Métodos de Proteínas Totais LOWRY (Andreone)

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PROTOCOLO PARA 
DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS 
 LOWRY et al., 1951 
 adaptado por Andreone Teles Medrado, 2011 
1. EXTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS 
1.1 PRECIPITAÇÃO E SOLUBILIZAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS 
Todo este procedimento deve ser realizado utilizando-se tubos eppendorf de 2 mL 
Pesar o tecido congelado (a quantidade utilizada dependerá da espécie e tecido) e 
adicionar 5 volumes de PCA 6% (=0,6M) 
Exemplo: 100mg (de tecido) + 500μl (de PCA) 
Homogeneizar (No microprocessador)- até que a solução fique homogênea 
Centrifugar por 5 minutos a 11.100 rpm em centrífuga Eppendorf e descartar o 
sobrenadante 
Ressuspender o pellet em 4 volumes de PCA 6% e centrifugar por 5 
minutos/11.100rpm. 
Exemplo: 100mg (de tecido) + 400 μl (de PCA) 
Repetir o processo por 3x. 
- NÃO esquecer de usar o vórtex / após utilizar o PCA 
Tratar o precipitado com 14 volumes de KOH 2,5%. Agitar e deixar 
aproximadamente por 20-24 horas, sob agitação constante, até solubilização completa. 
(150rpm Shaker). 
Exemplo: 100mg (de tecido) + 1400 μl (de KOH) 
Continuar dia seguinte (depois da retirada das amostras do shaker as mesmas devem 
ser guardadas em geladeira -20°C (caso não sejam utilizadas no mesmo momento por 
até 7 dias) 
 
1.2 SOLUÇÕES 
A) PCA (Ácido Perclórico) 6%: 6M: HClO4 – 70% d= 1,67 P= 100,47 
51,6ml de PCA para 1000ml de H2O 
5,16 ml de PCA para 100ml de H2O 
2,58 ml de PCA para 50ml de H2O 
 
B) KOH: 2,5% _________ 2,5g KOH em 100 ml de H2O 
 
2. DETERMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS 
 
1° PASSO- DILUIÇÃO 
 Para cada tecido e espécie utilizada uma diluição diferente do homogenado obtido 
previamente deverá ser realizada, segue um exemplo da diluição de tecido muscular e 
gonadal de Salminus hilarii 
 
 100x (MB)= 990 μl (água) + 10μl (homogenado) = (990+10)/10 
 
 80x (GON)= 790μl + 10 μl = (790+10)/10 
 
- Estas diluições servirão como amostras mãe utilizadas na determinação. 
 
Realizar as diluições em eppendorf cônico de 1,5 mL, depois passar 200μl dessa 
diluição para os tubos de ensaio referente a cada amostra. 
 
 
2° PASSO- PREPARAÇÃO DA CURVA PADRÃO (ALBUMINA) 
-NaOH= 4g para 100mL de água (1N) 
- Solução Padrão de BSA = 0,02mg de Albumina bovina (Sigma)+ 0,1 mL de NaOH (1N) 
para 100mL de água (aliquotar (pipetar) em tubos de 2mL e guardar em freezer -20°C). 
 Os padrões são feitos em duplicada, 5 padrões em concentrações crescentes de 
albumina para adequação das amostras em curva padrão. 
Amostra Concentração (g/mL) BSA- μl Água - μl 
Branco 0 0 200 
P1 0,04 40 160 
P2 0,08 80 120 
P3 0,12 120 80 
P4 0,16 160 40 
P5 0,20 200 0 
 
Exemplo de uma Curva Padrão Albumina: 
 
 
 
y = 1,115x + 0,0096
R² = 0,9997
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
C
O
N
C
EN
TR
A
Ç
Ã
O
ABSORBÂNCIA 
Curva Padrão Albumina 0,2mg/ml (200μl/ml), feita por Andreone Teles Medrado, Julho de 2011. 
Pipetar apenas 290μl de cada 
amostra, padrão e branco por 
poço da placa de Elisa 
3° PASSO- ADIÇÃO DE REAGENTES PARA DETERMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS 
TOTAIS 
 
1- MISTURA REATIVA (MR): Adicionar 1mL mistura reativa por amostra- inclusive nos 
padrões e branco 
 (MR): para fazer esta mistura é necessário se atentar para as quantidades de cada 
solução. 
 SEMPRE USAR: 10mL de Solução alcalina / 100L de sulfato de cobre / 100L de 
tartarato (sempre seguindo essa proporção), porém, na seguinte sequência: 
1º- Sulfato de Cobre(CuSO4) 2% 
2º-Tartarato (Sódio e Potássio) 4% 
3º-Solução Alcalina (Na2CO3-5g+ NaOH-1g para 250ml) 
 
Agitar muito bem a Solução Alcalina por no mínimo 30 segundos antes de preparar a 
Mistura Reativa. 
 
2- FOLIN CIOCALTEAU: Adicionar 100 L de solução de folin+água em cada amostra- 
inclusive nos padrões e branco. 
 
Folin: 1μl Folin + 1 μl H2O (1:1) 100μl por amostra 
 
É necessário esperar 30m min para realizar a leitura. Seguir as instruções do 
aparelho: 
 
 
3- LEITURA NO ESPECTROFOTÔMETRO 
 
1. Ligar o Espectrofotômetro 
2. Ligar o Computador 
3. Abrir o Programa SoftMax (na área de 
trabalho) 
4. Setings (660nm) 
5. Templates (“numerar” a Placa Elise): 
-Protocolos; 
-Protein quant; 
-LOWRY; 
-Indicar concentração dos poços 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. Abrir a bandeja – Drawer 
7. Colocar a Placa no aparelho 
8. Fechar a bandeja - Drawer 
9. Agitar a bandeja levemente 
10. Iniciar a leitura (Reader) 
11. Salvar Planilha (Save).