relatorio 1 bioquimica, proteínas: reações de coloração e precipitação

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INTRODUÇÃO 
OBJETIVOS
A seguinte prática teve como objetivos a caracterização das proteínas presentes em material biológico e a precipitação de proteínas com e sem desnaturação relacionando os resultados observados com a teoria de propriedades gerais, estrutura e isolamento de proteínas.
PARTE EXPERIMENTAL
 Materiais e métodos
- solução de ninhidrina a 0,1% em tampão fosfato pH 7,0 (10 mM)
- solução de proteínas: clara de ovo a 10% v/v em solução salina 0,9%
- solução de glicina 0,1%
- solução de hidróxido de sódio 2,5 M
- solução de sulfato de cobre 1%
- ácido tricloroacético (TCA) a 10% (p/v)
-acetato de chumbo a 5% (p/v)
- álcool etílico absoluto
- clara de ovo “in natura”
- cloreto de sódio 1M
- solução saturada de sulfato de amônio 76,6 g% (p/v)
- 8 tubos de ensaio
- 1 béquer pequeno
- pipeta graduada de 10 mL
- 4 pipetas graduadas de 5 mL
- 4 pipetas graduadas de 2 mL
- 4 pipetas de Pasteur
- bastão de vidro
- bico de bunsen
- pinça de madeira
Procedimento experimental:
Reação de coloração de proteínas 
 Reação da ninhidrina
Os dois tubos de ensaio utilizados neste momento foram numerados como tubo 1 e tubo 2. No tubo 1 fez-se a adição de 2 mL da solução de ninhidrina com a pipeta graduada de 5 mL e, em seguida, 5 gotas da solução de proteína com auxílio de uma segunda pipeta graduada, também de 5 mL. O conteúdo resultante foi aquecido em chama direta no bico de Bunsen até o surgimento de uma coloração azul violeta.
Posteriormente, no tubo 2, fez-se igualmente a adição de 2 mL da solução de ninhidrina e, em seguida, a adição de 5 gotas de glicina com auxílio de uma pipeta de Pasteur, o conteúdo resultante foi também aquecido em chama direta no bico de Bunsen até a observação de uma coloração azul violeta forte. 
 Reação do Biureto
Os três tubos de ensaio utilizados neste momento foram numerados como tubos 3, 4 e 5. No tubo 3, foram adicionados 1 mL da solução de proteínas, com a pipeta graduada de 5 mL mais 5 gotas de NaOH 2,5 M, com uma pipeta de Pasteur e 3 gostas de CuSO4 1%, também com uma pipeta de Pasteur. Observou-se a formação de uma coloração púrpura característica de um teste positivo.
No tubo 2, em substituição à solução de proteína, foi adicionado 1 mL do aminoácido glicina com auxilio da pipeta graduada de 5 mL. Fez-se a adição das 5 gotas de NaOH 2,5 M e das 3 gostas de CuSO4 1%. Não houve formação da coloração púrpura característica neste tubo.
Por fim, no tubo 3, foi feita a adição de 1 mL de água destilada com auxílio da pipeta graduada de 10 mL, bem como das 5 gotas de NaOH 2,5 M e das 3 gostas de CuSO4 1%. Este tubo correspondeu ao branco e foi observada uma coloração azul atribuída à alcalinização do sulfato de cobre.
Reação de precipitação de proteínas
Reações de precipitação com desnaturação 
Precipitação por ação do calor
Em tubo de ensaio, denominado tubo 6, foram adicionados 2 mL da solução de proteína. O mesmo foi levado diretamente à chama do bico de bunsen sendo observada a formação de um coágulo. 
Precipitação por reação com os reagentes para alcalóides
Em um tubo de ensaio, denominado tubo 7, foram adicionados 1 mL da solução de proteína e 1 mL do ácido tricloroacético, este com o auxilio de uma pipeta graduada de 2 mL, sendo observada a formação de um precipitado branco.
Precipitação por reação com sais de metais pesados
Em um tubo de ensaio, denominado tubo 8, foram adicionados 1 mL de solução de proteínas e 1 mL de acetato de chumbo a 5%, este com auxilio de uma pipeta graduada de 2 mL, sendo observada a formação de um precipitado branco em pequena quantidade.
Precipitação por ação de solventes orgânicos 
Em um tubo de ensaio, denominado tubo 9, foram adicionado 1 mL da solução de proteínas e entre 1 a 3 mL de álcool etílico até a observação de um precipitado.
Reações de precipitação sem desnaturação
Efeito da força iônica sobre a solubilidade das proteínas – ovoglobulina
Solubilização (“salting-in”)
No béquer pequeno, foram colocados 3 mL de clara de ovo medidos aproximadamente com uma pipeta de Pasteur. Em seguida foi feita a diluição com uma pequena quantidade de água destilada, agitando com o bastão de vidro. Neste momento foi observada o surgimento de pequenas partículas insolúveis (precipitado). Adicionou-se, gota-á-gota, cloreto de sódio 1M à solução até o desaparecimento deste precipitado (salting-in).
Precipitação (“salting-out”)
2 mL da solução anterior foram transferidos para um tubo de ensaio com auxilio de uma pipeta graduada de 2 mL. Junto a esta quantidade foram adicionados 2 mL de solução saturada de sulfato de amônio. Neste momento observou-se a formação de um precipitado (salting-out). Um volume entre 4 e 6 mL de água foram em seguida adicionados ao tubo de ensaio e o precipitado foi redissolvido. 
RESULTADOS E DISCUSSÕES 
Reação de coloração de proteínas
 Reação da ninhidrina 
Tabela 1: Resultados observados nos experimentos com ninhidrina.
	Tubo 
	Coloração observada 
	1
	Azul violeta 
	2
	Azul violeta forte
A ninhidrina é um reagente muito utilizado na caracterização de aminas primárias desenvolvendo uma coloração característica denominada púrpura de Ruhemann. Por esta propriedade é particularmente empregada na detecção de aminoácidos. A reação dará positiva, ou seja, adquirirá coloração, para grupo α amino de aminoácidos livres, grupos amino terminais de peptídeos e proteínas e grupos ε amino quando uma solução de ninhidrina é aquecida em mistura com uma solução de aminoácido.
O mecanismo da reação é dado a seguir:
Figura q: mecanismo da formação da imina que representa a reação entre a ninhidrina e uma amina primária. Fonte: BRUICE, P. Y. Química Orgânica. Vol. II, 4ª. Ed. Pearson Prentice Hall, São Paulo – SP, 2006. Pg. 160.
A partir das colorações observadas, é possível afirmar que em ambos os tubos as reações deram positivo, indicando a presença dos grupos amino citados anteriormente. A diferença na intensidade da coloração é devido á maior presença desses grupos no tubo 2, uma vez que foi adicionado apenas o aminoácido glicina, cuja estrutura é dada pela figura w
Figura w: estrutura aminoácido glicina. Fonte: https://brainly.com.br/tarefa/7023236.
As cinco gotas de proteínas adicionadas no tubo 1 podem contem misturas de grupos aminos, muitos dos quais não resultam em teste positivo com a ninhidrina, além daqueles que reagem dando a coloração. Por este motivo sua coloração foi menos intensa. 
Reação do biureto
Tabela 2: resultados observados nos experimentos com biureto.
	Tubo
	Coloração observada
	3
	Violeta 
	4
	Incolor
	5
	azul
O teste do biureto é caracterizado pela formação de um complexo do cobre, como átomo metálico central e de dois grupos carbamínicos (-CO-NH2) ligados entre si diretamente ou por meio de um único átomo de carbono ou nitrogênio. Estes grupos estão presentes em peptídeos e proteínas com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação positiva adquire coloração violeta característica, sendo o complexo descrito acima o responsável pela cor. 
Figura e: complexo violeta formado quando proteínas ou peptídeos com mais de 3 aminoácidos são tratados por uma solução de sulfato de cobre em meio alcalino.
Tal embasamento teórico torna possível justificar as colorações observadas em cada tubo. A coloração violeta no tubo 3, onde foi adicionada a solução de proteína, indica presença de proteínas e peptídeos com mais de três resíduos de aminoácidos. Em contrapartida no tubo 4, não foi observada a formação dessa coloração uma vez que no lugar da solução de proteína foi adicionada uma solução de glicina, um único resíduo de aminoácido, impossibilitando a formação do complexo violeta. O tubo 5, como já dito anteriormente, é o branco. A coloração azul nele observada é correspondente à alcalinização do sulfato de cobre e não deve ser confundido ao violeta observado no primeiro tubo. 
Reações de precipitação de proteínas
Reações de precipitação com desnaturação
Tabela 3: resultados observados nas reações de precipitaçãode proteínas com desnaturação.
	Tubo 
	Formação de:
	6
	Coágulo branco
	7
	Precipitado branco
	8
	Precipitado branco em pequena quantidade
	9
	Precipitado branco
Desnaturação é o processo de desdobramento de uma proteína que se dá devido ao rompimento das interações não covalentes que mantém sua estrutura tridimensional, uma vez que essas interações são fracas. Entretanto, o estado desnaturado pode não corresponder ao desdobramento completo da proteína, que pode existir como um conjunto de estados parcialmente dobrados.
Dentre as várias maneiras pelas quais uma proteína pode ser desnaturada o calor é uma delas. O aumento da temperatura causa como conseqüência, o aumento da agitação térmica das moléculas, que por si só já é suficiente para desfazer a estrutura terciária da proteína, desnaturando-a. 
A formação do coágulo no tubo 6, é prova dessa ação desnaturalizante causada pelo calor. A formação do coágulo ocorre porque agora a proteína possui seus grupamentos hidrofóbicos expostos, prejudicando a interação da mesma com a água e assim, a solubilidade é diminuída. 
Outro fator que leva à desnaturação das proteínas é a alteração do pH do meio no qual estão inseridas. Peptídeos e proteínas possuem somente um grupo α-amino e um grupo α-carboxil livres nas extremidades opostas de sua estrutura primária. Estes grupo podem ionizar-se como em aminoácidos livres. Além deles, os grupos R de alguns aminoácidos também podem ionizar-se e contribuir para as propriedades ácido-básicas da molécula. Desse modo, assim como os aminoácidos livres, peptídeos e proteínas possuem um pH isoelétrico característico que pode ser explorado em algumas técnicas de separação e caracterização de proteínas. Em valores de pH muito altos ou muito baixos a proteína não terá todas as suas cargas, ou seja, sua carga liquida é alterada, isso afeta diretamente as interações eletrostáticas que estabilizam sua forma funcional nativa e, então, a proteína é desnaturalizada. 
No tubo 7 a solução de proteína foi adicionada com um reagente para alcalóide; substância ácida capaz de reagir com as proteínas, formando compostos insolúveis, caso estas estejam submetidas a um pH levemente ácido. Deste modo, o reagente para alcalóide, o ácido tricloacético utilizado, funcionou como agente acidificador da solução, tornando-a levemente ácida, e formou com a proteína o tricloroacetato de proteína, composto insolúvel observado no tubo. 
No tubo 8, o pH da solução foi deslocado para o lado alcalino do ponto isolétrico, levando à formação de cargas negativas na proteína e favorecendo a combinação dessas proteínas com metais pesados formando proteinatos insolúveis. O acetato de chumbo em solução formou por dissociação o íon acetato, responsável pela alcalinização do meio, pois como sal de acido fraco, desprotona certos grupos da proteína, e o cátion Pb+, que forma o proteinato mencionado, insolúvel, observado como pequenas partículas brancas no tubo de ensaio.
No tubo 9 as proteínas foram precipitadas pela ação de um solvente orgânico, o álcool etílico. Solventes orgânicos podem precipitar proteínas por diminuir a interação da mesma com a água, uma vez que sua constante dielétrica é menor. 
Em água, as interações proteína-água tendem a predominar comparadas às interações proteína- proteína devido a alta constante dielétrica da mesma. Em um solvente orgânico, tal situação pode ser invertida, levando ao predomínio das interações proteína-proteína e a conseqüente precipitação. Esta ocorre sem desnaturação caso o solvente encontre-se em temperatura igual ou inferior a zero graus Celsius. Quando em temperaturas superiores a isso, ocorre a desnaturação por ocorrer o rompimento de interações mais fortes, como pontes de hidrogênio, além do rompimento de interações hidrofóbicas que mantêm o núcleo estável das proteínas globulares.
O álcool etílico adicionado estava em temperatura superior a zero graus Celsius, assim, o precipitado observado foi acompanhado por desnaturação.
Reações de precipitação sem desnaturação
Efeito da força iônica sobre a solubilidade das proteínas – ovoglobulina
“salting-in” é o fenômeno caracterizado pelo aumento da solubilidade de muitas proteínas causado por sais, devido à formação de interações das proteínas com estes sais e a conseqüente diminuição das interações proteína-proteína. 
Por outro lado, “salting-out” é o fenômeno que leva à precipitação das proteínas em razão da alta força iônica do meio. A alta concentração de sais muito solúveis em uma solução de proteínas leva à remoção da água de hidratação das moléculas, aumentando as interações proteína-proteína. 
Num primeiro momento, foi observada a formação de pequenos precipitados no béquer com a diluição da clara de ovo e agitação com o bastão. Precipitado que foi redissolvido tão logo fez-se a adição da solução de cloreto de sódio, característico do fenômeno salting-in. A adição do sal foi feita gota-á-gota para evitar neste momento uma alta concentração de sal levando ao salting-out. 
A adição da solução de sulfato de amônio atua restabelecendo a força iônica anterior e a proteína reprecipita. As proteínas aqui tratadas não sofreram o processo de desnaturação. 
CONCLUSÃO
As observações feitas durante a prática foram concordantes com os objetivos aos quais se queria atingir. Os primeiros procedimentos, referentes às reações com a ninhidrina e o biureto, permitiram a caracterização das proteínas principalmente com base em suas propriedades químicas e físicas, tais como a presença de ligações peptídicas, a presença de grupos α-amino e ε-amino. 
As reações de precipitação, com ou sem desnaturação, permitiram a constatação da influencia exercida pelos fatores aqui tratados: calor, pH, solventes orgânicos e a força iônica, indo de encontro às informações contidas na literatura. 
BIBLIOGRAFIA 
David L. Nelson, Michael M. Cox, PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER, Quinta edição. Artmed 2011.
Mary K. Campbell, BIOQUÍMICA, Terceira edição. Artmed 2000.