apostilaTécnicas Especiais em Análises Clínicas

Prévia do material em texto

1.1.EVOLUÇÃO DA PROFISSÃO
No cenário dos anos 50/60 
quando a expansão do mercado de 
medicamentos industrializados, sob o 
domínio de grandes laboratórios 
estrangeiros, e impulsionada pela 
terapêutica científica, torna 
inexpressiva a produção das 
farmácias. Nesse contexto, consolida-
se a descaracterização do 
Farmacêutico como profissional do medicamento e o deslocamento do eixo de 
atuação profissional para o laboratório de análises clínicas, tendências esboçadas 
desde os anos trinta.
Uma retrospectiva evidência que nos anos setenta, a farmácia já tinha 
assumido as feições típicas de drogaria, um estabelecimento essencialmente de 
comércio de produtos industrializados. A manipulação de fórmulas magistrais, 
oficinais ou farmacopéicas era uma atividade residual limitada praticamente a 
preparações de uso dermatológico. Foi superada pelos produtos industrializados ou 
especialidades farmacêuticas, de base natural ou sintética, plenamente incorporados 
ao arsenal terapêutico. A dispensação, descaracterizada como prática profissional, 
transformou-se em um mero ato comercial de “ Repasse de Medicamentos”.
O espaço de atuação do farmacêutico, nessa farmácia, ficou reduzido. 
Restringindo-se a "Responsabilidade Técnica”, função privativa da profissão, 
assumida como responsabilidade formal, não real, emprestando o farmacêutico o 
seu nome, para satisfação da exigência legal ". Dessa maneira, os profissionais se 
afastaram do cotidiano da farmácia, distanciando-se da realização de atividades que 
envolvem o saber sobre medicamentos e a relação direta com os usuários e 
prescritores. Afastando-se cada vez mais, do trabalho através do qual a profissão 
farmacêutica construiu sua identidade social.
O desenvolvimento industrial, da maneira em que se deu no país, com 
elevado índice de dependência externa, não se traduziu em uma maior oferta de 
empregos para profissão. Implicou ao contrário, a redução de postos de trabalhos 
1
1. HISTÓRICO DAS ANÁLISES CLÍNICAS E IMPORTÂNCIA DO TÉCNICO EM 
BIODIAGNÓSTICO NESTE CONTEXO
 
Fig 1
nos pequenos e grandes laboratórios farmacêuticos que desapareceram ou foram 
absorvidos no bojo da internacionalização do setor, sem correspondente ampliação 
do mercado na grande indústria. Concentrados no eixo Rio de Janeiro - São Paulo, 
os laboratórios aqui instalados no pós-guerra se limitaram a transformar matéria 
prima, a embalar e a promover comercialmente seus produtos no mercado interno, 
absorvendo um contingente restrito de farmacêuticos.
As atividades farmacêuticas no setor público estavam relacionadas 
basicamente à produção de medicamentos, sobretudo nos laboratórios militares. A 
época não se reivindicava politicamente a atuação estatal no campo da vigilância 
sanitária, para que fossem estabelecidos parâmetros de avaliação da eficácia, 
segurança e qualidade dos medicamentos lançados no mercado. A utilização de 
medicamentos não era colocada ainda no âmbito do Estado, como uma questão de 
Saúde Pública. Entretanto, os riscos e as conseqüências dessa utilização, 
evidenciadas no caso da talidomida, tinham levado países desenvolvidos a adotar, já 
naquela década, critérios técnico-científicos para autorizar a comercialização de 
novos produtos, e a instituir parâmetros de seleção e de controle de qualidade de 
medicamentos. Esse caminho, só começou a ser trilhado no Brasil, em meados dos 
anos setenta, quando oficialmente foram estabelecidos os critérios para registro de 
medicamentos, e exigidos o controle de qualidade e a responsabilidade técnica em 
indústrias; ficando a partir dessa época exigida a participação do farmacêutico 
nessas atividades.
A conjuntura desfavorável para o trabalho profissional na área de 
medicamento seria contrabalançada pelo espaço aberto na área das análises 
clínicas, prática que se desenvolveu na profissão farmacêutica, no interior da antiga 
farmácia, a partir da pesquisa de albumina e glicose em amostras de urina. Exercida 
em caráter complementar, essa prática foi incorporada ao âmbito legal da profissão 
farmacêutica em 1931, e se tornou, no pós-guerra, a atividade principal do 
farmacêutico; mais precisamente, do farmacêutico-bioquímico que se realizava nos 
então chamados de "Laboratórios de Saúde Pública". Eram as Análises Clínicas, no 
final dos anos setenta, um mercado em expansão no setor privado, estimulado pela 
política de saúde adotada pelo regime militar. Especialmente, após a unificação da 
previdência Social em 1967, quando o então Instituto Nacional de Assistência 
Médica da Previdência Social - INAMPS, via convênios ou credenciamentos, passa 
a utilizar os serviços da rede privada para realização de exames laboratoriais, como 
forma de interiorizá-los e de atendê-los à clientela previdenciária.
2
As mudanças nos rumos da profissão repercutiram no plano acadêmico. 
Alterações introduzidas nos cursos de farmácia, especialmente no pós-guerra, 
procuram adaptá-los a nossa realidade.
Nos anos 50, várias escolas já haviam incorporado o ensino das análises 
clínicas e introduzido, em menor escala, conteúdos relativos a tecnologia industrial 
de medicamentos e de alimentos, aprofundando assim o processo de diversificação 
do ensino farmacêutico, esboçado desde os anos trinta. Essa diversificação, dirigida 
predominantemente para as análises clínicas, se generalizou com a edição, em 
1963, do primeiro currículo mínimo. Além de estabelecer a formação do 
farmacêutico como uma das especialidades do curso, esse currículo formalizou no 
âmbito acadêmico a denominação Farmacêutico-Bioquímico, para designar a 
formação, nas outras especialidades instituídas: Química terapêutica, Indústria 
Farmacêutica e de Alimentos; Laboratórios de Saúde Públicas e de Controle de 
Qualidade de Medicamentos e de Alimentos.
Os cursos passam, então, a enfatizar e a promover o desenvolvimento do 
ensino das análises clínicas e tendem a tratar a temática do medicamento na 
atenção à saúde como uma área de interesse "menor", periférica, tendência que o 
modelo adotado em 1970, pelas próprias condições da época de sua formação.
O modelo adotado em 1970, visto como projeto educacional pensado e 
implantado nos marcos políticos-ideológicos do regime militar, em sua fase mais 
repressiva, foi presidido por uma concepção tecnicista da educação superior que, 
dissociando o técnico do cidadão, privilegiando a formação do primeiro.
No caso da educação farmacêutica, essa visão procurou reduzi-la à sua 
dimensão estritamente técnica, da tecnologia como um fim em si mesma e não a 
serviço da saúde, conduzindo ao obscurecimento da dimensão humanista e social 
dessa educação. E, por esse caminho, acabaria por distanciá-la da realidade social 
e política do país.
A criação do Curso de Farmácia, devido aos elevados custos para 
instalação de laboratórios, não foi tarefa fácil. Credita-se o êxito ao idealismo de 
jovens farmacêuticos egressos de universidades brasileiras, com a visão de fundar 
um curso universitário para profissionais na área do medicamento.
1.2.O TÉCNICO EM BIODIAGNÓSTICO NO TRABALHO COM O FARMACÊUTICO-
BIOQUÍMICO
3
A crescente demanda das ações de saúde nos últimos anos tem apontado 
portanto para a necessidade de uma profissionalização dinâmica e eficiente, com 
difusão de tecnologias que assegurem a atualização e a prestação de serviços de 
qualidade. 
A área Biodiagnóstico tem como fim responder primordialmente pela 
organização do processo de trabalho em Patologia Clínica, com ações voltadas para 
o apoio ao diagnóstico, coleta e manipulação de amostras biológicas, execução de 
exames laboratoriais, operação de equipamentos ebiossegurança, diretamente 
ligados à educação para saúde e para o auto-cuidado, proteção, prevenção, 
promoção da saúde e segurança no trabalho, assim como, recuperação, 
reabilitação, gestão em saúde e organização do processo produtivo. 
Inserida nesse contexto e para atender às novas exigências da 
contemporaneidade no setor de saúde, projetou-se o curso de Técnico em Patologia 
Clínica ou Biodiagnóstico objetivando um perfil profissional de conclusão que 
propicie aos educandos uma aproximação dos conhecimentos científicos e 
tecnológicos intrínsecos ao mercado de trabalho. Com uma educação profissional 
voltada para aquilo que é necessário aprender na atualidade, visa uma mobilização 
e adaptação profissional, decorrentes de conhecimentos cujo foco de trabalho 
centra-se em aprendizagens significativas daquilo que é necessário aprender na 
modernidade. Com um currículo que passa a contemplar competências gerais da 
Área Profissional de Saúde e competências específicas do Técnico em Patologia 
Clínica, prevê situações que estimulam o aluno a articular conhecimentos, 
habilidades e valores, privilegiando ações educativas contextualizadas, capazes de 
desenvolver competências sintonizadas com novas tecnologias, trabalho em equipe 
e autonomia, para o enfrentamento das adversidades inerentes ao mercado de 
trabalho, com flexibilidade e originalidade. 
A operacionalização dessa proposta exige uma mobilização da instituição 
de ensino envolvendo toda a comunidade escolar em consonância com as 
necessidades do mercado e da população de modo geral, empenhando-se na 
realização de práticas pedagógicas compatíveis com o processo produtivo da área 
de saúde e especificamente da subárea Biodiagnóstico. Objetiva então, em última 
instância um padrão de qualidade e compromisso com uma aprendizagem voltada 
para a ciência e tecnologia que viabiliza a inserção do aluno no mercado de trabalho 
com desenvolvimento da cidadania plena. 
4
Objetivou-se também atuar em sintonia com a Lei de Diretrizes e Bases da 
Educação Nacional e as Diretrizes Curriculares Nacionais para a Educação 
Profissional de Nível Técnico que preconizam um desenvolvimento de competências 
ligadas a laboralidade, flexibilidade, interdisciplinaridade e os valores estéticos e 
éticos. 
Dentre as competências profissionais dos técnicos na área da saúde 
podemos citar:
−Identificar os determinantes e condicionantes do processo saúde-doença
−Identificar a estrutura e organização do sistema de saúde vigente.
−Identificar funções e responsabilidades dos membros da equipe de trabalho.
−Planejar e organizar o trabalho na perspectiva do atendimento integral e de 
qualidade.
−Realizar trabalho em equipe, correlacionando conhecimentos de várias 
disciplinas ou ciências, tendo em vista o caráter interdisciplinar da área.
−Aplicar normas de biossegurança.
−Aplicar princípios e normas de higiene e saúde pessoal e ambiental.
−Interpretar e aplicar legislação referente aos direitos do usuário.
−Identificar e aplicar princípios e normas de conservação de recursos não 
renováveis e de preservação do meio ambiente.
−Aplicar princípios ergonômicos na realização do trabalho.
−Avaliar riscos de iatrogenias, ao executar procedimentos técnicos.
−Interpretar e aplicar normas do exercício profissional e princípios éticos que 
regem a conduta do profissional de saúde.
−Identificar e avaliar rotinas, protocolos de trabalho, instalações e equipamentos.
−Operar equipamentos próprios do campo de atuação, zelando pela sua 
manutenção.
−Registrar ocorrências e serviços prestados de acordo com exigências do campo 
de atuação.
−Prestar informações ao cliente, ao paciente, ao sistema de saúde e a outros 
profissionais sobre os serviços que tenham sido prestados.
−Orientar clientes ou pacientes a assumirem, com autonomia, a própria saúde.
−Coletar e organizar dados relativos ao campo de atuação.
−Utilizar recursos e ferramentas de informática específicos da área.
− Realizar primeiros socorros em situações de emergência.
5
A disciplina Técnicas Especiais em Análises Clínicas foi proposta para que o 
técnico em Biodiagnóstico tenha conhecimento de algumas práticas e técnicas que 
são executadas dentro de laboratórios de médio e grande porte, como também em 
laboratório mais especializados. Muitas vezes, o técnico em Biodiagnóstico, não tem 
o pleno conhecimento destas ações pois o que é visto baseia-se na rotina de um 
laboratório. 
Portanto, esta disciplina abordará algumas atividades de extrema 
importância, executadas com um pouco mais de tecnologia e material pelo 
Farmacêutico-Bioquímico e o Técnico em Biodagnóstico.
3.1.RECOMENDAÇÃO
Este exame é recomendado para homens e mulheres, anualmente, a partir 
dos 40 anos. Ele pode detectar doenças que evoluem lentamente e muitas vezes 
sem sintomas aparentes, como pólipos ou tumores de cólon ou reto. Em seus 
estágios iniciais, as doenças colorretais, tais como: câncer, úlceras, hemorróidas, 
pólipos, colite, diverticulite e fissuras, podem não manifestar sintomas visíveis, 
mesmo que elas possam estar produzindo sangue oculto nas fezes.
3.2.DIETA SUGERIDA DURANTE O PERÍODO DO TESTE
Por dois dias consecutivos antes e durante o período do teste, comer 
vegetais, frutas e cereais (tais como centeio e grãos inteiros). Esta dieta dará um 
melhor resultado ao teste, pois as partes fibrosas rústicas dos cereais poderá ajudar 
a descobrir tais coisas como lesões silenciosas que sangram ocasionalmente. O 
aumento de resíduos fará com que os cânceres sangrem, fazendo com que sejam 
detectados pelo exame. Evite carnes vermelhas, e vegetais ricos em peroxidase 
(nabo, rabanete, alcachofra, cogumelo, brócolis, broto de feijão, couve-flor, maçã, 
laranja, banana, melão, uvas) por poderem provocar uma coloração não verdadeira 
6
2. CONSIDERAÇÕES GERAIS
3. PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES
das fezes, como também a vitamina C e álcool por 72 horas antes do teste e durante 
o teste. 
Vegetais: crus e cozidos, especialmente alface, espinafre e milho
Frutas: ameixas secas ou naturais, uvas e maçãs
Amendoim: quantidade moderada
Pipoca: quantidade moderada.
Uma dieta como essa, ajuda a reduzir o número de falso-positivos e ao 
mesmo tempo providencia a absorção de alimentos de difícil digestão, para facilitar a 
descoberta de lesões que possam sangrar apenas intermitentemente. 
3.3.MEDICAÇÕES QUE DEVEM SER EVITADOS DURANTE O TESTE
Por dois dias consecutivos antes e durante o período do teste, o paciente 
deverá evitar medicamentos que contenham aspirina, drogas anti-inflamatórias e 
ungüentos retais. Também deverá evitar-se remédios sob receita médica que 
poderiam produzir sangramento gastrointestinal: reserpine, indometacina, cimetina, 
butazolidine, fenilbutazona, e persantine. Estas drogas podem causar resultados 
positivos. 
3.4.RISCOS E CONSIDERAÇÕES ESPECIAIS
Não existem riscos. O paciente durante a fase do exame não poderá estar 
sangramento em função de hemorróidas ativas ou em período de menstruação. Os 
agentes dos limpadores de vaso sanitário, que dão uma coloração azul à água, não 
devem entrar em contato com a amostra de fezes.
3.5.COLETA DA AMOSTRA 
A técnica para coletar as fezes para o teste é, geralmente, negligenciada e o 
paciente não é bem informado. Com isto, estudos mostraram que grande parte deles 
recolhe uma porção das fezes após a defecação no vaso sanitário. Com isto pode 
haver contaminação com sangue menstrual ou urinário, ácido ascórbico e outros 
agentes redutores presentes na urina, sanitizadores ou pode haver diluição do 
sangue presente na amostra fecal. O sangue também pode estar heterogeneamente 
distribuído nas fezes,e com isto pode ser recomendável o envio ao laboratório de 
7
duas ou mais porções diferentes da mesma evacuação, além da realização de pelo 
menos três pesquisas em amostras diferentes.
3.6.TIPOS DE TESTES LABORATORIAIS PARA O PROCEDIMENTO:
3.6.1. Testes microscópicos
Fundamentação
Pesquisa-se o sangue oculto por meio de leitura manual das lâminas 
montadas com as fezes dos pacientes com o objetivo de encontrar hemácias.
Teste do Guaiaco 
Este teste (com variações) tem estado disponível há mais de um século e é 
o mais amplamente utilizado nos laboratórios. Os testes laboratoriais disponíveis 
para monitoramento anual detectam vestígios de sangue oculto nas fezes.
O conceito da Goma de Guáiaco como indicador de sangue oculto nas 
fezes foi introduzido no inicio do século 20, porém sua utilização como teste para 
monitoramento de câncer colorretal foi possível a partir de 1967, graças ao advento 
do teste em papel impregnado com guaiaco. 
Este teste, ainda vastamente utilizado, baseia-se na atividade 
pseudoperoxidase que a porção de hemoglobina exerce, causando a oxidação do 
ácido alfa guaiacônico e tornando-se visível através do desenvolvimento da cor azul 
no papel impregnado.
Em geral, o nível de perda de sangue fecal deve exceder 10 ml/dia para 
gerar um teste positivo em pelo menos uma ocasião. Devido às substâncias 
interferentes, assim como os cuidados necessários com os pacientes para o 
procedimento correto do teste de guaiaco, outras técnicas laboratoriais foram 
desenvolvidas no decorrer dos anos, dentre elas a técnica por imunocromatografia 
de captura que utiliza anticorpos para possibilitar a detecção de amostras com níveis 
de hemoglobina tão baixos quanto 0,05ul\ml em 5 minutos. Esta reação imunológica 
elimina a interferência de hemoglobina de outras espécies, assim como a 
necessidade de dieta alimentar. 
8
Realização do teste
Geralmente é usado como teste rápido. Consiste de uma lâmina-teste de 
papel absorvente biodegradável revestido de substancias sensíveis à hemoglobina. 
Após a evacuação, esta lamina-teste e colocada, na superfície da água do vaso 
sanitário. 
Existem testes onde a amostra é colocada diretamente em uma fita 
reveladora. O resultado dependerá de cada kit comercial.
Resultados 
Positivos: Se amostra fecal, contém um nível anormal de sangue, uma cruz azul-
verde aparecerá determinando o resultado positivo.
Negativo: Não aparecimento da cor em questão.
Cuidados durante o teste
Primeiramente, se possível, urinar e dar descarga do vaso sanitário. Logo, 
proceder a evacuar. 
Não urine durante o teste. 
Fatores que podem levar a resultados errôneos
Outros fatores podem causar reações falsamente positivas são algumas 
frutas e vegetais têm atividade de peroxidase e devem ser retirados da dieta por três 
dias para reduzir o índice de falso-positivos.
Fig.2
9
Tem sido relatados falso-positivos com o uso de ferro oral, cimetidina, 
sucralfato, halogênios e sanitizadores de toaletes. Outras substâncias foram 
implicadas em reações falsamente negativas: ácido ascórbico, antiácidos, calor, pH 
ácido e falha dos reagentes. 
3.6.2. Pesquisa Imunoquímica
Fundamentação:
Recentemente, em substituição ao método tradicional, um método 
imunocromatográfico, que se utiliza de anticorpos específicos contra hemoglobina 
humana e que não reagem com outras hemoglobinas, peroxidases da dieta e 
medicamentos.
Vantagem
Uma grande vantagem de ordem prática deste método é tornar 
desnecessário um preparo dietético muito restrito. Podem ocorrer, raramente, 
reações inespecíficas com outros componentes fecais mal identificados até o 
momento. 
3.7.SELEÇÃO DA TÉCNICA DE EXAME 
A seleção do teste deve ser guiada por considerações sobre o desempenho 
do teste, sua disponibilidade, praticidade e custo em relação à indicação clínica. 
Para a triagem de sangramento colorretal, testes simples, pouco dispendiosos e 
qualitativos como o guaiaco e o imunoquímico são preferíveis, sendo que o 
imunoquímico ainda oferece a vantagem do preparo menos restritivo para o 
paciente.
Quadro 1. Comparativo entre os testes para sangue oculto nas fezes
FATORES A SEREM ANALISADOS
PESQUISA IMUNO-
QUÍMICA
TESTE DO 
GUAIACO
10
Quantitativo Não Não
Falso-Positivo Químico
Peroxidases da dieta
Hemoglobina animal
Halogênios
Sanitizadores
Ferro
Fezes hidratadas
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim (?)
Sim
Falso-Negativo Químico
Ácido ascórbico
Metab. enterocólico Hb
Fezes não recentes
Fezes ressecadas
Não
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Teste comumente utilizado em laboratórios clínicos e experimentais. Esses 
ensaios são constantemente aprimorados para reduzir o número de etapas, 
minimizando, assim, tanto o tempo necessário para a sua realização quanto à 
possibilidade de erro humano na sua execução.
Temos um exemplo de testes de ELISA que são vendidos ao público nas 
drogarias e também utilizados como triagem de gravidez nos laboratórios que não 
possuem automatização para realizar o β-hCG , testes rápidos de gravidez. Em 
geral, estes testes usam anticorpos específicos para reagir com o hormônio típico da 
gravidez (gonadotropina coriônica humana - hCG). Se houver a presença do 
hormônio, haverá ligação dele com o anticorpo preso na fita usada e produzirá cor. 
Caso a paciente não esteja grávida (não terá o hormônio), não haverá ligação e 
conseqüentemente não terá revelação de cor.
O teste vem numa embalagem individual de alumínio descartável, junto com 
um gotejador e um sachê absorvente contra a umidade para maior proteção. 
Apresentado em forma de cassete os testes, dividem-se em três partes: zona 
absorvente ("S") contendo anticorpos (contra o hCG), zona de controle ("C") e zona 
de resultado (T")".
11
4. ELISA (ENZIMA IMUNO ENSAIO)
4.1.PROCEDIMENTO DO TESTE:
Encher o gotejador com urina (sendo de preferência a 1° urina da manhã) e 
manter na posição vertical . Apertar levemente o gotejador e aplicar três (3) gotas de 
urina, no quadradinho marcado com ("S"), zona de absorção.
Os resultados deverão ser lidos após 5 minutos.
4.2.LEITURA DO TESTE
Padrão 1: Uma linha vermelha indica apenas que o teste está funcionante 
pois a linha do controle do teste apareceu.
Padrão 2: Duas linhas do teste vermelhas aparentes indicam que o teste 
está funcionante e que a paciente está grávida.
Padrão 3: Nenhuma linha aparente indica que o teste não está funcionante 
e que deverá ser descartado. 
Mulheres não grávidas não possuem níveis de hCG detectáveis por estes 
tipos de teste. Níveis de aproximadamente l5 mIU/ml, podem ser detectados nos 
primeiros dois ou três dias de ausência do ciclo menstrual. O pico de hCG de 
>37.000 mIU/ml ocorre, cerca de 8-10 semanas após o último período menstrual e 
então declina para valores mais baixos durante o resto da gravidez..
Fig.3
Fig.4
1 2 3
12
4.3.FUNDAMENTAÇÃO
É um método quantitativo em que a reação antígeno-anticorpo é monitorada 
pela medida de atividade enzimática. O ensaio pode ser aplicado com uma 
variedade de sistemas de detecção que vão de leituras visuais a fotométricas, com 
substratos coloridos, fluorescentes ou luminescentes.
O principio básico é a imobilização de um dos reagentes em uma fase 
sólida, enquanto o outro pode ser ligado a uma enzima, com a preservação tanto da 
atividade enzimática quanto da imunológica. O teste detecta quantidades 
extremamente pequenas de antígenos e ou anticorpos. 
4.4.VANTAGENS
- Utiliza reagentes estáveis;
- Pode ser adaptado tanto a testes simples manuais como à automação 
sofisticada;
- Medem diretamente a interação entre o antígeno e o anticorpo, não 
dependendo deum segundo fenômeno como precipitação, aglutinação ou fixação de 
complemento, que diminuem o limiar de sensibilidade.
4.5.COMPONENTES DO TESTE
4.5.1. Fase sólida
Constituída por partículas de 
agarose, poliacrilamida, dextran, 
poliestireno, etc. Sendo as placas 
plásticas as mais usadas por 
permitirem múltiplos ensaios. Abaixo temos uma placa já utilizada e com reação de 
cor.
13
 
Fig.5 
4.5.2. Enzimas
A mais utilizada é a peroxidase. É utilizada ligada ao anticorpo formando o 
conjugado.
4.5.3. Conjugados
Devem ser preparados com anticorpos com grande afinidade ao que se 
procura e muito bem purificado. No conjugado, será onde a enzima estará ligada ao 
anticorpo para que caso haja ligação, a enzima se ligue ao substrato e produza cor 
para ser lida em espectofotômetro. 
14
Fig. 6
4.5.4. Substratos
São utilizados para que, caso a amostra seja positiva para o que se 
pesquisa, ocorra a degradação enzimática dão origem a produtos solúveis coloridos, 
cuja determinação é feita por D.O. (densidade óptica) em espectofotômetro. Os mais 
usados são ortophenilenodiamina(OPD), ácido 5- amino salicílico, ortotoluidina, 2,2’- 
diazino do ácido etilbenzotiazolino sulfônico(ABTS) e tetrametilbenzidina (TMB).
4.6.ETAPAS DO TESTE
As etapas do teste dependerão de qual dos tipos de ELISA está sendo 
usado. Algumas etapas são indispensáveis para a realização do teste, são elas: 
Diluir as amostras, colocar as amostras em cada pocinho, colocar os reagentes, 
lavagens, colocar o conjugado, colocar o substrato, colocar a solução de paragem 
ou solução stop e leitura da amostra.
A partir das placas ou cubetas sensibilizadas com antígenos, agora o 
objetivo será aplicar as amostras em estudo, em busca da reação Antígeno-
Anticorpo, que resultará em uma coloração. 
4.6.1. D4.6.1. Diluição das amostras e controles
 As amostras de soro fresco ou plasma, livre de hemácias devem ser 
usados. Amostras de soro ou plasma altamente lipêmico, ictérico, com alta 
concentração de hemoglobina ou contaminados por fungos ou bactérias podem 
levar a resultados de testes duvidosos. Evitar congelar e descongelar amostras 
repetidamente. 
Usado a solução diluente que cada teste possui a sua em específico e a 
diluição é especificada em cada bula. É particularmente conveniente a diluição 
diretamente na placa, onde primeiramente é dispensado o diluente e então as 
amostras. Os controles devem ser pipetados por último.
4.6.2. Incubação 
Realizada para facilitar a ligação do anticorpo da amostra com o antígeno 
adsorvido à placa. Deve ser preferencialmente realizada em incubadora moderna, 
15
que assegure que a temperatura de incubação é alcançada rapidamente na 
amostra. Deve ser evitada a incubação em estufas pois apresentam dificuldades no 
controle de temperatura. A incubação deverá ser feita sem agitação. 
A placa deve ser coberta com adesivos que vem no próprio kit do teste. A 
temperatura ideal para incubação é de 37°C +/- 1°C. O tempo de incubação deverá 
ser seguido o da bula do kit.
Com anticorpos presentes, ocorrerá uma ligação Antígeno-Anticorpo.
4.6.3. Lavagem da placa
Após a incubação, a placa é então lavada com o intuito de retirar anticorpos 
não específicos que podem atrapalhar de alguma forma a reação. A lavagem pode 
ser feita manualmente com solução de lavagem própria do teste. Este procedimento 
feito manualmente gastará muito tempo, em função disto, a lavadora de ELISA 
automática é usada. O procedimento é o mesmo usado no procedimento manual, 
lava-se 5 vezes cada pocinho com o tampão de lavagem. 
Caso ainda reste solução de lavagem na placa após a lavagem automática, 
esta placa deverá ser batida rapidamente, antes da secagem do material, para que 
não interfira na reação. As batidas na placa deverão ser feitas levemente e várias 
vezes. Caso haja anticorpos ou antígenos, dependerá do tipo do teste, eles vão 
estar ligados e quando a lavagem for feita, não se desligarão. 
Basicamente é dispensado e aspirado o líquido de lavagem, repetidas 
vezes. A velocidade com que o líquido é dispensado e aspirado da microplaca, deve 
ser controlada, constante e uniformemente em todas as cavidades da placa.
Fig.7
16
4.6.4. Adicionar o conjugado (Enzima / Anti-anticorpo)
O conjugado será pipetado dentro da cada pocinho. Caso na placa houve a 
ligação esperada (amostra positiva), o anti-anticorpo se ligará e será formado um 
complexo: antígeno – anticorpo – conjugado.
4.6.5. Lavagem
É feita nova lavagem pois caso não tenham anticorpos ligados à placa, o 
conjugado não ficará ligado e deverá ser retirado para que cor inespecífica seja 
produzida. 
Caso os anticorpos da amostra tenham se ligado na placa e o conjugado ao 
anticorpo, na lavagem, este conjugado não sairá da placa.
4.6.6. Adicionar o substrato
Esse substrato adicionado será específico para a enzima que está no 
conjugado. Essa etapa tem a finalidade de que, caso haja ligação do conjugado na 
placa, ocorra sua degradação e em conseqüência haja produção de cor.
4.6.7. Incubação
Nova incubação deverá ser realizada para facilitar a ligação do substrato ao 
conjugado já preso à placa pelo antígeno. Essa incubação deverá ser feita em 
temperatura ambiente e ambiente escuro. 
4.6.8. Adicionar solução bloqueadora (solução de paragem) 
A ação da enzima em degradar o substrato será interrompida e 
desenvolverá uma cor.
17
4.7.LEITURA
Esta leitura, em alguns casos, pode ser feita visualmente, caso deseje saber 
somente se é a amostra é positiva ou negativa. Isto é normalmente chamado de 
ELISA QUALITATIVO.
Ainda neste caso, também se podem definir aquelas amostras "duvidosas", 
ou "indeterminadas", que talvez devam ser submetidas a outro tipo de teste para 
confirmação.
Para resultados mais precisos, com instrumentos de leitura como um 
Espectrofotômetro ou uma Leitora de Microplacas por Absorbância, pode-se obter 
até mesmo a concentração. Este já é chamado de ELISA QUANTITATIVO..
Hoje, as Leitoras de Microplacas possuem graus elevados de automação, e 
isto é feito rapidamente, em segundos.
A leitura feita pelo espectofotômetro pode ser analisada manualmente, 
tendo como base a realização do cut-off. Este é o parâmetro utilizado para saber 
quais amostras são positivas e quais são negativas. 
Cada teste tem uma maneira diferente de realizar o cálculo do cut-off. As 
leituras feitas pelo espectofotômetro que estiverem acima do valor do cut-off serão 
consideradas positivas. As amostras são consideradas negativas quando os valores 
da D.O. (densidade óptica) estiverem abaixo deste valor do cut-off. 
Fig.8
18
Um determinado teste para pesquisa de anticorpos contra o HIV 1 e 2 tem o 
seguinte cálculo do seu cut-off: D.O. (medida da leitura) do controle negativo + 
0,250.
O controle negativo teve sua D.O. de 0,050.
O cálculo será 0,050 + 0,250 cut-off do teste: 0,300.
A amostra n° 1 teve sua D.O. de: 0,850.
A amostra n° 2 teve sua D.O. de: 0,110.
A amostra n° 3 teve sua D.O. de: 0,150.
A amostra n° 4 teve sua D.O. de: 0,500.
A amostra n° 5 teve sua D.O. de: 1,256.
Amostras positivas: As que possuírem D.O. acima de 0,300 (valor do cut-
off), ou seja, amostras 1, 4 e 5.
Amostras negativas: As que possuírem D.O. abaixo de 0,300 (valor do cut-
off), ou seja, amostras 2 e 3.
Leitora automática de ELISALavadora automática de ELISA
Fig.9
Exemplo de realização do cut-off:
nº 1 2 3 4 5
Fig.10
19
4.8.TIPOS DE TESTE ELISA
Vários tipos de testes dentro do ELISA baseado no que estará preso à placa 
e a seqüência do teste a ser seguida. Exemplos de teste ELISA:
−Método indireto; 
−Método de captura de anticorpos IgM;
−Método de captura ;
−Método de competição com antígeno marcado;
−Método de competiçãocom anticorpo marcado;
−Método de inibição de haptenos;
 
Exemplos de esquematização de testes ELISA realizados
Fig.11 
20
O teste de imunofluorescência é um dos mais utilizados nos diagnósticos de 
laboratório para a pesquisa de anticorpos e cada vez mais para a pesquisa de 
microrganismos e seus componentes em espécimes clínicas. 
A imunofluorescência é amplamente utilizada embora esta técnica seja mais 
complexa. O teste de imunofluorescência indireta consiste na reação de soros com 
os parasitas a serem pesquisados, fixados em lâminas de microscopia. Numa etapa 
seguinte, utiliza-se um conjugado fluorescente para evidenciação da reação. A 
leitura é realizada com auxílio de microscópio que utiliza incidência de luz azul e 
ultra-violeta. 
A sensibilidade dos testes de imunofluorescência é limitada ao nível de 
fluorescência detectável pelo olho humano; por isso, o teste de imunofluorescência 
indireta tem sido empregado para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade. 
Pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos.
Para a Pesquisa de Antígenos 
Consiste na incubação da célula ou tecido em que se quer pesquisar o 
antígeno com o anticorpo específico obtido em animal conhecido, levando a 
formação de um imunocomplexo. Após a lavagem, a preparação é incubada com um 
conjugado de antiimunoglobulina produzida em outra espécie de animal.
Para a Pesquisa de Anticorpos 
Fig.12
21
5. RIFI (REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA)
Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro. O soro do paciente 
é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do 
complexo antígeno-anticorpo. Após lavagens, a preparação é incubada com o 
conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o 
anticorpo específico para o antígeno. 
5.1.FUNDAMENTAÇÃO
Fixadas em lâminas de microscópio, as células infectadas (portadoras de 
antígenos) são incubadas com o soro que se deseja testar. Depois são tratadas com 
outro soro que contenha anticorpos específicos para imunoglobulina humana (anti-
lg) conjugados a um fluorocromo. 
A presença dos anticorpos é revelada por meio de microscopia de 
fluorescência. Também amplamente utilizada em alguns serviços como teste inicial.
5.2.ETAPAS
A seqüência da reação é semelhante ao ELISA porém a revelação do 
produto é feita por um sinal fluorescente podendo ser lida em microscópios ou em 
aparelhos, permitindo a avaliação de grande número de amostras 
concomitantemente e com grande rapidez e confiabilidade. 
Seus resultados são superponíveis aos do ELISA convencional.
1° etapa
22
O soro diluído com anticorpos são colocados na presença dos antígenos na 
placa preparada por um período de incubação.
2° 
etapa
 A etapa de lavagem que se segue após a incubação primária remove todos 
os anticorpos não ligados. Segue uma reação secundária e um período de 
incubação. 
3° etapa
O reagente utilizado na reação secundária é o conjugado anti-globulina 
humana marcado com fluoresceína que recobre todo o esfregaço. O conjugado não 
ligado será eliminado nas lavagens e o padrão do conjugado ligado é lido 
visualmente utilizando-se um microscópio de fluorescência.
4° etapa
A intensidade de fluorescência é graduada na escala de 4+ a negativo 
(ausência de fluorescência).
23
Fig.13
Quadro 2
Leitura inicial Repetição Resultado
4+, 3+, 2+ Reativo
1+ > 1+ Reativo
1+ Reatividade mínima *
< + Não reativo
< 1+ Não reativo
N- ± Não reativo
Esquematização para entendimento das etapas do teste de 
imunofluorescência indireta:
Teste positivo
Teste negativo
* Retestar todas as amostras com intensidade de fluorescência de 1+.
Lâmina visualizada em microscópio de imunofluorescência
Fig.14
Fig.15
24
Exemplo de imunofluorescência direta
Este tipo de técnica tem tido a sua aplicação aumentada nos últimos anos, 
pela sua boa sensibilidade, especificidade e rapidez. Pode ser utilizada para a 
detecção de antígenos de qualquer agente infeccioso, desde que se disponha de 
anticorpos específicos. 
Princípios do teste:
−O teste utiliza o princípio do teste ELISA indireto em tiras que contém todas as 
proteínas constitutivas dos vírus buscados e um controle.
−Primeiramente é feita a re-hidratação das tiras e incubação das amostras; se 
existirem anticorpos contra o vírus em questão, eles se ligarão às proteínas virais 
encontradas nas tiras (ligação antígeno - anticorpo). 
Imunofluorescência positiva
Fig.16
Imunofluorescência positiva
Fig.17
25
6. WESTERN BLOT
−Após lavagem, é feita incubação com os anti-anticorpos IgG humanos que estão 
marcados com uma enzima chamada fosfatase alcalina; se na fase da incubação 
anterior estiver acontecido a ligação antígeno (que está na tira) – anticorpo (caso 
haja na amostra), este anti-anticorpo se ligará a este anti-anticorpo marcado com a 
enzima.
−Após nova lavagem e eliminação do que não se ligou na tira, a solução de 
revelação permite pôr em evidência a atividade da enzima que está ligado ao 
complexo antígeno (placa) – anticorpo (amostra) – anti-anticorpo marcado com 
enzima (que foi adicionado).
−O aparecimento de bandas coloridas específicas permite pôr em evidência a 
presença de anticorpos contra o vírus testado, na amostra. 
6.1.AMOSTRAS
Pode ser utilizada para detectar antígenos em vários materiais clínicos 
como sangue, soro, secreções, tecidos, células de cultivo. 
6.2.REAGENTES
6.2.1. Tira de nitrocelulose
Local onde estará as proteínas virais que servirão de antígeno na ligação 
antígeno – anticorpo. Geralmente o teste apresenta 18 tiras.
6.2.2. Solução de lavagem
Solução para que a lavagem seja feita entre as etapas. Essa lavagem serve 
para retirar todos os anticorpos que não se ligaram na tira, o conjugado (anti-
anticorpo marcado com enzima) e outras substâncias que possam interferir na 
reação.
Fig. 18
26
6.2.3. Controle negativo
Este controle é necessário para nos garantir que a reação ocorreu de forma 
correta e que todos os reagentes estão em condições apropriadas, inclusive a tira 
reagente.
6.2.4. Controle positivo
Controle necessário também para nos assegurarmos de que todos os 
reagentes estão válidos e todo o procedimento foi feito de forma correta.
6.2.5. Conjugado
Substância adicionada após a teórica ligação do antígeno (tira) e anticorpos 
da amostra caso esta seja positiva. È adicionado para marcar esta reação citada, 
pois só haverá formação de cor na tira, caso este conjugado tenha se ligado ao 
anticorpo. O conjugado é composto de anti-anticorpos ligados a uma enzima, a 
fosfatase alcalina.
6.2.6. Solução de revelação
Solução necessária para revelar a ligação caso tenha acontecido a ligação 
entre o antígeno da placa e o anticorpo da amostra.
6.2.7. Restrições
As suas maiores restrições referem-se à necessidade de equipamento 
especial, e ao fato de ser uma técnica relativamente recente, não tendo sido ainda 
assimilada por muitos laboratórios. 
A técnica de western blot é mais trabalhosa, o que dificulta a sua automação 
e o teste simultâneo de um número grande de amostras. 
6.3.ETAPAS
27
1° Etapa
Os reagentes devem ser retirados da geladeira e deve-se aguardar 
30minutos até que os reagentes estabilizem a temperatura ambiente do laboratório. 
As tiras devem ser manipuladas com muito cuidado com a utilização de pinças de 
plástico.
2° Etapa
Adicionar 2 mL de solução de lavagem/diluente em cada poço. Incubar 
durante 5 minutos +/- 1 minuto à temperatura ambiente, sob agitação lenta.
3° Etapa
Adicionar 20μl de cada amostra no poço correspondente. Incubar por duas 
horas +/- 5 minutos à temperatura lenta, sob agitação lenta.
4° Etapa
Aspirar todo o conteúdo decada poço por meio de uma bomba à vácuo 
equipada com um recipiente contento desinfetante (lixívia a 25%).
Entre cada aspiração, enxaguar em água corrente a ponta da aspiração em 
contato com as amostras para evitar qualquer contaminação de uma amostra para 
outra.
Lavar cada tira com 2 mL de solução lavagem/diluente e eliminá-la 
imediatamente por aspiração.
Lavar mais duas vezes e deixar em contato, durante 5 minutos sob agitação 
lenta, cada uma das fitas com a solução (ou seja, 3 lavagens no total). Eliminar a 
solução da última lavagem.
5° Etapa
Fig. 19
28
Distribuir 2 mL de conjugado por poço e incubar por 1 hora +/- 5 minutos à 
temperatura ambiente, sob agitação lenta.
6° 
6° Etapa
Nova lavagem é feita da mesma forma citada anteriormente.
7° Etapa
Distribuir 2mL de solução de revelação por poço. Incubar sob agitação lenta 
e observar o aparecimento de coloração.
8° Etapa
Parar a reação eliminando a solução de revelação e enxaguando as tiras 3 
vezes com água destilada.
9° Etapa
Secar as tiras entre 2 folhas de papel absorvente, à temperatura ambiente.
10° Etapa
A leitura das tiras é feita a olho nu, observando a coloração azul violetas. É 
necessário que se siga padrões de leitura preconizados pela OMS, que serão 
citados abaixo.
Fig. 20
Fig. 21
29
Como este teste é usado geralmente como teste confirmatório para HIV, a 
literatura mostra a forma de leitura deste teste. Padrões específicos de reações 
podem ser identificados, e, embora a definição de testes positivos seja controvertida, 
a ausência de reações específicas para os diferentes antígenos do HIV confirma a 
reação negativa. 
DENOMINAÇÃO NOMENCLATURA ASPECTO DA TIRA NO TESTE
GP160 ENV Tira nítida
GP110/120 ENV Tira com bordos difusos
P68 POL Tira nítida
P55 GEG Tira duplicada
P52 POL Tira nítida
GP41 ENV Tira difusa
P40 GAG Tira nítida
P34 POL Tira nítida
P24/25 GAG Tira nítida
P18 GAG Por vezes, duplicado
* Critério OMS: Organização Mundial de Saúde
Fig. 22
30
Fig. 23Quadro 3
INTERPRETAÇÃO PERFIL
Positivo* 2 ENV + GAG + POL
Indeterminado
1 ENV + GAG + POL
GAG + POL
GAG
POL
Negativo
Nenhuma tira reativa ou
Tiras não citadas acima
Testes de Western-Blot são desenvolvidos por diferentes laboratórios de 
produção de kits e reativos para diagnóstico. Isso origina a possibilidade de 
diferentes critérios de interpretação que devem estar sempre sujeitos a avaliações 
comparativas com aqueles recomendados por instituições de referência, tais como o 
CDC.
A presença ou a ausência de anticorpos contra HIV-1 em amostras de soro 
e/ou plasma e a identificação de anticorpos presentes são determinadas pela 
comparação de cada reação com os controles de reatividade baixa, alta e ausente. 
Deverão ser seguidas três fases de interpretação: primeira - cada banda de reação 
que aparece na fita de nitrocelulose da amostra deverá ser identificada 
comparativamente ao controle padrão de alta reatividade; segunda - cada banda 
deverá ser avaliada com base na intensidade de reação; terceira - a interpretação 
deverá ser finalizada pela associação dos padrões de reatividade.
Fig. 24
31
Quadro 4
7.1.FINALIDADE
Determinar a presença do antígeno D que estão com baixa expressão nas 
hemácias do indivíduo para confirmação do seu fator Rh Em função de alguns 
indivíduos expressarem muito fracamente o antígeno D em suas hemácias, que as 
mesmas não são aglutinadas diretamente pela maioria dos reagentes anti-D. Essa 
expressão fraca de antígeno D, pode ser identificada por adição de soro de Coombs 
após a incubação das hemácias com anti-D. Este teste é chamado de Teste de 
Coombs indireto.
7.2.PROCEDIMENTO 
Amostra: Sangue total, no mínimo 2 ml de sangue total com ou sem anticoagulante.
−Homogeneizar e centrifugar por 15 segundos a 3.500 rpm.
−Lavar 1 mL de hemácias do paciente três vezes com solução salina, por dois 
minutos cada lavagem e retirar a salina com pipeta.
−Fazer suspensão 3-5% com hemácias lavadas (2 mL de salina para duas gotas 
de hemácias lavadas).
−No tubo D, adicionar duas gotas de soroteste anti-D. 
−No tubo C, adicionar duas gotas do controle de Rh.
−Adicionar 100 μL da suspensão a 3% em cada tubo.
−Centrifugar por 15 segundos a 3500 rpm.
−Na presença de aglutinação no tubo D o sangue Rh é positivo.
ANTICORPO ANTÍGENO
Fig.25
32
7. CONFIRMAÇÃO DO FATOR RH (TESTE DE COOMBS INDIRETO)
−Na ausência da aglutinação incubar em B.M. a 37 °C por 30 minutos. 
−Lavar as hemácias com salina nos tubos D e C, centrifugando por um minuto a 
3.500 rpm em cada lavagem. Na última lavagem absorver bem as bordas dos tubos 
com gaze ou papel absorvente. 
−Adicionar 2 gotas de soro polivalente ou soro específico monoespecífico 
(Coombs) em cada tubo.
−Homogeneizar e centrifugar por 15 segundos a 3.500 rpm.
7.3.LEITURA
Consiste na observação da presença ou ausência de aglutinação. Esta 
leitura deve ser feita utilizando o aglutinoscópio como fonte de luz abaixo dos tubos, 
e verificando a presença de aglutinação . Graduar a reação quanto à intensidade da 
reação
. 
Fig.26
 Soro com anticorpos Hemácias Rh positivos Hemácia bloqueada
 Hemácias bloqueadas Soro de Coombs Aglutinação
Fig. 27
33
Obs: A liberação do botão de hemácias formado no fundo do tubo após a 
centrifugação deve ser delicada, pois movimentos bruscos podem desmanchar 
aglutinações mais fracas.
7.4.RESULTADOS
GRUPO/ SORO ANTI-D CONTROLE Rh
Rh positivo + -
Rh negativo - -
−No tubo C não deve haver aglutinação, pois é um controle negativo. Caso isso 
ocorra, não é valido o resultado obtido na classificação. Repetir a prova com uma 
suspensão de hemácias lavadas. Caso continue o problema deve se pensar na 
possibilidade de contaminação da amostra do paciente. Nova amostra deve ser 
coletada e testada.
−Coletar algumas informações sobre o paciente que podem esclarecer essa 
discrepância. São elas: idade, sexo, diagnóstico, medicamentos em uso, testes 
imunológicos anteriores, resultado de outras classificações.
−Se após essas mudanças iniciais continuar o problema, solicitar ajuda ao 
bioquímico responsável pelo setor ou ao médico diretor plantonista do dia.
−Sempre que a classificação o paciente/doador for negativa, deve ser feito o teste 
para determinar a presença da variante D fraco.
 4+ 3+ 3+ 2+ 2+ 1+ Negativo
Fig. 28
34
Quadro 5. Observações relativas ao sistema Rh: 
8.1.FINALIDADE
Detectar hemácias sensibilizadas “in vivo”, ou seja, demonstrar uma ligação 
“in vivo” de hemácias com anticorpos ou complemento, que freqüentemente são do 
tipo IgG e ou C3d. 
É utilizado para diagnosticar doença hemolítica do recém nascido 
(eritroblastose fetal), anemia hemolítica auto-imune (AHAI) e investigar causas de 
reações transfusionais.
8.2.DOENÇA HEMOLÍTICA DO RECÉM NATO OU ERITROBLASTOSE FETAL 
Uma doença provocada pelo fator Rh é a eritroblastose fetal ou doença 
hemolítica do recém-nascido (DHRN), caracterizada pela destruição das hemácias 
do feto ou do recém-nascido. As conseqüências desta doença são graves, podendo 
levar a criança à morte. 
Durante a gestação ocorre passagem, através da placenta, apenas de 
plasma da mãe para o filho e vice-versa devido à chamada barreira hemato-
placentária. Pode ocorrer, entretanto, acidentes vasculares na placenta, o que 
permite a passagem de hemácias do feto para a circulação materna. 
Fig. 29
35
8. TESTE DE COOMBS DIRETO (PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES 
COM PEG)
Nos casos em que o feto possui sangue fator rh positivo (antígeno D) os 
antígenos existentes em suas hemácias estimularão o sistema imune materno a 
produzir anticorpos anti-Rh que ficarãono plasma materno e podem, por serem da 
classe IgG, passar pela barreira placentária provocando lise nas hemácias fetais. A 
produção de anticorpos obedece a uma cascata de eventos (ver imunidade humoral) 
e por isto a produção de anticorpos é lenta e a quantidade pequena num primeiro. 
8.2.1. Primeira gravidez
A partir da segunda gestação, ou após a sensibilização por transfusão 
sanguínea, se o filho é Rh+ novamente, o organismo materno já conterá anticorpos 
para aquele antígeno e o feto poderá desenvolver a DHPN ou eritroblastose fetal.
8.2.2. Segunda gravidez
Hemácia Rh negativa (-)
Hemácia Rh positiva (+)
Fig. 30
36
O diagnóstico pode ser feito pela tipagem sanguínea da mãe e do pai 
precocemente e durante a gestação o teste de Coombs que utiliza anti-anticorpo 
humano pode detectar se esta havendo a produção de anticorpos pela mãe e 
providências podem ser tomadas. 
Uma transfusão, recebendo sangue Rh-, pode ser feita até mesmo intra-
útero já que Goiânia está se tornando referência em fertilização in vitro. O sangue 
Rh- não possui hemácias com fator Rh e não podem ser reconhecidas como 
estranhas e destruídas pelos anticorpos recebidos da mãe. Após cerca de 120 dias, 
as hemácias serão substituídas por outras produzidas pelo próprio indivíduo. O 
sangue novamente será do tipo Rh +, mas o feto já não correrá mais perigo 
Para se proteger da Eritroblastose fetal, a mãe RH negativo que tem 
parceiro RH positivo pode receber gamaglobulina anti-RH por via injetável logo após 
o nascimento do primeiro bebê RH positivo. Essa substância bloqueia o processo 
Fig. 31
 Hemácias Rh negativas (-)
 Anticorpos contra as 
 hemácias Rh 
positivas
Hemácias Rh Positivas (+)
Anticorpos contra a 
hemácia Rh positiva
37
que produz anticorpos contra o sangue RH positivo do feto. A mãe recebe uma dose 
passiva temporária de anticorpos que destroem células sanguíneas RH positivo, 
impedindo assim que a mãe produza anticorpos permanentes. A aplicação logo 
após o parto, destrói as hemácias fetais que possam ter passado pela placenta no 
nascimento ou antes. Evita-se , assim, a produção de anticorpos “zerando o placar 
de contagem”. Cada vez que um bebê nascer e for Rh+ deve-se fazer nova 
aplicação pois novos anticorpos serão formados. 
Para determinar a gravidade do problema, é possível fazer exames através 
do líquido aminiótico. Caso seja detectado que a doença se encontra em estágio 
avançado, deve-se optar pelo parto prematuro. O tratamento de bebês que nascem 
com o problema pode incluir uma transfusão total de sangue. O bebê recebe sangue 
RH negativo, que não é destruído pelos anticorpos da mãe presentes no recém 
nascido, pois não têm o antígeno. Depois de um certo tempo, as hemácias RH 
negativas do bebê são totalmente substituídas por outras RH positivas. 
Os sintomas no RN que podem ser observados são anemia (devida à 
destruição de hemácias pelos anticorpos), icterícia (a destruição de hemácias 
aumentada levará a produção maior de bilirrubina indireta que não pode ser 
convertida no fígado), e após sua persistência o aparecimento de uma doença 
chamada Kernicterus que corresponde ao depósito de bilirrubina nos núcleos da 
base cerebrais o que gerará retardo no RN
A eritroblastose fetal vem sendo quase que totalmente eliminada pela 
aplicação adequada da imunoterapia. 
Foi observado que a presença de uma incompatibilidade de ABO evita a 
imunização materna. Por exemplo, uma mãe O Rh-negativa pode ter uma criança A-
positiva, mas não se tornar imunizada contra D. A explicação correta para este fato 
38
Fig. 32
ainda não está clara, mas estas observações conduziram ao conceito de fornecer, à 
mãe, altos títulos de anticorpos anti-D, em torno do período do parto, com o intuito 
de prevenir a sensibilização pelo Rh. 
Este procedimento tem tido grande sucesso e previne a sensibilização com 
um alto grau de confiança. Desde que ele vem sendo amplamente utilizado, a 
incidência da eritroblastose caiu significativamente. A administração de 
concentrados de gamaglobulinas de um doador co alto título de anti-D a mulheres 
Rh-negativas, dentro de 24 horas após o parto de uma criança Rh-positiva, ABO 
compatível ou no momento de um aborto suspeito, se houver alguma possibilidade 
de incompatibilidade por Rh, é agora um padrão de procedimento hospitalar. 
Entretanto, a administração de anti-D a mulheres que já tenham sido sensibilizadas 
não é de grande auxílio.
8.3.ANEMIA HEMOLÍTICA AUTO-IMUNE (AHAI)
Algumas vezes, o sistema imune do organismo apresenta uma disfunção e 
destrói as suas próprias células, as quais ele erroneamente identifica como 
substâncias estranhas (reação auto-imune). Quando uma reação auto-imune é 
direcionada contra os eritrócitos, o resultado é a anemia hemolítica auto-imune 
(anemia mediada imunologicamente). 
As anemias hemolíticas auto-imunes (AHAI) correspondem a um grupo de 
doenças, cujo quadro clínico de anemia resulta do encurtamento da sobrevida das 
hemácias causado por auto-anticorpos circulantes dirigidos contra antígenos de 
glóbulos vermelhos. A anemia desenvolve quando a produção das hemácias pela 
medula não pode ser compensada pelo aumento de destruição devido à hemólise. 
A necessidade de transfusão depende do grau de hemólise e a habilidade do 
paciente tolerar a anemia.
As anemias hemolíticas são classificadas em: 
−Anemia Hemolítica Auto-imune por Anticorpos a Quente; 
−Anemia Hemolítica Auto-imune por Anticorpos a Frio;
−Anemia Hemolítica Auto-imune Induzida por drogas.
Cerca de 48-50% dos casos de anemia hemolítica auto-imune são por 
anticorpos a quente. A anemia hemolítica por anticorpos reativos ao calor (anemia 
hemolítica por anticorpos quentes) é uma condição na qual o corpo produz 
autoanticorpos que reagem contra eritrócitos à temperatura corpórea. Esses auto-
39
anticorpos revestem os eritrócitos, que são então identificados como corpos 
estranhos e são destruídos pelas células removedoras do baço ou, algumas vezes, 
do fígado e da medula óssea. Essa condição é mais comum entre as mulheres do 
que entre os homens. Cerca de um terço dos indivíduos que apresentam esse tipo 
de anemia apresentam uma doença subjacente, como um linfoma, uma leucemia ou 
uma doença do colágeno (especialmente o lúpus eritematoso sistêmico), ou foram 
expostas à determinadas drogas, sobretudo a metildopa. 
Perante uma solicitação de transfusão, certos aspectos devem ser 
considerados, a saber: 
−Cerca de 80% dos pacientes apresentam auto-anticorpos circulantes, reagindo 
com todas as hemácias de doadores e reagentes de hemácias;
−As hemácias transfundidas terão uma sobrevida menor, sendo a mesma que os 
próprios glóbulos do paciente;
−A transfusão pode piorar o quadro clínico do paciente, uma vez que a introdução 
de novos antígenos estimularia a produção de mais auto-anticorpos, retardando o 
efeito da terapia com corticosteróides; 
−Aloanticorpos são encontrados em 20-38% dos pacientes com AHAI com história 
de transfusão ou gestação anterior; portanto todos os esforços devem ser dirigidos 
na identificação de aloanticorpos, uma vez que a transfusão pode desencadear uma 
reação transfusional hemolítica tardia, piorando o quadro clínico do paciente, e 
testes para detecção de aloanticorpos em pacientes com AHAI quente consomem 
tempo e trabalho, retardando a transfusão sanguínea;
−A indicação da transfusão deve ser precisa e só administrada em pacientes com 
sintomatologia decorrente da anemia; o volume a ser infundido deverá ser o 
necessário para aliviar os sintomas e não para correção dos índices hematimétricos.
−A anemia hemolítica de anticorpos reativosao frio (anemia hemolítica por 
anticorpos frios) é uma condição na qual o corpo produz auto-anticorpos que reagem 
contra os eritrócitos na temperatura ambiente ou em temperaturas baixas. Este tipo 
de anemia pode ser agudo ou crônico.
−A forma aguda freqüentemente ocorre em indivíduos que apresentam infecções 
agudas, principalmente certos tipos de pneumonia ou a mononucleose infecciosa. A 
forma aguda geralmente não dura muito, é relativamente leve e desaparece sem 
tratamento.
−A forma crônica é mais comum entre as mulheres, particularmente naquelas com 
mais de 40 anos de idade e que apresentam reumatismo ou artrite. Embora a forma 
40
crônica geralmente persista por toda a vida, a anemia normalmente é leve e produz 
poucos ou nenhum sintoma.
Contudo, a exposição ao frio aumenta a destruição de eritrócitos, pode 
piorar as dores articulares e pode produzir sintomas como a fadiga e a coloração 
azulada dos braços e das mãos. Como é de se esperar, os indivíduos que 
apresentam essa patologia e vivem em climas frios apresentam substancialmente 
mais sintomas do que aquelas que vivem em climas quentes. 
A anemia hemolítica por anticorpos reativos ao frio é diagnosticada através 
de exames que detectam a presença de anticorpos sobre a superfície dos eritrócitos, 
os quais são mais ativos em temperaturas inferiores à temperatura corpórea. Não 
existe um tratamento específico e, por essa razão, o tratamento é direcionado ao 
alívio dos sintomas. A forma aguda associada às infecções melhora por si e 
raramente produz sintomas graves. A forma crônica pode ser prevenida evitando- se 
a exposição ao frio. 
Nas anemias hemolíticas auto-imunes por anticorpos a frio, a transfusão 
quando indicada é benéfica. Em alguns casos a sobrevida das hemácias parece ser 
melhor quando a transfusão é realizada com hemácias e antígenos negativas ao 
auto-anticorpo específico (auto-anti-I na AHAI a frio), porém, estes sangues são 
raros e a transfusão não deve ser adiada colocando em risco a vida dos pacientes. 
O importante é manter esses pacientes aquecidos e raramente há a 
necessidade de aquecer o sangue transfundido. A indicação de hemácias lavadas é 
controvertida, não sendo uma indicação formal. Aconselha-se também o uso de 
componentes leucorreduzidos para evitar reação febril não-hemolítica. Nas anemias 
hemolíticas induzidas por drogas, a sobrevida das hemácias transfundidas poderá 
não ser normal se as drogas ou o complexo imune estão ainda presentes.
8.4.PRINCÍPIO DO TESTE
A presença de eritrócitos circulantes revestidos com imunoglobulinas (IgG 
ou IgM) não é normal. No teste direto da Coombs, as células são testadas 
diretamente quando retiradas da circulação e são tratadas apenas através de 
lavagem para remover proteínas livres. Quando as hemácias sofrem aglutinação 
pela imunoglobulina reagente poliespecífica (soro de Coombs), é conveniente utilizar 
reagentes individuais capazes de identificar os revestimentos das hemácias por IgG 
ou complemento, ou ambos.
41
Uma causa comum de teste direto de antiglobulina é a anemia hemolítica 
auto-imune. Nessa condição, os pacientes possuem anticorpos que reagem contra 
suas próprias células. Esses auto-anticorpos podem ser da classe IgG ou IgM e 
quase sempre reagem com as células de todos os demais indivíduos, bem como 
com as células do paciente. Os eritrócitos revestidos com IgG, IgM ou complemento 
apresentam dificuldades mecânicas para atravessar os pequenos capilares, 
especialmente no baço. Mais importante, o revestimento com globulinas facilita a 
adesão e a fagocitose dessas células pelos macrófagos do sistema 
reticuloendotelial. As células revestidas sofrem uma destruição acelerada (hemólise) 
e, se a medula óssea não for capaz de compensar esta perda, o paciente torna-se 
anêmico. 
Os anticorpos nas síndromes de anemia hemolítica são normalmente 
classificados como reagentes ao frio (anticorpos frios) ou reagentes ao calor 
(anticorpos quentes), dependendo do ótimo teor térmico do auto-anticorpo. 
Os auto-anticorpos da classe IgM geralmente reagem em temperaturas 
inferiores a 37°; freqüentemente esses anticorpos se ligam muito ligeiramente aos 
eritrócitos, de modo que restarão poucas ou nenhuma molécula de IgM para revestir 
as células. Todavia, nesta breve interação, estes anticorpos podem iniciar a cascata 
de ativação de complemento e vários componentes do complemento permanecerão 
ligados às células circulantes, e podem ser identificados por soro de Coombs. Na 
anemia hemolítica auto-imune, a atividade da antiglobulina freqüentemente resulta 
apenas da ativação dos componentes do complemento. Essa forma se anemia 
hemolítica auto-imune ocorre como um evento primário em pessoas idosas de 
ambos os sexos ou após infecções.
A anemia hemolítica auto-imune reativa ao calor é conseqüência de auto-
anticorpos da classe IgG, que permanecem na membrana eritrocitária enquanto as 
células persistem na circulação. Essa condição freqüentemente é um evento 
primário, idiopático, que pode ocorrer em qualquer faixa etária. Até 70% dos casos 
de AHAI são produzidos pelo anticorpo de classe IgG reativo ao calor.
Soro de Coombs Aglutinação
Glóbulos bloqueados 
do recém-nascido
Fig. 33
42
8.5.PROCEDIMENTO
8.5.1.Amostras
O sangue deverá ser colhido com anticoagulante (EDTA), para evitar 
complemento ligado às hemácias “in vivo”, levando o teste a um resultado falso-
positivo ou falso-negativo. O EDTA previne a ativação do complemento “in vivo” 
mesmo que o teste seja feito imediatamente após a coleta de sangue sem 
anticoagulante.
−Centrifugar a amostra de sangue, colhida sem anticoagulante, por 3 minutos a 
3500 rpm.
−Separar cuidadosamente o soro das hemácias e transferir o soro para outro 
tubo.
−Identificar 2 tubos de hemólise I e II.
−Adicionar nos tubos I e II, 100 μL do soro do paciente.
−Adicionar uma gota do painel de triagem I e no tubo I.
−Adicionar uma gota do painel de triagem II e no tubo II.
−Adicionar 4 gotas do PEG nos tubos I e II.
−Homogeneizar lentamente os dois tubos e incubar em B.M. à 37° C durante 15 
minutos.
−Lavar as hemácias dos tubos I e II com solução salina fisiológica centrifugando 
por 1 minuto em cada lavagem.
−Na última lavagem absorver bem as bordas dos tubos com gase ou papel 
absorventes.
−Adicionar duas gotas de soro monoespecífico IgG (Soro de Coombs).
−Ler, observando a presença ou não de aglutinação.
8.5.2.Leitura
A leitura consiste na observação da presença ou ausência de aglutinação 
e/ou hemólise.
43
−Para verificar a presença ou não de aglutinação, utilizar o aglutinoscópio 
posicionado abaixo dos tubos, como fonte de luz. Graduar a reação quanto à 
intensidade
−A liberação do botão de hemácias formado no fundo do tubo após a 
centrifugação deve ser delicada, pois movimentos bruscos podem desmanchar 
aglutinações mais fracas.
−Na fase do controle de Coombs o resultado deverá ser positivo, pois as 
hemácias do controle de Coombs servem como controle da reação.
8.6.RESULTADOS 
Negativo: ausência de aglutinação e/ou hemólise em todas as fases. 
Positivo: presença de aglutinação e/ou hemólise em alguma das fases.
OBS: Nos casos de pesquisa de anticorpos irregulares positiva, contactar com o 
Bioquimico do setor ou responsável. 
9.1.FINALIDADE E PRINCÍPIO DO TESTE
O mesmo citado anteriormente para o teste de Coombs direto.
9.2.PROCEDIMENTO
−Marcar dois tubos de ensaio com a identificação I e II;
−Pipetar em cada tubo 100 ul de soro do paciente;
−Adicionar 2 gotas das células de triagem I no tubo I e 2 gotas de células de 
triagem II no tubo II;
−Centrifugar a 2700 rpm por 1 minuto e fazer a leitura dos dois tubos;
44
9. TESTEDE COOMBS DIRETO (PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES 
COM ALBUMINA BOVINA A 22%)
−Colocar 2 gotas de albumina bovina a 22% nos dois tubos;
−Centrifugar a 2700 rpm por 1 minuto e fazer a leitura dos dois tubos;
−Incubar a 37° C por 15 minutos;
−Centrifugar a 2700 rpm por 1 minuto e fazer a leitura dos dois tubos;
−Lavar três vezes com salina, e desprezar toda a salina após a última lavagem;
−Adicionar 2 gotas de antiglobulina humana;
−Centrifugar a 2700 rpm por 1 minuto e fazer a leitura;
−Se o teste for negativo, adicionar 1 gota de controle de Coombs, centrifugar a 
2700 rpm por 1 minuto e fazer a leitura. 
9.3.LEITURA 
A leitura consiste na observação da presença ou ausência de aglutinação 
e/ou hemólise.
−Para verificar a presença ou não de aglutinação, utilizar o aglutinoscópio 
posicionado abaixo dos tubos, como fonte de luz. Graduar a reação quanto à 
intensidade. 
−A liberação do botão de hemácias formado no fundo do tubo após a 
centrifugação deve ser delicada, pois movimentos bruscos podem desmanchar 
aglutinações mais fracas.
−Para verificar a presença de hemólise o sobrenadante dos tubos deve ser 
observado antes de ressuspender o botão de hemácias.
−Na fase do controle de Coombs o resultado deverá ser positivo, pois as 
hemácias do controle de Coombs servem como controle da reação.
9.4.Resultados: 
Negativa: ausência de aglutinação e/ou hemólise em todas as fases.
Positiva: presença de aglutinação e/ou hemólise em alguma das fases. 
OBS: Nos casos de pesquisa de anticorpos irregulares positiva, contactar o 
Bioquimico do setor ou responsável.
45
Teste de soroaglutinação útil no diagnóstico da Febre Tifóide e Febre 
Paratifóide. A Febre Tifóide é uma doença causada pela Salmonella typhi, e a Febre 
Paratifóide pelas Salmonella paratyphi A, B e C. Manifestam-se com febre, cefaléia, 
alterações gastrintestinais, esplenomegalia, erupções cutâneas, astenia e 
prostração. O desenvolvimento de anticorpos ocorre em 25% a 100% dos casos, 
dependendo da severidade da doença e da época da coleta da amostra. 
Aglutininas anti-O são as primeiras a surgir, por volta do 10º dia de doença, 
e desaparecem em 30 dias. 
As aglutininas anti-H surgem no fim da segunda semana com títulos 
ascendentes até a 30 dias, quando começam a declinar. A queda é lenta e podem 
persistir por anos. Diante de um quadro clínico sugestivo, a positividade das 
aglutininas anti-O é o dado de maior valor diagnóstico. 
A sorologia possui maior valor diagnóstico quando são coletadas duas 
amostras (fase aguda e convalescença), onde aumento nos títulos em quatro vezes 
é sugestivo da infecção. Em áreas endêmicas o valor diagnóstico de uma amostra é 
menor, sendo considerado a presença de títulos iguais ou maiores que 1:160 como 
indicativos de infecção aguda.
No caso da ocorrência de títulos baixos, sugere-se a repetição da reação 
após uma semana. Falso-negativos podem ocorrer na presença de perfuração 
intestinal, uso de antibióticos ou corticóides. 
10.1.VALORES DE REFERÊNCIA: 
 S. Paratyphi A até 1:80 
 S. Paratyphi B até.1:80 
 S. Typhi O até 1:80 
 S. Typhi H até 1:80 
10.2.SALMONELOSE
Salmonelose é uma toxinfecção alimentar. A pessoa infectada geralmente 
tem febre, cólicas abdominais e diarréia. A doença usualmente dura de 4 a 7 dias, e 
46
10.REAÇÃO DE VIDAL (TESTE DE AGLUTINAÇÃO DE LÁTEX EM LÂMINA)
a maioria das pessoas se recupera sem tratamento com antibiótico. Entretanto, a 
diarréia pode ser severa, e o paciente necessitar ser hospitalizado. Em pacientes 
idosos, crianças, gestantes e pessoas com sistema imune comprometido a doença 
pode ser mais grave. Nesses pacientes, a infecção pode se disseminar através da 
corrente sangüínea para outros sítios e pode causar a morte se a pessoa não for 
prontamente tratada com antibiótico.
Existem atualmente 2324 sorotipos de Salmonella dos quais 1367 
pertencem à subespécie entérica. Em relação aos seus antígenos, possui antígeno 
Somático (O) e antígeno Flagelar (H), que são de grande importância para sua 
identificação sorológica. Em contraste, S. tiphy e S. paratiphy só infectam os 
humanos causando a febre entérica. 
A transmissão ocorre por alimentos contaminados e ingeridos crus ou mal 
cozidos. Estes alimentos são freqüentemente de origem animal, sendo carne de 
frangos e principalmente ovos, os mais contaminados por S. Enteritidis.
O mecanismo de transmissão através do consumo de ovos intactos se dá pelas 
fezes eliminada pelas aves, contendo a bactéria, pode contaminar os ovos 
externamente. Porém, também foi constatado que a S. Enteritidis infecta os ovários 
de galinhas com aparência saudável, contaminando os ovos antes das cascas 
serem formadas (transmissão transovariana). Quando os ovos são ingeridos, 
insuficientemente cozidos ou crus (ex. maionese caseira) podem transmitir a 
infecção, ocasionando casos isolados ou surtos epidêmicos.
O período de incubação da doença é de 12 a 36 horas após a ingestão de 
alimento contaminado. 
10.3.FINALIDADE OU USO 
 É um teste de aglutinação de látex rápido para a identificação presuntiva de 
Salmonella. A utilização da tecnologia de Látex faz este teste mais sensível que 
métodos de aglutinação diretos, e ainda a utilização permite a confirmação 24 horas 
antes do que as técnicas convencionais. 
10.4.PRINCÍPIO DO TESTE
Durante o desenvolvimento de uma infecção humana por algum agente 
microbiologicamente patogênico, uma variedade de anticorpos são formados. Estes 
47
anticorpos são as aglutininas. Uma aglutinina quando combinada com antígenos é 
capaz de causar aglutinação. Esta aglutinação por agrupamento de bactérias, é 
visível macroscopicamente. Suas provas medem quantitativamente as aglutininas 
nos soros dos pacientes com febre tifóide. Esta prova ficou universalmente 
conhecida como teste de Widal.
Partículas de látex recobertas com antisoro polivalente preparado a partir 
de uma grande gama de antígenos flagelares de Salmonella. Quando misturado com 
uma suspensão de Salmonella que contém estes antígenos, as partículas de látex 
se aglutinam rapidamente formando aglomerações visíveis. O teste é reagente com 
a maioria das espécies de Salmonella comum, inclusive S. typhimurium e S. 
enteritidis. Para minimizar reações cruzadas com outras Enterobactérias, anticorpos 
para os antígenos somáticos são removidos durante a preparação do antisoro. Por 
conseguinte, o teste reage predominantemente com antígenos flagelares, embora o 
reativo reagirá com a espécie sem motilidade, S. pullorum e S. gallinarum.
10.5.PROCEDIMENTO
1º Etapa
Em uma lâmina de vidro transparente 10x20 cm, com uma pipeta de 0,2 ml 
pipetar 0,08/ 0,04/ 0,02/ 0,01 e 0,005 ml do soro.
2° Etapa
Coloque uma gota do antígeno apropriado para o teste em lâmina em cada 
gota do soro. Agite bem antes de usá-lo.
Fig.34
48
3° Etapa
Misture cada composição com um bastão aplicador, iniciando da menor 
para a maior diluição do soro.
4° Etapa
Agite a placa com movimentos de vai-e-vem 15 a 20 X.
5° Etapa
Observe a aglutinação dentro de 1 minuto com luz apropriada, (observar 
estritamente a limitação do tempo do teste).
Fig.35
Fig.36
Fig.37
49
10.6.RESULTADOS
Título “O” alto ou em elevação: infecção ativa.
Título “H” alto: vacinação anterior ou infecção prévia.
Título “Vi” alto: encontrado em alguns portadores.
11.1.INTRODUÇÃO
Gastroenterite viral é a segunda doença mais comum em países 
desenvolvidos, perdendo apenas para as doenças virais do trato respiratório 
superior.
O Rotavírus é reconhecido como o maior causador de diarréia e 
gastroenterites, particularmente em crianças, podendo levar a sérias conseqüências 
como desidratação e desequilíbrioeletrolítico. Como citado acima, os rotavírus são a 
causa mais freqüente de diarréia infecciosa em bebês e crianças jovens. Eles são os 
mais prevalentes em crianças com idade de 6 meses a 2 anos durante os meses de 
inverno, nessas crianças a doença tende a ser mais severa. Rotavírus causa 
ocasionalmente gastroenterite em idosos, especialmente naqueles que vivem em 
enfermarias e clínicas de repouso. Aglomerações de pessoas e baixa da imunidade 
são fatores contribuintes.
O período de infecção geralmente é de 1 a 2 dias e os aspectos clínicos 
incluem diarréia, vômito, febre e dor abdominal. Os sintomas de infecção podem 
Fig. 38
50
11.PESQUISA DE ROTAVÍRUS NAS FEZES
variar desde leves em adultos até graves em crianças jovens, especialmente em 
bebês hospitalizados.
O tratamento consiste basicamente na reposição de fluidos e eletrólitos por 
via oral ou intravenoso.
Devido ao fato de o Rotavírus não crescer em cultura de células, o 
diagnóstico era feito, até recentemente, pela detecção de partículas do vírus em 
amostras fecais utilizando-se microscopia eletrônica. Testes de aglutinação de látex 
e enzimáticos são, entre as técnicas atualmente disponíveis, as alternativas mais 
convenientes em relação à microscopia eletrônica.
 
11.2.FINALIDADE OU USO
Obter um diagnóstico laboratorial de gastroenterite por rotavírus. Os testes 
de aglutinação de látex são utilizados para detecção de Rotavírus em amostras 
fecais.
11.3.PRINCÍPIO DO TESTE
Partículas de látex são recobertas com anticorpos de coelho contra um pool 
de diferentes isolados de Rotavírus, incluindo o humano.
Quando as partículas sensibilizadas de látex são misturadas com a amostra 
fecal contendo antígenos de Rotavírus, estes reagirão resultando em uma 
aglutinação visível. 
Um Controle do Látex Reagente, sensibilizado com globulinas de coelho 
normais, vem incluído geralmente para identificação de reações inespecíficas que 
podem ocorrer com algumas amostras fecais. 
11.4.COLETA DAS AMOSTRAS
Fig. 39
51
A prova deve ser realizada antes que termine a semana na qual os sintomas 
apareceram, já que a partir do oitavo dia, o número de partículas víricas nas fezes 
decresce e, portanto as amostras serão menos reativas.
As amostras devem ser colhidas em frascos limpos e secos, livres de 
detergentes. A amostra recolhida deve ser representativa (2-3 ml).
 Pode também ser utilizada uma pequena escova para a coleta, desde que 
seja colhido no mínimo 0,2 ml.
 Uma vez coletada a amostra, esta deve ser armazenada à 4º C se a prova 
for feita no mesmo dia, do contrário a amostra deverá ser conservada à -20º C, sem 
prévia manipulação.
11.5.REAGENTES
−Reagente de látex teste
Partículas de látex sensibilizadas com anticorpos (geralmente de coelho) 
anti-Rotavírus.
−Reagente de látex controle
Partículas de látex sensibilizadas com globulinas (geralmente de coelhos) 
normais.
−Controle Positivo: Antígeno de Rotavírus bovino inativado.
−Cartões de Teste descartáveis.
−Misturadores descartáveis
11.6.ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
−Os reativos dos kit geralmente utilizados são unicamente para uso diagnóstico in 
vitro. 
−Não utilizar os reagentes após a data de validade.
−Não intercambiar reativos de lotes diferentes de kits.
−O teste deve ser unicamente realizado de acordo com as instruções do kit.
−Não pipetar amostras ou reagentes com a boca.
−Todas as amostras clínicas devem ser consideradas infecciosas e manipuladas 
e descartadas de acordo com as práticas usuais.
52
−O controle positivo foi preparado com Rotavírus inativado. Entretanto, deve ser 
considerado como potencialmente infectante e manipulado com os mesmos 
cuidados que as amostras clínicas.
 
11.7.PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
1° Etapa
Preparar uma suspensão com aproximadamente 10% de amostra fecal 
transferindo 0,1 ml (0,1g) da amostra em 1,0 ml de Tampão de Extração, em um 
tubo com tampa. Homogeneizar.
2° Etapa
Deixar a temperatura ambiente por 1-2 minutos antes de realizar o teste.
11.8.UTILIZAÇÃO DO CONTROLE POSITIVO
O Controle Positivo deve ser testado regularmente para garantir o correto 
funcionamento dos reagentes. O Controle vem pronto para uso e deve ser testado 
no lugar do extrato da amostra no Procedimento do teste.
11.9.PROCEDIMENTO
−Processar as amostras como descrito.
−Deixar os reagentes atingirem a temperatura ambiente.
−Centrifugar o extrato de amostra a 1000g por 10 minutos.
−Pipetar 50 ml do sobrenadante em duas demarcações do Cartão de Teste. 
−Adicionar 1 gota do Reagente Látex teste, bem homogeneizado, a uma das 
demarcações e 1 gota do Reagente Látex Controle à outra demarcação.
−Misturar o conteúdo de cada uma das demarcações utilizando um misturador 
separado para cada amostra, espalhando o conteúdo por toda a superfície.
−Girar devagar o cartão e observar a presença de aglutinação por até 2 minutos.
53
11.10.INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
a) Um resultado positivo é indicado pela aglutinação do Látex teste e a não 
aglutinação do Látex Controle.
b) Um resultado é negativo se não ocorrer aglutinação nem no Látex teste nem no 
Látex Controle.
Nota: a aglutinação no Reagente de Látex Controle indica uma reação inespecífica e 
que a amostra não pode ser utilizada por este método.
11.11.LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
−Os resultados obtidos com testes de aglutinação para pesquisa de Rotavírus 
devem ser avaliados em conjunto com outros dados clínicos e informações 
laboratoriais.
−Um teste positivo em testes de aglutinação não exclui a possibilidade de outras 
co-infecções microbianas.
−Os testes de aglutinação para Rotavírus são testes de fase aguda. Amostras 
fecais colhidas após a fase aguda poderão conter uma concentração de antígeno 
abaixo do limite de sensibilidade do reagente.
O teste de látex para pesquisa de Rotavírus também poderá ser feito 
utilizando-se lâminas.
Observe o seu procedimento
1° Etapa
Centrifugar a amostra. Transferir uma gota de sobrenadante em dois 
círculos da lâmina.
2° Etapa 
54
Homogeneizar o látex reativo (reagente), e utilizando o conta-gotas do 
frasco, adicionar uma gota da suspensão ao sobrenadante pipetado no primeiro 
círculo da lâmina (círculo de teste).
3° Etapa
Homogeneizar o látex controle, e utilizando a pipeta de 25μl com ponteira 
descartável, adicionar uma gota da suspensão ao sobrenadante pipetado no 
segundo círculo da lâmina (círculo de controle).
4° Etapa
Misturar o conteúdo de cada círculo, utilizando um bastão descartável para 
cada um deles, de modo a assegurar a total dispersão da mistura.
5° Etapa 
Através de movimentos circulares agitar suavemente a lâmina durante 2 
minutos, observando a presença de aglutinação.
Sinonímia: Reação intradérmica para leishmaniose
A leishmaniose é uma doença provocada por um protozoário (Leishmania 
spp), o qual é transmitido através da picada de um mosquito (Lutzomyia spp). 
Dependendo da espécie envolvida, provoca dois quadros distintos: a leishmaniose 
tegumentar (leishmaniose tegumentar americana, úlcera de Bauru, nariz de tapir, 
botão do oriente, ferida brava) e a leishmaniose visceral (leishmaniose visceral 
americana, calazar, esplenomegalia tropical, febre Dundun).
A doença originariamente estava restrita ao ambiente silvestre ou em 
pequenas localidades rurais. Todavia, as transformações ocorridas no meio 
ambiente, como desmatamento, expansão das áreas urbanas e condições precárias 
de habitação e saneamento, estão causando uma incidência crescente desta 
55
12.REAÇÃO INTRADÉRMICA DE MONTENEGRO
enfermidade em centros urbanos de médio porte, em área domiciliar ou peri-
domiciliar. É um crescente problema de saúde pública no país e em outras áreas do 
continente americano, sendo uma endemia em franca expansão