Microbiologia - Resumo I - Engenharia genética

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Biotecnologia 
Resumo I - Microbiologia
Tortora
Introdução á biotecnologia
Biotecnologia é o uso de microrganismos, células ou componentes celulares para fazer um produto.
 Tecnologia do DNA recombinante
Os organismos de parentesco próximo podem trocar genes por recombinação natural.
Os genes podem ser transferidos entre espécies não-relacionadas por meio de manipulação de laboratório, em um processo chamado de engenharia genética. 
O DNA recombinante é DNA que foi artificialmente manipulado para combinar genes de duas origens diferentes. 
 Visão geral da metodologia do DNA recombinante
Um gene desejado é inserido em um vetor de DNA, como um plasmídeo ou genoma viral.
O vetor insere o DNA em uma nova célula, que se multiplica para formar um clone.
Grandes quantidades do gene ou do seu produto podem ser obtidas a partir do clone.
Ferramentas da biotecnologia
 Seleção
Micróbios com características desejáveis são selecionados, por meio de seleção artificial, para serem cultivados.
 Mutação
Mutagênicos são usados para causar mutações que possam resultar em um microrganismo com características desejáveis.
A mutagênese sítio-dirigida é usada para mudar um códon específico em um gene.
 Enzimas de restrição
Enzimas de restrição já estão disponíveis em kits pré-embalados para muitas técnicas de engenharia genética.
Uma enzima de restrição reconhece e cliva apenas uma determinada sequência nucleotídica no DNA.
Algumas enzimas de restrição produzem extremidades coesivas, que são pequenos segmentos de DNA de fita simples nas extremidades de fragmentos de DNA.
Fragmentos de DNA produzidos pela mesma enzima de restrição vão se unir espontaneamente por pareamento de bases. A DNA ligase pode ligar covalentemente os esqueletos do DNA. 
 Vetores
Os vetores bi-funcionais (shuttle vectores) são plasmídeos que podem existir em várias espécies diferentes. 
Um plasmídeo contendo um novo gene pode ser inserido em uma célula por transformação (absorção de DNA livre do meio).
Um vírus contendo um novo gene pode inserir aquele gene em uma célula (transdução)
 Reação em cadeia da polimerase
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é utilizada para produzir enzimaticamente múltiplas cópias de um fragmento de DNA desejado. 
A PCR pode ser utilizada para aumentar a quantidade de DNA em amostras até níveis detectáveis. Isso pode permitir o sequenciamento de genes, o diagnóstico de doenças genéticas ou a detecção de vírus. 
 
Técnicas de engenharia genética
 Introdução de DNA exógeno nas células
As células podem captar DNA livre por transformação. Os tratamentos químicos são utilizados para tornar células que não são naturalmente competentes para a absorção de DNA.
Os poros produzidos em protoplastos e em células animais por aplicação de uma corrente elétrica no processo de eletroporação podem permitir a entrada de novos fragmentos de DNA.
A fusão de protoplastos é a união de células que tiveram suas paredes celulares removidas. 
O DNA exógeno pode ser introduzido em células vegetais injetando partículas cobertas com DNA para o interior das células.
O DNA exógeno pode ser injetado em células animais com o auxílio de uma micropipeta de vidro. 
 Obtendo DNA
As bibliotecas de genes podem ser produzidas a partir da clivagem de todo um genoma com enzimas de restrição e da inserção dos fragmentos em plasmídeos bacterianos ou fagos (vírus infectantes de bactérias)
O cDNA, produzido a partir de mRNA por transcrição reversa, pode ser clonado em bibliotecas de genes.
O DNA sintético pode ser produzido in vitro por máquinas de síntese de DNA.
 Selecionando um clone
Os marcadores de resistência a antibióticos em vetores plasmideais são utilizados para identificar, por seleção direta, células contendo o vetor modificado geneticamente.
Na seleção branca-azul, o vetor contém os genes ampR e beta-galactosidase. 
O gene desejado é inserido em um sítio no gene da beta-galactosidase, tornando o mesmo inativo (bactéria perde a capacidade de metabolismo de galactose, ganhando o gene de interesse).
Os clones contendo o vetor recombinante serão resistentes á ampicilina e incapazes de hidrolisar X-gal (formando colônias brancas). Os clones contendo o vetor sem o novo gene serão azuis. Clones sem o vetor não formarão colônias, sendo mortos pela ampicilina. 
Os clones contendo DNA exógeno podem ser testados para identificação daqueles expressando o produto do gene desejado. 
Um pequeno fragmento de DNA marcado, chamado de sonda de DNA (a qual normalmente contém partículas radioativas ou fluorescentes), pode ser utilizado na identificação de clones portadores do gene desejado.
 Fazendo um produto gênico
E.coli é utilizada para produzir proteínas pela engenharia genética porque ela é facilmente multiplicada em cultura e a sua genômica é bem conhecida.
Devem ser feitos esforços para assegurar que a endotoxina da E.coli não contamine um produto destinado ao uso humano.
Para recuperar o produto, E.coli deve ser lisado ou o gene deve estar ligado a outro que produza uma proteína secretada naturalmente. 
As leveduras podem ser modificadas geneticamente e podem, em geral, secretar de forma contínua o produto gênico.
As células de mamíferos podem ser modificadas geneticamente para produzir proteínas como hormônios para uso médico.
As células vegetais podem ser modificadas geneticamente para produzir plantas como novas propriedades. 
Aplicações da engenharia genética
O DNA clonado é utilizado na obtenção de produtos, no seu próprio estudo e na alteração do fenótipo de um organismo.
 Aplicações terapêutias
Os genes sintéticos ligados ao gene da beta-galactosidase (lacZ) em um vetor plasmidial foram inseridas na E.coli, fazendo com que a bactéria produzisse e secretasse os dois polipeptídeos utilizados na produção da insulina humana.
As células podem ser modificadas por engenharia genética de modo a produzirem uma proteína de superfície de um patógeno que pode ser utilizada como uma vacina de subunidade (contendo somente o componente proteico que vai fazer a sensibilização do sistema imunológico, sem material genético, e sem risco de infecção)
Os vírus animais podem ser modificados por engenharia genética para carregarem um gene que codifica uma proteína de superfície de um patógeno. Quando o vírus é utilizado como uma vacina, o hospedeiro desenvolve resposta imune contra o patógeno.
A terapia gênica pode ser utilizada na cura de doenças genéticas pela substituição do gene defectivo ou ausente. 
As técnicas de engenharia genética foram utilizadas para mapear o genoma humano pelo Projeto Genoma Humano.
Isso fornecerá ferramentas para diagnóstico e, possivelmente, viabilizará o reparo de doenças genéticas.
 Aplicações científicas
As técnicas de DNA recombinante podem ser utilizadas para aumentar o conhecimento disponível a respeito do DNA, para fingerprinting genético e para terapia gênica.
As máquinas de sequenciamento de DNA são utilizadas para determinar a sequência de bases nucletídicas de fragmentos de restrição no sequenciamento aleatório por shotgun.
Bioinformática é o uso de aplicações computadorizadas para estudar dados genéricos; proteômica é o estudo das proteínas da célula.
O Souther blotting é utilizado em DNA fingerprinting para identificar patógenos bacterianos ou virais. 
As sondas de DNA podem ser utilizadas para identificar rapidamente um patógeno em um tecido corporal ou em alimentos.
 Aplicações agrícolas
As células das plantas com características desejáveis podem ser clonadas de modo a produzirem muitas células idênticas. Essas células podem então ser utilizadas na produção de plantas completas, a partir das quais podem ser obtidas sementes. 
As células vegetais podem ser modificadas geneticamente utilizando o plasmídeo Ti como vetor. Os genes T produtoresde tumor são substituídos pelos genes desejados e o DNA recombinante é inserido em Agrobacterium. A bactéria modifica naturalmente suas plantas hospedarias.
Os genes para resistência ao glifosato, toxina Bt e supressão da pectinase foram inseridos em lavouras através da engenharia genética.
O Rhizobium foi modificado por engenharia genética para ter uma maior capacidade de fixação de nitrogênio.
Pseudomonas foi modificada por engenharia genética para produzir a toxina de Bacillus thuringiensis contra insetos.
O hormônio de crescimento bovino está sendo produzido em E.coli
Questões de segurança e ética na engenharia genética
Para evitar a liberação acidental de microrganismos modificados por engenharia genética são utilizados rígidos padrões de segurança.
Alguns micróbios utilizados em engenharia genética foram alterados de modo que eles são incapazes de sobreviver fora do ambiente de laboratório.
Os microrganismos destinados á utilização no meio ambiente podem ser modificados por engenharia genética de modo a conterem genes de suicídio. Assim, eles não persistem no meio ambiente.
A tecnologia genética suscita questões éticas, como: empregadores e companhias seguradoras podem ter acesso aos registros genéticos de uma pessoa? Será que algumas pessoas se tornarão alvos para reprodução ou esterilização? O aconselhamento genético estará disponível para todos?
As culturas de alimentos alterados por engenharia genética devem ser seguras para consumo e para serem liberadas no meio ambiente.