOPLAMENTO DE COLUNAS
88
PROBLEMAS EM 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
89
Entupimento de coluna
Causas
Deposição de partículas sólidas ou cristalização de substâncias na 
fase estacionária
Medidas preventivas
➢ Filtrar as amostras
➢ Verificar se as amostras dissolvem no eluente
➢ Verificar o histórico de pressão na coluna
Ações corretivas
✓ Checar para componentes que podem entupir, além da coluna
✓ Rinsar com solvente apropriado 
✓ Abrir a entrada da coluna e trocar o filtro.
90
Deformações dos Picos
Causa Ação corretiva
Sobrecarga de amostra Reduzir o volume de injeção ou a 
concentração das amostras 
Solvente para a fase móvel 
é inadequado 
Trocar o solvente, utilizando um de menor 
capacidade de eluição
Ruídos Rinsar a coluna 
Influência de efeitos 
secundários na retenção 
Rinsar a coluna 
Trocar a coluna
91
Diminuição do Tempo de Retenção 
Causas
➢ Composição da fase móvel (eluente)
➢ Vazão da fase móvel
➢ Temperatura da coluna
Ações corretivas
✓ Verificar a compatibilidade do analito com a fase móvel 
(eluente)
✓ Se a coluna é identificada como a causa, rinsar ou troca 
a coluna
92
Ruídos na linha base
Causas
➢ Checar se a causa do problema não é a coluna
➢ Depois de remover a coluna, a causa pode ser a
fase móvel, sistema de liberação da fase móvel
(bomba ou degaseificador) ou o próprio detector.
Ações corretivas
• Se a coluna é identificada como a causa, rinsar ou
troca a coluna
• Revisar o controle da temperatura.
93