4_ relatório de cromato
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4_ relatório de cromato


DisciplinaCromatografia e Espectroscopia8 materiais362 seguidores
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
ANA HELENA ROCHA
FERNANDA CRISTINA COSTA SCHAFF
SEPARAÇÃO DOS PIGMENTOS EXTRAÍDOS DA FOLHA DE BETERRABA POR
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
CURITIBA
2014
INTRODUÇÃO
A cromatografia em coluna costuma ser citada como o mais antigo procedimento cromatográfico. Foi descrito pela primeira vez pelo botânico russo M. S. Tswett, que o utilizou para o isolamento dos pigmentos existentes nas folhas verdes dos vegetais.
Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plástico, preenchida com um adsorvente adequado. O adsorvente pode ser colocado na coluna diretamente (seco) ou suspendido em um solvente adequado (geralmente o próprio eluente a ser usado no processo de separação). Os principais adsorventes normalmente utilizados são a sílica gel, a alumina, o carbonato de cálcio, o óxido de magnésio, o carvão ativado, a sacarose e o amido, entre outros.
A substância a ser separada ou analisada é colocada na coluna pela parte superior e o eluente é vertido após, em quantidade suficiente para promover a separação. A coluna pode ser um simples tubo de vidro, aberto em ambas as extremidades, ou semelhante a uma bureta. Em alguns casos aplica-se vácuo pela parte inferior da coluna ou uma ligeira sobrepressão pela parte superior da mesma.
Quando a amostra a ser cromatografada possui cor, pode-se visualizar as diferentes zonas coloridas descendo pela coluna, que são recolhidas, separadamente, pela extremidade inferior.
Quando a amostra não possui cor, recolhem-se várias frações iguais de eluente, testando-as quanto à presença ou não de substâncias dissolvidas através do uso de reveladores adequados (luz UV, reveladores químicos, etc.).
OBJETIVO
Desenvolver a separação dos componentes de uma mistura de pigmentos presente em folhas de beterraba utilizando a técnica de cromatografia de camada em coluna.
PARTE EXPERIMENTAL
Foi preparada uma coluna cromatográfica, em que no fundo da coluna foi colocado um pequeno chumaço de algodão e em seguida a coluna foi presa em um suporte e aos poucos foi-se adicionando sílica em suspensão, para que fosse feito o empacotamento da coluna;
A suspensão de sílica foi preparada com a adição de 3g de sílica em cerca de 10mL de fase móvel (hexano e acetato de etila (2:1, v/v));
Enquanto a sílica ia empacotando na coluna, a fase móvel deveria ser reposta constantemente, para que a sílica não secasse no interior da coluna;
Depois de feito o empacotamento, a coluna foi preenchida com fase móvel e em seguida foi feito o controle da vazão, com o auxílio de uma proveta;
A vazão foi controlada da seguinte maneira: observou-se em triplica quantos mL escoavam em 1 minutos e a vazão encontrada foi de 0,5mL/min;
Após isso, foi escoada a fase móvel, com o cuidado de que quando ela atingisse a sílica parasse o escoamento;
A partir daí, foi colocada, com o auxílio de uma pipeta de Pauster, a amostra concentrada de folhas de beterraba;
Esperou-se que a amostra penetrasse em toda a sílica e após isso, a coluna foi preenchida com a fase móvel (hexano e acetato de etila (2:1, v/v)). Lembrando que a coluna não ficava vazia, pois a fase móvel era reposta constantemente;
Houve separação dos pigmentos em bandas dentro da coluna e cada pigmento foi escoado em intervalos de tempos diferentes e eles foram separados em béqueres isolados.
RESULTADOS 
TABELA 1 \u2013 Comportamento cromatográfico dos componentes presentes no extrato em DCM das folhas de beterraba.
	Componente (pigmento)
	Tempo de eluição (min)
	Volume de eluição (mL)
	Tempo de retenção (min)
	
	
	Início
	Fim
	
	
	
	Xantofila
	8:07
	8:08
	
	1
	
	Verde-musgo
	8:09
	8:18
	
	10
	
	Verde bandeira
	8:18
	8:24
	
	6
	
	Amarelo
	8:32
	8:46
	
	14
	
Figura 1: Cromatografia em Coluna do extrato concentrado de folhas de beterraba
Figura 2: Separação dos pigmentos da amostra. Da esquerda para a direita, \u3b2-caroteno, clorofila a, clorofila b e xantofila.
DISCUSSÃO
A cromatografia em coluna possui como princípio básico as interações moleculares e a diferença entre a polaridade das moléculas. E nela utilizou-se como fase estacionária uma suspensão de sílica-gel G 60 e sílica cromatográfica, o que confere um certo grau de polaridade a essa fase. Na fase móvel, foi utilizada uma mistura de hexano e acetato de etila (2:1, v/v), o que confere a essa fase um caráter mais apolar. Ao se adicionar a amostra e em seguida a fase móvel, observa-se que as clorofilas e xantofilas, com certo caráter polar, interagem bem com a fase estacionária.  Já o \u3b2-caroteno, por ser apolar, não interage muito bem com a fase estacionária, entretanto, interage bem com a fase móvel, que tem caráter mais apolar. Desse modo, elui mais facilmente que os outros pigmentos. Com a adição contínua de a fase móvel, o primeiro eluente a ser recolhido no béquer será o \u3b2-caroteno, enquanto as clorofilas e xantofilas ficam retidas na fase estacionária. Para que esses pigmentos eluíssem e fossem recolhidos no béquer, seria necessário utilizar uma fase móvel que interagisse melhor com esses pigmentos, ou seja, que apresentasse um caráter polar semelhante ao desses pigmentos. 
Figura 3: estrutura do \u3b2-caroteno
R = CH3 para clorofila a e R = CHO para clorofila b
Figura 4: estrutura da clorofila
Figura 5: estrutura da xantofila
A faixa amarela na parte inferior da coluna é devida à concentração de \u3b2-caroteno, que é um pigmento amarelo. A faixa verde mais clara acima é devida à concentração das clorofilas a e b, que são pigmentos de cor verde intenso e das xantofilas, que são pigmentos amarelos. 
Figura 6: Cromatografia em Coluna do extrato concentrado de folhas de beterraba.
Na figura 6 observa-se a mancha branca entre as bandas dos pigmentos, porque o empacotamento foi feito de maneira irregular, ou seja, em etapas. Isso ocorreu porque foi preciso repor a fase móvel (mistura de hexano e acetato de etila (2:1, v/v)) que estava na mistura com a sílica fase móvel. Já a figura 1 mostra uma coluna em que o empacotamento foi feita de maneira correta, não deixando a sílica secar coluna.
A cromatografia em coluna tende a ser diferente da cromatografia em camada delgada e o que ocorre nela não é reproduzido na coluna, porque na cromatografia em coluna há muito mais fase móvel difundida na amostra. 
Outra coisa que intrigante é por que a sílica da cromatoplaca não cai e a sílica da coluna cai quando seca. A resposta é simples, na sílica da cromatoplaca há um percentual de gesso (CaSO4), e esse gesso interage com duas moléculas de água, para que a sílica fique retida na placa. Já a sílica da coluna não entrou em contato com a água, e sim em contato direto com a fase móvel. 
Em relação a difusão dos pigmentos nas cromatografias em camada delgada e coluna, eles se difundem de maneira desigual. Na CCD, a difusão não é limitada (difusão radial), mas a mancha tem um caminho limitado, podendo percorrer o caminho até onde se encontra a sílica. Já na cromatografia em coluna, a difusão é limitada, pois os pigmentos só tem até o limite das paredes da coluna para se difundir, e isso faz com que eles se difundam por toda a sílica e para baixo (difusão longitudinal ou molecular).
CONCLUSÃO
A partir da extração por meio de cromatografia em coluna, foi possível separar os componentes orgânicos (pigmentos) das folhas de beterraba, que era o objetivo da aula. A diferença de polaridade das moléculas e as possíveis interações intermoleculares são responsáveis por promover essa separação. Desse modo, é imprescindível o conhecimento da estrutura química das moléculas para que seja possível compreender os processos que ocorrerem.