Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
Proteinas da Membrana do Globulo Vermelho - Metodos de Estudo ·TEREZAMARIA D. DE MEDEIROS ··ORLANDO CESAR DE O. BARREDa 1. INTRODU~Ao A vida media do eritr6cito e de 120 dias. Durante esse periodo, a fim de poder circular livremente na corrente sangiiinea, a gl6bulo vermelho apresenta considenivel resistencia e flexibilidade que the e conferida par uma rede de protein as situadas na face interna da membrana logo abaixo da bicamada lipidica (Figura A). A membrana do gl6bulo vermelho e constituida par 49% de proteinas, 43% de lipidios e 8% de carboidratos, cuja organiza«;ao destes componentes e essencial para a fun«;ao celular normal e sobrevivencia, alem de determinar as propriedades antigenicas da membrana (11). As proteinas da membrana se associam atraves de liga«;6es bem estabelecidas, configurando uma rede que confere a capacidade do eritr6cito em manter a sua forma e as suas propriedades. Dependendo de sua localiza«;ao em rela«;ao a bicamada lipidica, as proteinas presentes na membrana do gl6bulo , ,.om) c"'" 1 as glicoforinas (A, B e C), as quais transportam receptores de membra- na e antigenos (14). As proteinas perifericas sao as que estao localizadas na face citos6lica au intema da membrana, formando uma rede subjacente a membrana e interagem com protei- nas au por«;ao polar dos lipidios da superficie da membrana, porem mio penetram na camada lipidica. Assim, estas proteinas constituem a citoesqueleto da membrana e sao representadas pela espectrina, anquirina, actina. proteina 4.1. e proteina 4.9. alem da enzima gliceraldeido-3-fosfato desidro- genase (proteina 6) (1, 11). Portanto. as proteinas inte- grais sao aquelas que atravessam au penetram a membrana e as perifericas tern importancia na manuten«;ao da estrutura da mem- brana, formando a seu citoesqueleto. 2. PROTEiNAS PERIFERICAS ESPEQTRINA E a mais importante e a mais abundante do esqueleto da Figura A - Representayao esquematica da membrana eritrocitaria, mostrando a bicamada lipidica com as proteinas integrais imersas, e algumas proteinas perifericas do citoesqueleto (modificado de Singer e Nicholson, 1972). vermelho sao classificadas como proteinas integrais e perifericas (1). Sao chamadas proteinas integrais aquelas que possuem urn segmento hidrof6bico que interage com as lipidios da dupla camada lipidica e, muito freqiientemente assumem uma orienta«;ao trans- membrana com urn segmento polar glicosilado que se estende para fora do gl6bulo vermelho e urn outro segmento em cantata com a face citos6lica da membrana. Estas protein as incluem a protein a 3 (proteina transportadora de ions) e ·Prof. Adjunto do Universidode Federal do Rio Grande do Norte ··Prof. Associodo do Foculdode de Medicino do USP Pesquisodor 1-A do CNPq. Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce membrana eritrocitana. correspon- dendo cerca de 25 a 30% do total proteicodamembrana. Consiste de duas subunidades estruturalmente semelhantes.poremfuncionalmente distintas: alfa-espectrina (proteina 1) e beta-espectrina (proteina 2). com pesos moleculares de 240 e 220 kDa respectivamente (10, 12, 14).Decada uma dessas cadeias ha cerca de 200.000 moleculas par celula. As duas subunidades se associamdemaneira caracteristica: uma molecula de alfa-espectrina se liga par sua extremidade-NH2 a extremidade-COOH de uma mole cuI a de beta-espectrina formando-se a heterodimero. Cada heterodimero se associa lateral- mente a outro heterodimero, porem demodoinverso (anti-paralelo)para formar tetnlmeros e tambem oligomeros (Figura B). A forma GliCOFORINA C I BANDA 3 I eritr6ides), sendo intensa nos pr6- eritroblastos e prossegue ate a estagio de reticu16cito. A alfa- espectrina e produzida em quan- tidade quatro vezes maior que a beta-espectrina. No entanto, sao incorporadas a membrana em quantidades semelhantes, e a excesso de alfa-espectrina e catabolizado (12, 15). ANQUIRINA E a principal protein a da membrana envolvidana liga(,;aodo esqueleto da membrana a mem- brana. E uma proteina globular, embora assimetrica. com tres segmentos: urn deles com sitio de liga(,;aopara a proteina 3, outro com grande afinidade a beta-espectrina e urn segmento regulador das liga(,;oescom espectrina e banda 3 (1).Portanto, a anquirina permite a intera(,;ao entre a espectrina e a GUCOFORINA C I ~ ?-ESPECTRINA COMPLEXb JUNCIONAL j3-ESPECTRINA ~ COMPLEXO JUNCIONAL Figura B . Esquema mostrando a organiza9ao das espectrinas em heterodimeros (alfa espectrina . beta espectrina) e entre os heterodimeros, formando 0 tetramero de espectrina. tetramerica e a mais estavel e constitui a base do citoesqueleto. Ostetrfuneros sao, portanto. a prin- cipal forma de espectrina na membrana do g16bulovermelho (2). Ogeneda alfa-espectrina esta localizado no cromossomo 1 (segmento q22 e q25) enquanto a gene da beta-espectrina esta localizado no cromossomo 14 (10). Asintese de alfa e beta espectrinas se inicia no estagio de CFU-E (unidade formadora de colonias 82·lAES&HAES proteina 3. exercendo papel funda- mental na manuten(,;ao da estabi- lidade damembrana. Esta presente na quantidade de 100.000 mole- culas par cHula, na propor(,;aode uma molecula de anquirina para cada tetrfunero de espectrina (12). A anquirina do eritr6cito humano e atualmente considerada uma mistura de proteinas de tamanhos diferentes. A principal forma (proteina 2.1) e uma proteina de peso molecular de 210 kDa. Outras formas mais rapidas (proteinas 2.2, 2.3 e 2.6) sao facilmentedetectadas par colora(,;oes proteicas pradronizadas e sao varia(,;oesp6s-translacionais doRNA mensageiro (13). PROTEINA 4.1 A proteina 4.1 esta presente na quantidade de 200.000 c6pias par celula. e eresponsavel par cerca de 6% da proteina total da membrana (2,15).E importante na manuten(,;ao da estabilidade da membrana. E uma proteina com fun(,;ao marcadamente facilitadora de intera(,;oes; refor(,;a a liga(,;ao da espectrina aactina, eaintermediaria da liga(,;aoentre a espectrina e a glicoforina C, liga-se a banda 3 e estabelece liga(,;oescom as lipides carregados negativamente da superficie interna da bicamada lipidica (1). Na eletroforese em gel de poliacrilamida, pelo metoda de Laemmli,aparece sob duas formas, 4.1a e 4.1b com pesos moleculares de 80 e 78 kDa respectivamente (7). A forma 4.1 b predomina nos reticu16citos enquanto a proteina 4.1 a e a principal forma nos eritr6citos (2). PROTEINA 4.2 E responsavel par aproxima- damente 5% da proteina total da membrana e esta presente na quantidade de 200.000 moleculas par celula. Apresenta peso molecu- lar de 72 kDa e sua fun(,;aoparece ser importante em manter as liga(,;oesentre banda 3, anquirina e proteina 4.1 (16). PROTEINA 4.9 OU DEMATINA Tern peso molecular de 48 kDa e faz parte das proteinas do citoesqueleto do g16bulovermelho, juntamente comaespectrina, actina e proteina 4.1 (10). Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Nota HETERODÍMERO: subunidades deproteínas com polipeptídeos diferentes. nullnull dímero é uma proteína composta por duas subunidades Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce ACTINA (PROTEINA 5) Tern peso molecular de 43 kDa. A actina do gl6bulo vermelho encontra-se aproximadamente em cerca de 400.000 a 500.000 mole- culas por cHula. estando a maior parte associada ao citoesqueleto participando do complexojuncional constituido pelas protein as 4.1 e 4.9. glicoforina C, tropomiosina e aducina 0,2). PROTEINA 6 OU GLICERAL- DEIDO-3-FOSFATO DESIDRO- GENASE (GAPD) It uma enzima monomerica de peso molecular 35 kOa. Em condil;oes fisiol6gicas. dois ter.;:os da GAPOencontram-se ligados ao segmento citos6lico da proteina 3 na forma inativa; a forma ativa e a citos6lica livre (1). TROPOMIOSINA (PROTEINA 7) Atropomiosina eritrocitaria e constituida de dois polipeptideos de pesos moleculares 29 e 27 kOa respectivamente, estando presentes comodimeros em cerca de 70.000 a 80.000 moleculas por cHula, que corresponde a mais ou menos 1% do total de proteina da membrana eritrocitaria (2,12).Terna fun.;:aode estabilizar os filamentos de actina que se dispoem longitudinalmente ao longo da tropomiosina (1). ADUCINA A aducina e uma proteina associada ao citoesqueleto da membrana que contem duas subu- nidades alfa ebeta compesos mole- culares 103 e 97 kDa respectiva- mente. formando urn heterodimero presente na propor.;:ao de 30.000 moleculas por celula. Promove a liga.;:ao da espectrina a actin a associando-se a actin a e complexos espectrina-actina (2). 3. PROTEINAS INTEGRAlS PROTEINA3 84·LAES&HAES Tambem denominada protei- na transportadora de ions, e a proteina integral mais freqiiente na membrana dogl6bulovermelhocom cerca de 1.000.000demoleculaspor cHula, eeresponsavelporaproxima- damente 25% da quantidade total deproteinadamembrana. Ternpeso molecular de 90 a 100 kOa e provavelmente se encontra na membrana na forma de tetramero (8.10,12). A proteina 3 cataliza a troca de ions inorganicos atraves da bicamada lipidica. alem de facilitar o transporte de agua. Contem ainda determinantes antigenicos impor- tantes para especificidade dos grupos sangiiineos e reconhe- cimento de celulas senescentes. Finalmente. serve para ancorar 0 citoesqueleto a membrana atraves das proteinas anquirina e 4.1 (8). A por.;:ao citoplasmatica da proteina 3 e urn importante sitio de liga.;:ao para varias enzimas glicoliticas como a gliceraldeido-3- fosfato desidrogenase e aldolase, a hemoglobina e hemicromos (1). GLICOFORINAS As glicoforinas (sialoglico- proteinas) san urn grupo de pro- teinas transmembrana que consti- tuem os principais sialoglicopep- tideos da membrana do eritr6cito humano. Sao constituidas por 60% de carboidratos, com acido sialico comocarboidrato terminal (14).Sua por.;:aoextema contem grupos com cargas eletricas ou receptores. mantidos a uma distancia apro- priadadamembrana. Emsua por.;:ao citos6lica ajudam a ancorar e estabilizar 0 citoesqueleto atraves de suas liga.;:oescoma proteina 4.1. Sao identificadas atraves da colora.;:ao pelo acido peri6dico (base de Schiff-PAS), ap6s eletroforese em gel de poliacri- lamida e denominadas glicoforinas A. B e C (5). PROTEINA 4.5 It uma proteina integral envolvida no transporte da glicose nos eritr6citos O. 14). 4. METODOS DE ESTUDO a estudo das proteinas da membrana foi dificil inicialmente, em vista de sua insolubilidade em meio aquoso de for.;:a ionica fisiol6gica (5). Para estudar as proteinas da membrana. houve urn longo processo de desenvolvimento tecnol6gico.emque 0primeiropasso foiobter. ap6s hem6lise.membranas com pouca hemoglobina ligada, 0 que foi possivel gra.;:as a lavagem repetida dessas membranas com tampoes de baixa for.;:aionica. As prepara.;:oes resultantes. quase isentas de hemoglobina. puderam ser estudadas atraves de sua desnatura.;:ao e posterior eletro- forese em gel de poliacrilamida (1). Todas as proteinas da membrana dogl6bulovermelho san solubilizadas em SOS (sulfato de dodecil s6dico) e separadas por eletroforeseemgeldepoliacrilamida de acordo com0seu peso molecular (5).Amigra.;:aodas proteinas se faz do p610negativo para opositivo, e a separa.;:ao ocorre basicamente em fun.;:ao dos pesos moleculares, podendo ser identificadas as "bandas" ou proteinas 1, 2, 2.1, 3, 4.1.4.2.4.5.4.9.5.6 e 7 em ordem decrescente do seu peso molecular (Figura C). A analise das proteinas da membrana por eletroforeseemSOS- gel de poliacrilamida (SOS-PAGE) requer urn numero de precau.;:oes. Emvirtude damembrana dogl6bulo vermelho exibir atividade de varias enzimas proteoliticas e recomen- davel 0 uso de inibidores de protea- ses no tampao utilizadopara a hem6- lise e 0 preparo das membranas. as metodos de eletroforese emSOS-geldepoliacrilamida (SOS- Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Nota Contração muscular. Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Nota Células que estão envelhecendo e freando a divisão celular. Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce ~i'11-·ET'-ESI'ECTR'N' -2:3 ANQUIRINAS -2.6 -4.' DEMATINA -5 ACTIN" GLICERAlOEIOO - ;)- - FOSFATO DESIOROGENASE 1+1 Figura C - Representa98.0 esquematica das posi96es adotadas pelas proteinas da membrana eritrocitaria ap6s eletroforese em gel de poliacrilamida (SOS- PAGE). PAGE)utilizados para separac;;ao das proteinas da membrana sao a sistema de Laemmli (6) de tampao descontinuo e a sistema de Fairbanks (5) atraves de urn gradiente de gel de poliacrilamida. As proteinas sao analisadas ap6s colorac;;aocom azul de Coomassie e quantificadas par densitometria. Atraves desses metod as podem ser detectados disturbios protei cas da membrana que levam ao apare- cimentode anemias hemoliticas, tais como esferocitose e eliptocitose heredit<'i.ria. 4.1. PREPARO DO "GHOST" (membrana eritrocitaria) a sangue colhido em ACD e filtrado em coluna de algodao para remoc;;aodos leuc6citos segundo a tecnica de Beutler (3).as eritr6citos sao entao lavados tres vezes em soluc;;aode NaCl O,154M a 4°C, e em seguida feito a isolamento das membranas pelometoda deDodge e colaboradores (4).as eritr6citos sao lisados na proporc;;aode 1:40 a 4°C em tampao fosfato 5mMpH 8.0 com PMSF(fluoretode fenilmetil sulfonil) O,2mMcomo inibidor de proteases. Sao feitas sucessivas lavagens das membranas eritrocit<'i.riasnomesmo tampao de lise par centrifugac;;aoa 25.000gpor lOminutosa4°Catese obter "ghosts" brancos (isentos de hemoglobina). Devem ser conser- vadas a -70°Cquando nao utilizados logo em seguida. 4.2. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDAEMPRESENCA DE SDS (SDS-PAGE) Reagentes necessarios: eAcrilamida30%e Bisacrilamida0,8% eTampaoTris-HCll,5MpH8.8 eTampaoTris-HClO,5MpH6.8 eSoluc;aodeSDS10% eSolu¢odePersulfatodeAm6nia10%(APS) eTEMED(Tetrametiletilenodiamina) eTampaoTris-GlicinapH8.3comIOml/ LdeSDS 10% A eletroforese e realizada utilizando-se duas placas de vidro (l6xI4.5xO.4cm).ondeepreparado a gel, sendo a gel de corrida au separac;;ao(running gel)com 10%de acrilamida e a gel de alinhamento (stacking gel) com concentrac;;aode 3% onde se faz a molde para aplicac;;aodas amostras. Preparo do gel "Running" gel" Stacking" gel Agua bidestilada (mil 10,9 5,04 Tris-HClpH8.8 (ml) 6,75 Tris-HClpH6.8 (ml) 2,0 SDS10%(microlitroj 270 80 Acrilamida 300f0/BlS0,8% (ml) 9,0 1,0 APS 100mg/ml (microlitro) 89 130 TEMED (microlitro) 6,7 5,0 A acrilamida e polimerizada atraves do persulfato de am6nia, tendo como catalizador a TEMED. Para promover a ligac;;aoentre as filamentos de poliacrilamida, e adicionado N,N'-metileno-bisacri- lamida (BIS) e, como detergente solubilizante, sulfato de dodecil s6dico (SDS). Asolubilizac;;aodas proteinas do "ghost" e feita par adic;;aode soluc;;ao solubilizante contendo O,15Mde tampao Tris-HCl pH 6.8, glicerol 30%, SDS 3%, O,37M de ditiotreitol (DTDe a corante azul de bromofenol 0, 05% na proporc;;aode 1:2, e incubac;;ao em banho-maria fervente, durante 5 minutos. As amostras sao aplicadas no gel, em volumes contend a 80 microgramas de proteina determi- nadas pelo metoda de Lowry e colaboradores (9). A corrida eletroforetica e realizada a 25volts durante 18horas utilizando tampao Tris-glicina O,05MpH 8.3 comSDS. Acolorac;;ao e feita em soluc;;ao de azul de Coomassie 0,05% e a descolorac;;ao em acido acetico a 10%. As faixas reveladas sao lidas emdensit6metro, calculando-se as valores percentuais de cada banda protei ca. 4.2.2. Sistema de Fairbanks (5) It utilizado quando se quer obter alta resoluc;;aona separac;;ao das proteinas de alto peso molecu- lar (alfa e beta-espectrinas, anqui- rinas). A eletroforese e efetuada em gel de corrida com gradiente de concentrac;;ao de acrilamida de 3 a 17%distribuido com auxilio de uma bomba peristaItica. Acorrida eletro- foretica e feita em tampao Tris pH 7.4 com acetato de s6dio, EDTAe SDS. A quantidade de proteina aplicada na cavidade do gel e de 100 microgramas e a tempo de corrida 24 horas. Alem dos metodos de eletro- forese citados, as protein as podem ser extraidas da membrana. As proteinas integrais, que estao emaranhadas na bicamada lipidica, sao extraidas atraves de detergentes fortes como a Triton X-I00; ja as proteinas perifericas sao extraidas par intermedio de tamp6es de concentrac;;ao e pH variaveis (1). Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Nota DENSITOMERIA: densidade óptica em chapa fotográfica. Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Nota PROTEASE: enzima que quebra a ligação de proteínas. Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce Luana Carvalho Realce agem de drogas de abuso: rio em um painel Triage-7 1. BARRETIO. O.C. de O. - Disturbiosproteicos das anemias esferociticas e eliptociticas. BOLETIMvol. XIV (159): 10- 16. 1992. 2.BENNETI. V. - The spectrin-actinjunction of erythrocyte membrane skeletons. Biochim.Biophys. Acta 988:107. 1989. 3. BEUTLER, E. and WEST. C. - The removal of leukocytes and platelets from whole blood. J.Lab.Clin.Med. 88(2):328-333. 1976. 4. DODGE, J.T.; MITCHELL. C. and HANAHAN. D.J. - The preparation and chemical characteristics of hemoglobin- free ghosts of human erythrocytes. Arch.Biochem.Biophys. 100: 119-130. 1963. 5. FAIRBANKS. G.; STECK, T.L. and WALLACH. D.F.H.- Electrophoretic analysis of the major polipeptides of the human erythrocyte membrane. Biochem- istry 10(l3):2606. 1971. 6. LAEMMLI, U.K. - Cleavage of structural proteins during assembly of the head bacteriophageT4. Nature 227:680,1970. 7. LID, S.C. and DERICK, L.H. - Molecular anatomy of the red cell membrane skel- eton: stn:~ture-function relationships. Seminars in Hematology. 29(4): 231-243, 1992. 8. LOW. P.S. - Structure and function of the cytoplasmic domain of band 3: center of erythrocyte membrane peripheral pro- tein interactions. Biochim. Biophys. Acta 864:145-167. 1986. 9. LOWRY.O.H.; ROSEBROUGH. N.J.; FARR. A.L.; RANDALL. R.J.- Protein measure- ment with the folin phenol reagent. J.Biol.Chem. 193:265-275. 1951. 10. LUX, S.E. and BECKER, P.S. - Disorders of the red cell membran ske1eton:Hereditary spherocytosis and hereditary elliptocytosis. In: SCRIVER, C.R. et al. - The metabolic basis ofinher- ited disease. V.2.6. ed. N.York. McGraw- Hill. 1989. 11. MCKENZIE. S.B. - Textbook of Hematol- ogy. Lea Febiger, Philadelphia. 1988. 12. PALEK. J. and LAMBERT. S. - Genetics of the red cell membrane skeleton. Semi- narsinHemato1ogy27(4):290-332.1990. 13. PETERS. L.L. and LUX, S.E.- Ankyrins:structure and function in nor- mal cells and hereditary spherocytes. Seminars in hematology 30(2):85-118. 1993. 14. SCHRIER, S.L. - Red cell membrane biology. Clinics in Hematology 14(l): 1- 12. 1985. 15. SILVEIRA. P.A. - Contribui<;ao ao estudo das anemias por defeito proteico da membrana eritrocitaria com 0 uso de e1etroforese em gel de poliacrilamida. Tese de Doutorado. Hematologia FMUSP. 1992. 16. YAMATA,Y. - Red cell membrane protein band 4.2: phenotypic. genetic and elec- tron microscopic aspects. Biochim. Biophys. Acta.1204:131-148. 1994. MULTIMMUNOASSAY IATM) com proceclirnjnto de detec~aopatenteado • Rapido: 7/8 Resultados em 10 mi- nutos • Seguro: Os Resultados dos testes soo garantidos pela leitu- ra dos controles integra- dos • Especifico: 21 anticorpos mono- c10nais selecionados Triage"7 • Visual: Resultados precisos que podem ser lidos sem equi- pamentos adicionais • Simples: Facil de utilizar, em qual- quer lugar. • Completo: Noo soo necessarios Reativos auxiliares Diagnostica MERCK Estrada dos Bandeirantes, 1099 22710- 571 - Rio de Joneiro - RJ Tel: (0211 444-2000/fox; (0211 445-2263 Servi<;ode Atendimento aD Cliente Toll free; 0800-219292
Compartilhar