Orgânica experimental - extração de pigmentos vegetais

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UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI 
DEPARTAMENTO DE QUIMICA – FACET 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ATIVIDADE 2: CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC): 
EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO DE PIGMENTOS 
VEGETAIS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Disciplina: Química Orgânica I Turma: QUI008 
Data do experimento: 21/11/2014 Data de entrega: 05/12/2014 
Professor: Rodrigo Moreira Verly 
 
Autores: 
Bárbara Madureira da Silveira 
Emiliana da Silva Ávila 
Kamylla Lima 
Stéfany Souza Campos 
Tatielle Caroline Silva 
 
 
Diamantina 
2º Semestre / 2014 
1. INTRODUÇÃO: Os termos e expressões “cromatografia, “cromatograma e “métodos 
cromatográficos” são atribuídos ao botânico Russo Michael Semerovich Tswett, que, em 
1906, os utilizou em dois trabalhos que descrevem suas experiências na separação dos 
componentes de folhas, nas quais usou uma coluna de vidro recheada com vários sólidos, 
finamente divididos e arrastou os diversos componentes com éter de petróleo. Os 
termos derivam das palavras gregas chrom (cor) e graphe(escrever), embora o processo 
não dependa da cor, exceto para facilitar a identificação dos componentes separados.1 
Entre os vários tipos de cromatografia tem-se a cromatografia liquida clássica, e esta 
utiliza uma coluna de vidro de diâmetro interno de 10 cm ou maior, recheada com 
partículas de 600 a 200 µm. A fase móvel, denominada eluente, flui através da coluna 
devido a força gravitacional ou com aplicação de pressão reduzida. O recheio da coluna 
é utilizado normalmente, uma só vez, porque partes da amostra geralmente adsorve de 
uma forma irreversível.² A sílica, material altamente poroso, é seguramente um dos 
adsorventes mais utilizados em cromatografia. Apresenta caráter fracamente ácidos, que 
pode ser aumentado pela presença de impurezas ácidas, podendo ocorrer como 
consequência fenômenos de quimiossorção de bases ou reação ácido-catalisadas das 
amostras.³ Em geral a sílica é empregada na separação de compostos lipofílicos como 
aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos graxos, aminoácidos, alcaloides, terpenóides e 
esteroides. Os pigmentos de alguns vegetais podem ser separados por meio da 
cromatografia em coluna. Um exemplo de vegetal rico em pigmentos como β caroteno, 
clorofila A, B e o espinafre. Utilizando amostras que possuem cor, pode-se visualizar as 
diferentes cenas coloridas descendo pela coluna, que são recolhidas separadamente. No 
extrato de espinafre podem ser observados duas cores. A primeira banda possui maior 
afinidade pela fase móvel, e possui coloração amarelada devido à presença de xantofila, 
um pigmento baseado no caroteno (Fig.1). A segunda banda a ser separada exibe uma 
coloração verde devido à presença de clorofila, que são moléculas formadas por 
complexos derivados da porfirina, tendo como átomo central o Mg. Esse composto é uma 
estrutura macrocíclica assimétrica totalmente insaturada. As clorofilas A e B encontram-
se na natureza numa proporção de 3:1, respectivamente e diferem nos substituintes de 
carbono C-3. Na clorofila A, o anel de porfirina contém um grupo metil (CH3) no C-3 e a 
 
1 COLLINS, H. Fundamentos de cromatografia p.18 
2 COLLINS, H. Fundamentos de cromatografia p.275 
3 COLLINS, H Fundamentos de cromatografia p.68 
4 STREIT, N. em: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0103-84782005000300043&script=sci_arttext 
clorofila B contém um grupo aldeído (-CHO) que substitui o grupo metil (Fig.2)4. As 
xantinas, ou xantofilas, apesar dos grupos hidroxila, possuem uma cadeia carbônica 
relativamente longa responsável pela pouca afinidade com a sílica. Por outro lado, as 
estruturas das clorofilas A e B, apresentam um metal (magnésio) no centro de uma 
porfirina, (uma substância que contém quatro unidades ligeiramente modificadas de 
pirrol) e favorecem interações mais fortes com a fase estacionária. 
OH
OH
CH3
CH3
CH3 CH3 CH3
CH3 CH3
CH3
CH3 CH3
Figura 1: Estrutura da Xantofila.
 
 
R
CH3
O
O
O
CH3
N
Mg
2-
N
CH3
N
+
O
O
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
N
+
CH3
CH2 Clorofila A: R= ----CH3
Clorofila B: R= ----CHO
Figura 2: Estrutura da Clorofila
 
2. OBJETIVO: Separar os pigmentos (clorofilas e carotenos) presentes no extrato de 
espinafre e analisar as amostras por meio de cromatogramas para confirmar a presença 
dos referidos compostos. 
 
3. MATERIAIS E METODOS: 
3.1 Materiais Utilizados: 
1) coluna cromatográfica com torneira 
2) pipeta de Pasteur 
3) bastão de vidro 
4) garra para bureta 
5) béqueres de 50 e 250 ml 
6) erlenmeyer de 125 ml 
7) grau e pistilo 
8) proveta de 100 ou 250 ml 
9) balão de fundo redondo de 100 ml 
10) funil de vidro 
11) suporte universal 
12) chapa de aquecimento 
13) algodão 
14) papel toalha 
15) papel filme 
16) evaporador rotativo 
3.2 Reagentes Utilizados: 
1) sílica gel 60 
2) hexano 
3) éter etílico 
4) água destilada 
5) gelo 
4.PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 4.1 Empacotamento da coluna 
Fixou-se a coluna de vidro verticalmente em um conjunto suporte conforme o esquema 
representado abaixo. Fechou-se a torneira e transferiu-se cerca de 10mL de hexano, 
introduziu-se um pequeno chumaço de algodão, empurrou-se com um tubo de vidro até 
o corpo do tubo conectar-se com a torneira, evitando-se que pequenas partículas saíssem 
com o eluente. Adicionou-se mais solvente (aproximadamente ⅓ de seu volume), pesou-
se aproximadamente 5g de sílica e adicionou-se a suspensão da mesma a solução. Para 
evitar-se a quebra no empacotamento fez-se a transferência sem interrupção, acomodando 
o adsorvente homogeneamente. 
Abriu-se a torneira e deixou-se escoar o líquido. Ao gotejar a fase móvel, foi necessário 
continuar adicionando-se eluente para evitar trincas na coluna. Uma importante 
observação é que não houve mistura entre o eluente recolhido e reaproveitado para 
umedecer a coluna e a primeira parte da amostra analisada. Completou-se a transferência 
da suspensão até atingir o topo da fase estacionária. 
 
50
40
30
20
10
0
Coluna de Silica
Composto separado
Algodão
Figura 3: Montagem do conjunto suporte.
Eluente
 
 
 
4.2 Preparo do extrato 
A apostila indicou o uso de 10g de folhas de espinafre, porém essa quantidade não foi 
medida, utilizou-se uma medida suficiente para atender a todos os grupos. Removeu-se 
as nervuras centrais do espinafre e ao invés de ferver as folhas em água destilada como 
indicado na apostila, adicionou-se Acetona PA (Reagente Analítico-A.C.S , PM:58.08) e 
Éter (CAS [60-29-7] P.M 74,12) na proporção de 3:1 respectivamente. Macerou-se a 
mistura em grau de porcelana e pistilo até obter uma solução verde (fig.4). Transferiu-se 
a solução para um béquer pequeno. 
 
Figura 4: preparação do extrato de espinafre. 
4.3 Eluição da coluna cromatográfica 
Transferiu-se a solução para o topo do recheio e utilizando uma pipeta de Pasteur, com o 
devido cuidado para não furar a camada superior do adsorvente e nem escorrer extrato 
pela parede da coluna. Abriu-se a torneira até a solução atingir o topo do recheio. Fechou-
a e adicionou-se um pouco de éter de petróleo utilizando-se uma pipeta de Pauster, para 
lavar a parede da coluna (fig.5). Abriu-se novamente a torneira de modo que o solvente 
atingisse o topo. Fechou-se a torneira e adicionou-se eluente para manter a umidade da 
coluna. Ao começar a eluição recolheu-se em um béquer a primeira banda ao sairda 
coluna. Após a saída da primeira banda o béquer foi substituído para coletar uma segunda 
fração da amostra, que não era a que continha a clorofila. Esta foi recolhida apenas para 
posterior análise, no caso do primeiro béquer não conter nenhum dos pigmentos 
analisados. Por último, recolheu-se em um terceiro béquer o composto de tonalidade mais 
escura, terceira fração do eluato. Os béqueres contendo as amostras foram levados para a 
análise em um espectrofotômetro. 
 
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO: A separação seria feita a partir do princípio que 
uma das substâncias teria maior afinidade pela fase móvel e a outra pela fase estacionária. 
No entanto, durante a separação não houve diferença visível na separação das bandas. 
Uma fina camada de substância amarelada foi observada a em um primeiro instante, mas 
desapareceu depois de pouco tempo. Isso dificultou a realização do procedimento, uma 
vez que as xantofilas, que deveriam ser identificadas primeiro não foram devidamente 
coletadas. Isso não descartava a possibilidade da amostra conter a substância de interesse 
porém em baixas concentrações, por isso as primeiras parcelas do eluente a sair foram 
coletadas para análise em um espectrofotômetro. A substância de cor esverdeada se 
espalhou por toda a coluna impossibilitando a identificação de outros compostos. Após o 
a coleta do pigmento esverdeado, três amostras foram levadas à análise no 
espectrofotômetro. A duas primeiras amostras, de coloração límpida, não apresentaram 
picos no gráfico da espectrofotometria, o que descarta a possibilidade de conter 
xantofilas, ainda que em baixa quantidade. A terceira amostra, de coloração verde gerou 
um gráfico com comprimento de onda característico da clorofila. Isso confirma a presença 
desta molécula na amostra que foi analisada. 
 
6. CONCLUSÃO: Este trabalho aborda os resultados do experimento de cromatografia 
em coluna, realizados por meio da extração de pigmentos das folhas de espinafre. Na 
separação dos pigmentos foram utilizados inicialmente éter para a separação de xantofilas 
e a mistura de éter e álcool para a retirada de clorofila. O experimento nos permite entrar 
em contato com vários conceitos envolvidos, desde a extração de compostos de plantas 
utilizando solventes até a cromatografia do extrato obtido. Conceitos como: polaridade, 
solubilidade, adsorção, entre outros foram abordados e discutidos durante a prática. Como 
apenas uma das substâncias de interesse pôde ser identificada, o procedimento não foi 
completamente satisfatório. O espinafre utilizado na prática era uma planta muito nova, 
e a sua produção de xantofilas ainda era baixa, o que pode ter contribuído para que esse 
composto não fosse identificado. Erros na proporção dos solventes utilizados para a 
extração do extrato também podem ser considerados. 
 
 
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
1- COLLINS, C. H.; BRAGA, G.L E BONATO, P.S. Fundamentos de Cromatografia, 
3ª ed, p-18, 2010. 
2- COLLINS, C. H.; BRAGA, G.L E BONATO, P.S. Fundamentos de Cromatografia, 
3ª ed, p-275, 2010 
3- COLLINS, C. H.; BRAGA, G.L E BONATO, P.S. Introdução a métodos 
cromatográficos, pag.68. Campinas: Editora da Unicamp 1997 
4 – STREIT, N.; CANTERLE. L.; CANTO. M.; HECTHEUER. H; Ciência Rural, 
Clorofilas. Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0103-
84782005000300043&script=sci_arttext 
ALLINGER, N.L.; CAVA, M.P.; DE JONGH, D.C.; LEBEL, N.A. e STEVENS, C.L. 
Química Orgânica. Trad. R.B. de Alencastro. Rio de Janeiro: Guanabara Dois, 1976 
OLIVEIRA, A.R.M.; SIMONELLI, F. e MARQUES, F.A. Cromatografando com giz e 
espinafre: Um experimento de fácil reprodução nas escolas do Ensino Médio. Química 
Nova na Escola, n. 7, p. 37-38, 1998 
CAMPOS, R. C. Extração dos pigmentos do espinafre e separação em coluna de açúcar 
comercial. Química nova na escola, N.20, 2010. Disponível em: 
http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc20/v20a10.pdf