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4_ relatório de cromato

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
ANA HELENA ROCHA
FERNANDA CRISTINA COSTA SCHAFF
SEPARAÇÃO DOS PIGMENTOS EXTRAÍDOS DA FOLHA DE BETERRABA POR
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
CURITIBA
2014
INTRODUÇÃO
A cromatografia em coluna costuma ser citada como o mais antigo procedimento cromatográfico. Foi descrito pela primeira vez pelo botânico russo M. S. Tswett, que o utilizou para o isolamento dos pigmentos existentes nas folhas verdes dos vegetais.
Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plástico, preenchida com um adsorvente adequado. O adsorvente pode ser colocado na coluna diretamente (seco) ou suspendido em um solvente adequado (geralmente o próprio eluente a ser usado no processo de separação). Os principais adsorventes normalmente utilizados são a sílica gel, a alumina, o carbonato de cálcio, o óxido de magnésio, o carvão ativado, a sacarose e o amido, entre outros.
A substância a ser separada ou analisada é colocada na coluna pela parte superior e o eluente é vertido após, em quantidade suficiente para promover a separação. A coluna pode ser um simples tubo de vidro, aberto em ambas as extremidades, ou semelhante a uma bureta. Em alguns casos aplica-se vácuo pela parte inferior da coluna ou uma ligeira sobrepressão pela parte superior da mesma.
Quando a amostra a ser cromatografada possui cor, pode-se visualizar as diferentes zonas coloridas descendo pela coluna, que são recolhidas, separadamente, pela extremidade inferior.
Quando a amostra não possui cor, recolhem-se várias frações iguais de eluente, testando-as quanto à presença ou não de substâncias dissolvidas através do uso de reveladores adequados (luz UV, reveladores químicos, etc.).
OBJETIVO
Desenvolver a separação dos componentes de uma mistura de pigmentos presente em folhas de beterraba utilizando a técnica de cromatografia de camada em coluna.
PARTE EXPERIMENTAL
Foi preparada uma coluna cromatográfica, em que no fundo da coluna foi colocado um pequeno chumaço de algodão e em seguida a coluna foi presa em um suporte e aos poucos foi-se adicionando sílica em suspensão, para que fosse feito o empacotamento da coluna;
A suspensão de sílica foi preparada com a adição de 3g de sílica em cerca de 10mL de fase móvel (hexano e acetato de etila (2:1, v/v));
Enquanto a sílica ia empacotando na coluna, a fase móvel deveria ser reposta constantemente, para que a sílica não secasse no interior da coluna;
Depois de feito o empacotamento, a coluna foi preenchida com fase móvel e em seguida foi feito o controle da vazão, com o auxílio de uma proveta;
A vazão foi controlada da seguinte maneira: observou-se em triplica quantos mL escoavam em 1 minutos e a vazão encontrada foi de 0,5mL/min;
Após isso, foi escoada a fase móvel, com o cuidado de que quando ela atingisse a sílica parasse o escoamento;
A partir daí, foi colocada, com o auxílio de uma pipeta de Pauster, a amostra concentrada de folhas de beterraba;
Esperou-se que a amostra penetrasse em toda a sílica e após isso, a coluna foi preenchida com a fase móvel (hexano e acetato de etila (2:1, v/v)). Lembrando que a coluna não ficava vazia, pois a fase móvel era reposta constantemente;
Houve separação dos pigmentos em bandas dentro da coluna e cada pigmento foi escoado em intervalos de tempos diferentes e eles foram separados em béqueres isolados.
RESULTADOS 
TABELA 1 – Comportamento cromatográfico dos componentes presentes no extrato em DCM das folhas de beterraba.
	Componente (pigmento)
	Tempo de eluição (min)
	Volume de eluição (mL)
	Tempo de retenção (min)
	
	
	Início
	Fim
	
	
	
	Xantofila
	8:07
	8:08
	
	1
	
	Verde-musgo
	8:09
	8:18
	
	10
	
	Verde bandeira
	8:18
	8:24
	
	6
	
	Amarelo
	8:32
	8:46
	
	14
	
Figura 1: Cromatografia em Coluna do extrato concentrado de folhas de beterraba
Figura 2: Separação dos pigmentos da amostra. Da esquerda para a direita, β-caroteno, clorofila a, clorofila b e xantofila.
DISCUSSÃO
A cromatografia em coluna possui como princípio básico as interações moleculares e a diferença entre a polaridade das moléculas. E nela utilizou-se como fase estacionária uma suspensão de sílica-gel G 60 e sílica cromatográfica, o que confere um certo grau de polaridade a essa fase. Na fase móvel, foi utilizada uma mistura de hexano e acetato de etila (2:1, v/v), o que confere a essa fase um caráter mais apolar. Ao se adicionar a amostra e em seguida a fase móvel, observa-se que as clorofilas e xantofilas, com certo caráter polar, interagem bem com a fase estacionária.  Já o β-caroteno, por ser apolar, não interage muito bem com a fase estacionária, entretanto, interage bem com a fase móvel, que tem caráter mais apolar. Desse modo, elui mais facilmente que os outros pigmentos. Com a adição contínua de a fase móvel, o primeiro eluente a ser recolhido no béquer será o β-caroteno, enquanto as clorofilas e xantofilas ficam retidas na fase estacionária. Para que esses pigmentos eluíssem e fossem recolhidos no béquer, seria necessário utilizar uma fase móvel que interagisse melhor com esses pigmentos, ou seja, que apresentasse um caráter polar semelhante ao desses pigmentos. 
Figura 3: estrutura do β-caroteno
R = CH3 para clorofila a e R = CHO para clorofila b
Figura 4: estrutura da clorofila
Figura 5: estrutura da xantofila
A faixa amarela na parte inferior da coluna é devida à concentração de β-caroteno, que é um pigmento amarelo. A faixa verde mais clara acima é devida à concentração das clorofilas a e b, que são pigmentos de cor verde intenso e das xantofilas, que são pigmentos amarelos. 
Figura 6: Cromatografia em Coluna do extrato concentrado de folhas de beterraba.
Na figura 6 observa-se a mancha branca entre as bandas dos pigmentos, porque o empacotamento foi feito de maneira irregular, ou seja, em etapas. Isso ocorreu porque foi preciso repor a fase móvel (mistura de hexano e acetato de etila (2:1, v/v)) que estava na mistura com a sílica fase móvel. Já a figura 1 mostra uma coluna em que o empacotamento foi feita de maneira correta, não deixando a sílica secar coluna.
A cromatografia em coluna tende a ser diferente da cromatografia em camada delgada e o que ocorre nela não é reproduzido na coluna, porque na cromatografia em coluna há muito mais fase móvel difundida na amostra. 
Outra coisa que intrigante é por que a sílica da cromatoplaca não cai e a sílica da coluna cai quando seca. A resposta é simples, na sílica da cromatoplaca há um percentual de gesso (CaSO4), e esse gesso interage com duas moléculas de água, para que a sílica fique retida na placa. Já a sílica da coluna não entrou em contato com a água, e sim em contato direto com a fase móvel. 
Em relação a difusão dos pigmentos nas cromatografias em camada delgada e coluna, eles se difundem de maneira desigual. Na CCD, a difusão não é limitada (difusão radial), mas a mancha tem um caminho limitado, podendo percorrer o caminho até onde se encontra a sílica. Já na cromatografia em coluna, a difusão é limitada, pois os pigmentos só tem até o limite das paredes da coluna para se difundir, e isso faz com que eles se difundam por toda a sílica e para baixo (difusão longitudinal ou molecular).
CONCLUSÃO
A partir da extração por meio de cromatografia em coluna, foi possível separar os componentes orgânicos (pigmentos) das folhas de beterraba, que era o objetivo da aula. A diferença de polaridade das moléculas e as possíveis interações intermoleculares são responsáveis por promover essa separação. Desse modo, é imprescindível o conhecimento da estrutura química das moléculas para que seja possível compreender os processos que ocorrerem.