Alcaptonúria (AKU)

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UNIVERSIDADE CATÓLICA DE BRASÍLIA
 Alcaptonúria (AKU) 
Alunos: Caio ruan frança e lara carrion
Junho, 2018
Sumário 
Resumo
Padrão de herança 
Gene da doença:
Localização do genoma
Tamanho da proteína
Estrutura 
Função
Variabilidade do gene 
Não funcionamento da proteína
Família com a herança da doença (caso clinico).
Desenho par do primer PCR
Sequenciamento 
6.3. Eletrograma
Artigo com condição de recombinante.
Vetor e hospedeiro 
A possibilidade de edição genômica.
Referencias 
Resumo 
A alcaptonúria é uma doença hereditária autossômica recessiva, definida pela deposição do ácido homogentísico em vários órgãos e tecidos. Em que, é um erro inato do metabolismo da fenilalanina e tirosina, transmitido de forma autossômica recessiva. Resulta da deficiência completa da enzima ácido homogentísico oxidase (HGO), causada por mutação no gene 3q (1). Esta deficiência resulta em
Acumulação em tecidos e excreção de grandes quantidades diariamente na urina de HGA, que são responsáveis ​​pela tríade de características clínicas que caracterizaram o AKU: homogentísico acidúria, ocronose e osteoartropatia ocronótica (2). As manifestações iniciais da doença ocorrem na infância como urina e cerume enegrecidos, os pacientes tornam-se sintomáticos somente em torno da quarta década de vida (3,4). Não há cura atualmente aprovada para AKU, mas a nitisinona foi investigada como uma terapia potencialmente modificadora da doença. Dadas essas limitações, os sintomas e o controle desses pacientes é crucial e a abordagem mais importante, já que o AKU tem impacto maciço na qualidade de vida dos pacientes.
Padrão de herança 
A alcaptonúria é uma doença hereditária autossômica recessiva. O defeito genético está localizado no cromossoma 3 (3q21-q23), estando identificadas até à data desta revisão 174 mutações associadas à doença (5,6,7). Parece não existir uma relação óbvia entre o genótipo e o fenótipo dos doentes, já que uma redução moderada da atividade da enzima nem sempre explica a doença e, para existirem sintomas da mesma, a atividade da enzima terá de estar diminuída em mais de 99% (8,9). Risco para os familiares: Os pais de uma criança afetada são heterozigotos obrigatórios (ou seja, portadores de uma variante patogênica do HGD ), Heterozigotos (portadores) são assintomáticos e não correm risco de desenvolver o distúrbio.
Gene da doença
O gene da doença é o HGD.
Localização do genoma
O gene HGD tem sua localização cromossômica em 3q13.33
Tamanho da proteína
A proteína possui uma variante de emenda:
- HGD-001 
ENSP00000283871  ENST00000283871 que possui tamanho de 445 aa e massa de 50 kDa. 
- HGD-005 
ENSP00000417977  ENST00000475447 que possui tamanho de 88 aa e massa de 9,8 kDa.
- HGD-006 
ENSP00000419163  ENST00000494453 que possui tamanho de 145 aa e massa de 16,2 kDa.
- HGD-010 
ENSP00000419560  ENST00000476082 que possui tamanho de 142 aa e massa de 16,1 kDa.
Estrutura
Função
Possui seguintes funções: Catalítica (Homogentisato + O 2 = 4-maleilacetoacetato); função molecular (Dioxigenase e oxidorredutase); Funções biológicas (Catabolismo de fenilalanina , Catabolismo da tirosina); 
Variabilidade do gene 
A variante 0007, uma variante missense, transversão G-to-T no nucleotídeo 1157 do gene HGD, Esta variante sobrepõe 5 transcritos , tem 2504 genótipos de amostra , está associada a 2 fenótipos , possui também 20 nomes: 
Alelo Variante T
NC_000003 .12: g.120638471C> T
ENST00000283871, 9: c.990G> A
ENSP00000283871 .5: p.Arg330 =
ENST00000470321 .1: n.330G> A
ENST00000475447 .2: c. * 41 + 3118G> A
ENST00000492108 .5: c.285 + 3118G> A
ENST00000494453 .1: c.410G> A
ENSP00000419163 .1: p.Arg137 =
Alelo variante A
NC_000003 .12: g.120638471C> A
ENST00000283871, 9: c.990G> T
ENSP00000283871 .5: p.Arg330Ser
ENST00000470321 .1: n.330G> T
ENST00000475447 .2: c. * 41 + 3118G> T
ENST00000492108 .5: c.285 + 3118G> T
ENST00000494453 .1: c.410G> T
ENSP00000419163 .1: p.Arg137Ser
dbSNP HGVS
NM_000187.3: c.990G> A
NM_000187.3: c.990G> T
NP_000178.2: p.Arg330 =
NP_000178.2: p.Arg330Ser
Não funcionamento da proteína 
HGD é produzida predominantemente no fígado e nos rins. A atividade deficiente da mesma no fígado ocasiona a elevação dos níveis sistêmicos de HGA e seu acúmulo nos tecidos, uma vez que o mesmo não pode ser convertido a ácido maleilacetoacético. 
Família com a herança da doença (caso clinico).
CMND (Carla), 29 anos, sexo feminino, branca, casada, assistente social, natural de São Paulo e procedente de Ribeirão Preto-SP. JLAP (João), 41 anos, sexo masculino, pardo, casado, natural de São Paulo e procedente de Goiânia-GO. Casados a 3 anos, primos, possuem um filho e são heterozigotos, ou seja, portadores de uma variante patogênica do HGD, Heterozigotos (portadores) são assintomáticos e não correm risco de desenvolver o distúrbio. Marcos Augusto, filho do casal, afetado por HEMOFILIA B. Sabe-se também que indivíduos afetados há uma falha na síntese da enzima ativa.
O paciente Augusto se encontra com acidúria homogentísica, que é o primeiro sinal da doença, é detectada pela observação de urina escura na infância. Esta característica leva ao diagnóstico de AKU antes de 1 ano de idade em 21% dos pacientes, O escurecimento da urina é devido à oxidação de HGA a monômeros de BQA que se polimerizam e formam pigmentos de coloração escura. Os níveis séricos de HGA em pacientes não afetados variam de 0,014-0,071 M (micromolar), enquanto em afetados, a variação é de 0,018-0,165 mM (milimolar), ou seja, uma diferença de 1000 × (PHORNPHUTKUL et al., 2002). Os altos níveis séricos de HGA levam à deposição do mesmo nos tecidos conectivos, onde se oxidam não enzimaticamente a BQAs e se polimerizam por ação da enzima homogentisatopolifenol oxidase e formam pigmentos de coloração castanho-avermelhada (VILBOUX et al., 2009). Estes pigmentos são claramente visíveis na esclera e nas cartilagens, embora estejam presentes também nos fluidos corpóreos, como no suor. Este fato ocasiona a descoloração da pele com frequência. Ocorre também acometimento das grandes articulações, sistema cardiovascular, rins, glândulas, próstata e bexiga, além de formação de pedras nas glândulas salivares, rupturas dos tendões e ligamentos, osteopenia e fraturas. Observam-se estas características em afetados entre 30-50 anos de idade A deposição de polímeros de BQAs na cartilagem hialina das grandes articulações caracteriza a osteoartropatia ocronótica. A pigmentação é espalhada por todos os tecidos das articulações afetadas, como mostra a tabela 1. Os tecidos afetados tornam-se fracos e frágeis com tendências a fraturas, o que leva à degeneração rápida das articulações e consequentemente pode desabilitar o paciente em idades jovens.
Desenho par do primer PCR
PRIMER ESQUERDO: 227 20 59,84 50,00 6,00 2,00 AAGCTTGGGGATCAGCACTA
PRIMER DIREITO: 463 20 60,08 45,00 6,00 0,00 GAGTGGCCATTGCTGATTTT
TAMANHO DA SEQUÊNCIA: 799
TAMANHO DA REGIÃO INCLUÍDA: 799
Sequenciamento 
- Variação 0007
Eletrograma
Artigo com condição de recombinante
Ainda não se foi estudo sobre recombinante, por ser uma doença muito rara, em seres humanos, mas em genes relacionados, como o do fungo.
Vetor e hospedeiro
O artigo escolhido tem-se:
- Vetor: 
-Hospedeiro: P. sórdida YK-624
A possibilidade de edição genômica
Para utilização do editor de genoma no paciente, podemos modificar a sequência genômica, pois a Alcaptonúria (AKU) é uma mutação no gene do afetado, vindo dos alelos dos pais. Um exemplo de ferramenta que pode ser utilizado no futuro é CRISPR/Cas9, é um mecanismo de defesa das bactérias e Archaea contra elementos genéticos invasores como fagos e plasmídeosde DNA. A memória imunitária surge após o DNA ser cortado em pequenos fragmentos e incorporado no CRISPR locus, passando a designar-se por protoespaçador. (DOUDNA e CHARPENTIER, 2014). O locus é transcrito numa cadeia percursora de RNA não codificante (pre-crRNA), as cadeias repetidas do pre-crRNA sofrem hibridação com um segundo RNA não codificante, o trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA), formando uma cadeia dupla de RNA que é clivada e processada pela host factor ribonuclease (RNase) III. A forma duplex de crRNA-tracrRNA associase com a nuclease Cas9 e forma um complexo responsável pelo reconhecimento e destruição do DNA invasor in e nas células procariotas. Esta estrutura formada, que possui o crRNA com o espaçador, tem especificidade para uma sequência alvo, ligando-se por complementaridade e arrastando consigo a nuclease Cas9. O seu domínio HNH cliva a cadeia complementar e o domínio RuvC a cadeia não complementar, provocando um duplo corte na dupla cadeia de. Tal só acontece caso a sequência alvo se encontre na região adjacente a uma pequena sequência conhecida como protospacer adjacent motif (PAM). Modificando assim, a sequencia genômica do paciente utilizando CRISPR/Cas9.
Referências 
Daniel K, Thomas B: Ochronosis. In Klippel´s textbook of Rheumatology. Phyladelphia, Mosby 2: 28.1-28.4, 1998.
Ranganath LR, Timmis OG, Gallagher JA. Progress in Alkaptonuria - are we near to an effective therapy? J Inherit Metab Dis 2015;38(5):787-9
Phornphutkul C, Introne WJ, Perry MB, et al: Natural history of alkaptonuria. N Engl J 374: 2111-21, 2002.
Mulier M, Willems K: Ochronosis: Clinical manifestations. Belgian orthweb project, case of month, august 1997. http\\www.orthoweb.be/cases/.
Fernandez-Canon JM, Granadino B, Beltran-Valero de Bernabe D, et al. The molecular basis of alkaptonuria. Nat Genet 1996;14(1):19-24.
Pollak MR, Chou YH, Cerda JJ, et al. Homozygosity mapping of the gene for alkaptonuria to chromosome 3q2. Nat Genet 1993;5(2):201-4.
Zatkova A. LOVD Gene http://hgddatabase.cvtisr.sk/home.php?select_db=HGD2010 [updated September 23, 2015; cited 2015 31/12/2015]. Available from: http://hgddatabase.cvtisr.sk/home.php?select_db=HGD.
Vilboux T, Kayser M, Introne W, et al. Mutation spectrum of homogentisic acid oxidase (HGD) in alkaptonuria. Hum Mutat 2009;30(12):1611-9.
Gil JA, Wawrzynski J, Waryasz GR. Orthopedic Manifestations of Ochronosis: Pathophysiology, Presentation, Diagnosis, and Management. The American Journal of Medicine 2016.