PRÁTICA DE CRESCIMENTO MICROBIANO (1)

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PRÁTICA DE CRESCIMENTO MICROBIANO
Alunos: Daniela Torres, Heber Lopes, Giulia Rocha e Marcos Vinicius.
Turma: Bio 261.
Data: 16/05/2018.
Objetivos
Construir uma curva padrão de crescimento celular a partir de uma amostra de Saccharomyces cerevisiae e determinar sua taxa específica de crescimento assim como seu tempo de geração.
Materiais e Métodos
- Erlenmeyer de 500,0 mL;
- Rolhas de algodão cardado;
- Tubos de ensaio com tampa de rosca;
- Pesa filtro;
- Pipetas estéreis de 1,0 mL e 2,0 mL;
- Shaker rotatório;
- Espectrofotômetro (570nm);
- Fermento de panificação Saccharomyces cerevisiae;
- Balança analítica;
- Espátula;
- Bico de Bunsen.
 Um meio contendo sacarose (20,0 g/L), sulfato de amônio (5,0 g/L), fosfato de potássio monobásico (3,5 g/L), sulfato de magnésio heptahidratado (1,0 g/L) e extrato de levedura (1,0 g/L) foi previamente preparado pelos monitores do laboratório em um Erlenmeyer para que fosse feita a curva de crescimento celular. Foi preparado 100,0 mL de meio, onde o seu pH foi ajustado para 5,0 e foi esterilizado em autoclave à 1 atm por 20 minutos.
 Em uma balança analítica, pesou-se 0,2 g de Saccharomyces cerevisiae com o auxílio de um pesa filtro e uma espátula. Em seguida, o bico de Bunsen foi ligado para que fosse possível trabalhar em uma zona de segurança. Após isso o fermento de panificação foi transferido para o Erlenmeyer e dissolvido por agitação.
 Após completa dissolução, uma alíquota de 1,0 mL da suspensão de células foi retirada com o auxílio de uma pipeta de 1,0 mL e transferida para um tubo de ensaio. Posteriormente adicionou-se 3,0 mL de água destilada com uma pipeta de 2,0mL para a realização da diluição 1:4 (tempo 0) (tabela 1 e 2). O frasco de Erlenmeyer com a suspensão celular foi tampado com o auxílio de uma rolha de algodão cardado e levado para o shaker rotatório. A cada hora, contada a partir da retirada da primeira alíquota (tempo 0), foi retirado 1,0 mL da suspensão de células e feita a diluição necessária (tabela 1 e 2).
Tabela 1: Diluições realizadas.
	Diluição
	Vol de amostra (mL)
	Vol de água (mL)
	1:4
	1,0
	3,0
	1:10
	1,0
	9,0
	1:20
	1,0
	19,0
Tabela 2: Relação entre os tempos e as diluições realizadas para cada um deles
	Tempo
	Hora
	Diluição
	0
	15:40
	1:4
	1
	16:42
	1:4
	2
	17:40
	1:10
	3
	18:40
	1:10
	4
	19:40
	1:10
	5
	20:40
	1:10
	6
	21:40
	1:20
	7
	08:50
	1:20
	8
	09:50
	1:20
Resultados e Discussões
 Para a confecção da curva de crescimento microbiano, foi necessário recuperar alguns dados relacionados com a prática de quantificação celular a partir de massa seca e turbidimetria.
 
Massa seca:
Massa inicial do pesa filtro: 58,823 gramas.
Massa final do pesa filtro + amostra: 59,274 gramas.
Massa seca: 59,274 – 58,823 = 0,451 gramas.
0,451 gramas ---- 10 mL x = 4,51% m/v de células
 X gramas ---- 100 mL 
 
Turbidimetria:
Tabela 3: Valores de concentração e absorbância após leitura em espectrofotômetro.
	Diluição
	Fator de diluição
	Concentração (g/100ml)
	Absorbância
	0,5:500
	1000
	0,00451
	0,178
	0,5:250
	500
	0,00902
	0,361
	0,6:200
	333
	0,0135
	0,503
	1,0:250
	250
	0,0180
	0,657
	2,5:500
	200
	0,0226
	0,777
 
 Figura 1: curva padrão correlacionando absorbância x concentração das diluições.
 
	
 A partir da equação da reta apresentada na figura 1 acima e dos resultados de absorbância obtidos durante a prática, pode-se calcular as respectivas concentrações microbianas e então, confeccionar uma nova curva de crescimento microbiano, como demostrado abaixo:
Tabela 4: Valores obtidos após os procedimentos.
	Tempo (hora)
	Abs
	F.D
	Concentração X (g/100mL)
	Ln [x]*
	Ln X/X0
	0
	0,627
	4
	0,070049
	-2,65856
	0
	1
	0,691
	4
	0,077789
	-2,55376
	2,57074E-6
	2
	0,400
	10
	0,106488
	-2,23972
	0,314036781
	3
	0,586
	10
	0,162726
	-1,81569
	0,738067823
	4
	0,759
	10
	0,215033
	-1,53696
	1,016791269
	5
	0,710
	10
	0,200218
	-1,60835
	0,94540521
	6
	0,227
	20
	0,108363
	-2,22227
	0,331487
	7
	0,520
	20
	0,285542
	-1,25337
	1,300389
	8
	0,586
	20
	0,325452
	-1,12254
	1,4306
Equação da reta: y = 33,074x + 0,0478
Tempo 0: 0,627 = 33,074x + 0,0478 Tempo 1: 0,691 = 33,074x + 0,0478
 X = 0,01751225 (x4) X = 0,0194473 (x4)
 X = 0,070049 % m/v X = 0,077789 % m/v
Tempo 2: 0,400 = 33,074x + 0,0478 Tempo 3: 0,586 = 33,074x + 0,0478
 X = 0,010648848 (x10) X = 0,0162726 (x10)
 X = 0,1065 % m/v X = 0,1627 % m/v
Tempo 4: 0,759 = 33,074x + 0,0478 Tempo 5: 0,710 = 33,074x + 0,0478
 X = 0,0215033 (x10) X = 0,02002177 (x10)
 X = 0,2150 % m/v X = 0,2002 % m/v
Tempo 6: 0,227 = 33,074x + 0,0478 Tempo 7: 0,520 = 33,074x + 0,0478
 X = 0,00541815 (x20) X = 0,01427708 (x20)
 X = 0,108363 % m/v X = 0,285542 % m/v
Tempo 8: 0,586 = 33,074x + 0,0478
 X = 0,0162726 (x20)
 X = 0,325452 % m/v
*Os valores de Ln [x] e Ln X/X0 foram encontrados a partir de fórmula pronta no excel.
Figura 2: Gráfico que correlaciona concentração de Saccharomyces cerevisiae x tempo
 Após o preparo do gráfico acima, pode-se notar que houve algum tipo de problema durante a leitura das últimas amostras em espectrofotômetro, uma vez que os dois pontos finais não acompanham os demais. Sendo assim, para a melhor observação das fases do crescimento celular, foi necessário excluir os pontos mencionados.
Exponencial
Figura 3: Gráfico concentração x tempo após exclusão dos dois pontos for a da curva
 A partir do gráfico presente na figura 3, percebe-se que a fase exponencial encontra-se entre os tempos (hora) 1, 2, 3 e 4. Sendo assim, foi necessário encontrar os valores de logaritmo neceperiano nesses tempos para então determinar o valor de μ. Contudo, após os cálculos o grupo notou que os resultados deram negativo, logo foi necessário realizar uma nova operação matemática utilizando a fórmula Ln X/X0 para enfim encontrar o valor de μ.
 Tabela 5: Valores de Ln X/X0 relacionados com a fase exponencial.
	Tempo (hora)
	Ln [x]*
	Ln X/X0
	1
	-2,55376
	0
	2
	-2,23972
	0,314036781
	3
	-1,81569
	0,738067823
	4
	-1,53696
	1,016791269