Teste de Endotoxina em Produtos Farmacêuticos

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Teste de endotoxina em 	 	produtos farmacêuticos
Controle de Qualidade Microbiológico
 	 
	 Sarah Emidio Fonseca 13/0133558
	BRASÍLIA 
MAIO DE 2018
			Introdução 
Endotoxina: São complexos de alto peso molecular associados à membrana externa de bactérias Gram - .
PINTO et all.,2015 
			Introdução 
Pirogênio: Substância orgânica proveniente de contaminação de microorganismo responsável pelas reações febris que ocorrem no paciente após injeção. 
Proveniente de bactérias: Gram + ou Gram – 
Proveniente de fungos, vírus
		 Introdução 
 Soro X Vacina
São substâncias que contém anticorpos prontos para combater uma doença, toxinas ou venenos. 
Curativo
Contêm antígenos inativados ou atenuados que estimulam o corpo a produzir uma resposta imune específica, de acordo com o agente invasor. 
Preventivo
http://www.unimed.coop.br
Analisados pelo INCQS
			Introdução
		 Ensaios de Endotoxina e pirogênio 
Ensaio in vivo : RPT
Ensaio in vitro : 
LAL ~ só detecta pirogênio endotoxina
MAT ~Monocyte Activation Test 
FE 2.6.30/2010 ( 7ªed.)
PINTO et all.,2015 
		 Introdução
	 MAT- Teste de ativação de monócito
Princípio
Detectar ou quantificar possíveis contaminantes presentes na amostra, que quando em contato com monócitos do sangue humano, induzem a liberação de citocinas (principalmente IL-1β, IL-6 e TNF alfa), que têm um papel na patogênese da febre . 
Amostras de sangue humano fresco ou criopreservado, de células monucleares de sangue periférico ou cultura de linhagem celular monocítica. 
FE 2.6.30/2010 ( 7ªed.)
LOPES,2014
		 Objetivo
Conduzir um estudo comparativo entre o RPT e o MAT para lotes de soros hiperimunes analisados durante a rotina do laboratório de controle de qualidade. 
			Metodologia
		 Amostras
43 lotes de soro de amostras testadas na rotina
18 amostras que foram usadas no estudo 
25 NP randomicamente escolhidas para RPT
Analisados Soros dos fabricantes A e B:
ABS, ABLS, ACS, ATS, AELS AES e ARS
MAT testado em todos os lotes testados pelo RTP. 
Parâmetros medidos :
Sensibilidade
 Especificidade
 Precisão
 Falsos (+) e Falsos (-)
NP = Não pirogênica; ABS: soro antibootrópico; ABLS: antibootropico laquesis; ACS: soro anticrotálico ( cascavel), ATS: soro antitetânico; AELS: soro anti elapídico ( serpentes corais); AES: anti escorpionico; ARS: soro anti rábico. 
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			Metodologia
 		Teste de pirogênio in vivo
Coelhos machos saudáveis raça Nova Zelândia, pesando 
≥ 1,5kg
Mantidos em gaiolas individuais em área climatizada 20±2ºC com 50-70% UR
Injeção da amostra de soro(1mL/kg/PC) na orelha marginal em 3 coelhos. 
Se 1 aumentasse 0,5ºC= repete teste c/ + 5 coelhos. 
Registro da Tº no reto do animal, por 3h. 
Se nenhum apresentasse aumento de 
≥ 0,5ºC, a amostra foi NP.
Se não + que 3 dos 8 apresentarem aumento individual de tºe a soma não for maior que 3,3ºC, a amostra é NP. 
		 Metodologia
		MAT- Teste de ativação de monócitos
Estímulo Imunológico
Solução estoque padrão de endotoxina LPS de E. coli
Limite de endotoxina 5 EU/mL
Método A [ ] endotoxina lida em curva padrão (0,125 – 5 EU/mL)
		 B	 Considerado que 5 UE/mL é o controle positivo para endotoxina
Determinação da diluição máxima
Determinação do limite de detecção
Para soro ABS
Valor: 
ClC = 2,9 EU/mL
Determinado usando a curva padrão de endotoxina
Valor : 
Usamos unidades de equivalentes endotoxinas
(EEU) como valores para a concentração de contaminantes, conforme lida
endotoxina dose-resposta varia de 0,125 a 5 UE / mL
que é o limite
da concentração de LPS tomada como a menor dose que produz febre
em coelhos e humanos (Hochstein et al., 1990).
Este limite foi usado desde
podemos injetar até 5 EU / kg / 10 mL para cada animal. No caso do HS, o
dose animal é 1mL / kg, portanto, levando em conta o limiar humano em 5
EU / kg
(método A) ou estimado por comparação com as respostas às endotoxinas
solução (método B)
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Teste de interferente 
Testado em 3 lotes ABS apirogênicos. 
Diluição com 50-200% de recuperação foram consideradas livres de interferentes. 1º diluição foi definida como a diluição mín. validada.
Resultado expresso em Média ± desvio padrão das 4 replicatas de cada lote. 
Amostras de sangue
			Metodologia
	MAT- Teste de ativação de monócitos
4 doadores saudáveis
Tampão fosfato 
+
 DMSO 20% 
+
 amostra sangue fresco
1:2
Sangue preservado em tubos
Pré resfriado
 e congelado
 – 80ºC
Sangue diluído em solução diluída enriquecida com 0,5 EU/mL e paralelamente com diluição não enriquecida
HARTUNG, 2015
Incubação de sangue total
			Metodologia
	MAT- Teste de ativação de monócitos
 c
37ºC/16h
-20ºC
Medição de IL-1β e IL-6
Dados: média±erro padrão da média das 4 replicatas
			Resultados
			Resultados
			Resultados
			Resultados
VP
VP
FN
FN
VN
VN
FP
FP
			Resultados
			Discussão 
Uso de animais em controle de qualidade de soros.
Reforço do princípio 3Rs
 
 Apesar do RTP ser um teste quase indolor , necessário diminuir seu uso.
LAL ainda não pode ser um substituto do RPT porque não é capaz de detectar outros pirogênios a não ser endotoxina. 
Invalidação do teste LAL para alguns produtos biológicos,devido problemas na validação (interferentes) como o teste de endotoxina de produto final para HSA (Hochstein et al., 1979; Jürgens et al., 2002; Perdomo-Morales et al., 2011).
MAT como teste + preciso do que LAL e RPT ~ baseado na patogênese da febre humana e detecta NEP e LPS.
Replacement 
Reduction 
Refinament 
Quando alternativas validadas existirem
			Conclusão
MAT apresentou os mesmos resultados que o RPT quando o RPT foi definitivamente negativo ou positivo.
Não houve ocorrência de falsos negativos com MAT. 
Esses achados mostram que o MAT é mais sensível que o RPT e pode detectar pirogênio mais precocemente do que o RPT. 
Falsos positivos não ocorreriam com MAT, porque em coelhos mostrou-se que poderia haver falsos positivos, levando a uma repetição dos testes.
Porém, devido à variação biológica em coelhos, os falso positivos também poderiam ocorrer. 
Aplicabilidade do MAT à HS, que não era objeto de sua validação até 2010. 
INCQS ~usa aproximadamente 600 coelhos/ano em testes rotina de pirogênio. 
Os soros representam 90% do total de amostras testadas.
MAT pode substituir o uso de coelhos em testes de pirogênios de soros hiperimunes, e outros derivados de sangue e proteínas terapêuticas fornecendo informações para este produto específico que anteriormente não existiam na literatura.
			Conclusão
	Referências Bibliográficas
CALDEIRA, C. et al. Applicability of the Monocyte Activation Test (MAT) for hyperimmune sera in the routine of the quality control laboratory : Comparison with the Rabbit Pyrogen Test ( RPT ). Toxicology in Vitro, v. 32, p. 70–75, 2016. 
CRISTINA, E. et al. Métodos alternativos ao uso de animais para a detecção de pirogênio : oportunidades e desafios no controle da qualidade de produtos biológicos. Archives of Veterinary Science, p. 71–81, 2015. 
CRUZ, M. et al. Aplicabilidade do Teste de Ativação de Monócitos ( MAT ) no Brasil : importância da sua utilização como teste para detecção de pirogênios no controle da qualidade de produtos injetáveis Applicability of the Monocyte Activation Test (MAT ) in Brazil : the. Visa em Debate: sociedade, ciência e tecnologia, v. 3, n. 3, p. 41–46, 2015. 
Disponível em: http://www.unimed.coop.br, Acesso em 20 de maio de 2018.
Farmacopeia Brasileira. v.2, 5ªedição, 2010. 
HARTUNG, T. The Human Whole Blood Pyrogen Test – Lessons Learned in Twenty Years. v. 32, n. 2, p. 79–100, 2015. 
ID, E. P.; DIRECTORATE, E. European Pharmacopoeia 8th edition. 
PINTO, T. J.A., KANEKO,T. M., PINTO,A.F.T. Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo, Ateneu 4º edição, 2015.