Aula Esterilização

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Processos Bioquímicos II
Esterilização
É o procedimento para destruir todos os µ-os viáveis presentes em um material inanimado. Alguns termos relacionados são citados abaixo:
Desinfecção - Trata-se da remoção dos µ-os patogênicos apenas
Assepsia - Procedimento de esterilização para introduzir objetos em um ambiente já esterilizado.
Anti-sepsia - É a remoção de µ-os de tecidos vivos.
A esterilização é utilizada no preparo do processo fermentativo, para remover µ-os contaminantes do meio de cultura e de materiais utilizados no processo. Em muitos casos, principalmente nos produtos farmacêuticos, os produtos finais devem ser isentos de µ-os, entrando uma etapa de esterilização. A esterilização pode ser promovida por agentes físicos e químicos.
Agentes físicos
Calor
O calor é uma forma tradicional e barata de remover µ-os. O problema é que certos µ-os (principalmente dos gêneros Bacillus e Clostridium) podem se converter a formas resistentes a sua ação (esporos).
Os esporos são formas em que a parede celular se espessa, a cromatina se condensa e surge grande quantidade de proteínas com pontes de sulfeto resistentes ao calor, além do sal de cálcio do ácido 2,6 di picolinico (1), que confere resistência térmica ao µ-o.
O calor utilizado para a remoção de µ-os pode ser seco ou úmido.
Calor seco
Aquece os µ-os provocando um processo acelerado de oxidação e desnaturação de biomoléculas, levando a morte do microrganismo.
O grande problema do calor seco é a sua pequena penetração nos materiais, necessitando de tempo prolongado e temperaturas elevadas por um tempo prolongado. Além disso, alguns materiais não suportam o calor por um tempo prolongado, como os meios de cultura. A flambagem na chama é muito utilizada em manipulação de µ-os 
Calor úmido
A penetração do calor úmido é muito maior que a do calor seco, tornando-o muito mais eficiente, pois a desnaturação das biomoléculas é acelerada pela água. Sua eficiência aumenta mais ainda quando é aliado a pressão.
Em escala laboratorial é utilizado um equipamento denominado autoclave, que alia o aquecimento e a pressão. Em equipamentos industriais é utilizado o vapor d'água produzido por caldeiras. Algumas empresas vendem ampolas com µ-os resistentes ao calor. Essas ampolas são colocadas junto ao material a ser esterilizado e após o procedimento seu conteúdo é semeado para verificar se o procedimento foi bem sucedido.
Tabela: Resumo do uso de calor em esterilização
	Modalidade
	Temperatura (°C)
	Equipamento
	Tempo
	Observações
	Calor seco
	160-180
	Estufa
	2h
	Elimina todas as formas
	Calor seco
	> 1000
	Chama
	> 1 min.
	Muito usado em manipulação
	Calor úmido
	60
	Aquecimento
	1h
	Só elimina formas vegetativas de não termófilos
	Calor úmido
	100
	Caldeira
	15 min.
	Chamado vapor fluente. Elimina a maioria dos esporos
	Calor úmido
	120
	Autoclave
	20min à 2atm
	Elimina todas as formas
Radiações
O uso de radiações danifica principalmente o DNA, não atingindo outras biomoléculas de forma tão intensa. As radiações utilizadas são dividas em Ultravioletas (U.V.), ionizantes e microondas.
U.V. - entre 250 e 280 nm a luz ultravioleta é especialmente agressiva ao DNA. Por esse motivo lâmpadas que produzem luz nessa faixa de comprimento de onda são úteis em esterilização. Como o poder de penetração dessa radiação é pequeno, vários materiais não podem ser esterilizados desta forma (efeito sombra). Lâmpadas UV são utilizadas para diminuir a carga microbiana de ambientes tais como centros cirúrgicos e laboratórios.
Radiações ionizantes - Tem penetração e capacidade de esterilizar muito maior que o U.V. Sua operacionalização é mais difícil, pois os equipamentos são mais complexos e os riscos para operadores maiores.
Microondas - Oxida rapidamente todo o material orgânico presente. É bastante utilizada quando se precisa de material apirogênico.
Filtração
Podem ser utilizados para remover µ-os de gases e líquidos.
Filtração de gases - Utiliza-se um material microfibroso, que retém as partículas de poeira suspensas no ar. Essas partículas contem os µ-os em sua superfície. A retenção ocorre por efeito do obstáculo e por eletrostática.
Filtração de líquidos - Membranas com porosidade adequada retém partículas com menos de 0,22 µm incluindo a maioria dos µ-os . Antigamente utilizavam-se discos de amianto e celulose. Atualmente o PVDF tem sido muito utilizado. Para remover vírus a membrana é preparada utilizando-se um polímero especial, que além do efeito obstáculo tem efeito eletrostático.
Agentes Químicos
São moléculas que podem inativar os µ-os por vários mecanismos diferentes. Sua ação depende da espécie e da concentração. Quando utilizados, seus resíduos devem ser removidos de forma cuidadosa, para não prejudicar o crescimento do microorganismo de interesse. Alguns podem aparecer em formulações de produtos finais, como conservantes contra a ação dos µ-os . Os principais são mostrados abaixo:
Aldeídos - Reagem com biomoléculas, provocando desnaturação. Os mais utilizados são o formaldeído (1), que é um gás a temperatura ambiente. Por esse motivo é utilizada uma solução saturada de (1) em água denominada de formalina. (1) também pode ser utilizado na forma de trímero (2), que é sólido e lentamente libera (1). Outro aldeído muito utilizado é o glutaraldeído (3). São muito utilizados na esterilização de superfícies.
Oxidantes - Oxidam as biomoléculas presentes nos µ-os , inativando-os. São também utilizados para esterilizar superfícies, sendo menos irritantes que os aldeídos. Obviamente não podem ser utilizados em materiais suscetíveis a oxidação. Alguns exemplos são o ozônio (1), o peróxido de hidrogênio (2), hipoclorito de sódio (3) e o ácido peracético (4). O iodo também tem ação oxidante. Algumas moléculas orgânicas como a halozona (5) se decompõem liberando lentamente ácido hipocloroso.
Fenóis - Rompem as células dos µ-os . Vários podem ser utilizados como conservantes. Exemplos são o fenol (1), m-cresol (2), hexil resorcinol (3). Outros compostos aromáticos também podem ser utilizados como anti​-sépticos, como o ácido benzóico (4). Compostos que contém radicais ácidos e fenóis são o ácido salicílico (5), e os ésteres do ácido para-hidróxi-benzóico, o nipazol (6) e o nipagin (7). Fenóis clorados como o triclosam (8) também são utilizados.
Mercuriais - O mercúrio inativa enzimas dos µ-os que contém cisteína em seus sítios ativos, por formar complexos estáveis com o enxofre. Como também é tóxico para mamíferos, seu uso hoje está restrito a casos específicos. Os exemplos são o timerosal (1) e o timerfonato (2).
Álcalis - As biomoléculas são muito sensíveis a variações de pH. Soluções com pH alcalino podem ser utilizadas. Devem ser observados os cuidados quanto à corrosão e resíduos da solução que podem interferir com o crescimento do µ-o de interesse.
Tensoativos - Os tensoativos tem a capacidade de desestruturar a membrana dos µ-os, levando-os a perda de material do citoplasma e inativação. Os sabões são bons agentes de assepsia porque aliam essas substâncias ao pH alcalino. O cloreto de cetil piridinio é um exemplo de tensoativo germicida.
Alcoóis - Os alcoóis desnaturam as biomoléculas, além de provocar problemas de controle osmótico nas células dos µ-os. O etanol a 70° GL é muito utilizado para esse fim. O isopropanol também pode ser utilizado. O álcool benzílico tem a ação germicida muito lenta, sendo usado apenas como conservante.
Óxido de etileno - O óxido de etileno é um gás que alquila as biomoléculas. Tem grande poder de penetração e muito utilizado em materiais que não podem ser aquecidos ou tratados com outros agentes químicos.
Corantes - Os corantes ligam-se a proteínas, desnaturando a estrutura do µ-o, levando a sua morte. Abaixo é mostrada a violeta de genciana.
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Noções de BPF para ambiente limpo
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Farmacêutico - ht��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"tp://www��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm".��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"a��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"nvi��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"sa.go��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"v��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm".��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"br/l��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"eg��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"i��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"s/��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"r��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"eso��HYPERLINK "http://www.anvisa.gov.br/legis/resoI/13401rdc.htm"I/13401rdc.htm
Instalações
Pressão de ar estéril positiva, para evitar que partículas do meio externo entrem no ambiente.
Material mínimo essencial para o trabalho. Quanto mais material, mais risco de contaminação.
Portas de correr para suspender menos partículas.
Ante-salas para evitar um contato direto com o ambiente externo.
Paredes com cantos e quinas arredondas facilitando a limpeza e pintadas com tintas especificas, que diminuem a possibilidade de crescimento de m-os.
Recursos Humanos
Treinamento permanente 
Higiene pessoal perfeita e acompanhamento medico.
Roupas e EPls descartáveis
Institucional
Trabalhar com fornecedores certificados.
Pirogênio
Em produtos farmacêuticos, em muitos casos, apenas a esterilização pode não ser suficiente. Resíduos das células mortas dos µ-os, principalmente os glicolipídeos associados à parede celular (LPS) podem induzir reações adversas, tais como febre anafilaxia. Para remover o pirogênio são utilizados o calor úmido por tempo prolongado, microondas, e doses elevadas de U.V. que oxidam todo material orgânico.
Controle de Esterilização
Teste de esterilidade
material é inoculado em meio de crescimento, ou no caso de objetos, o objeto é primeiro "lavado", a solução é filtrada em filtro 0,22 µm e depois o material retido é inoculado em meio de crescimento.
Teste de pirogênio
Existem duas possibilidades:
Inocular o produto em coelhos e acompanhar a variação de temperatura. Esta caindo em desuso.
Kits para a determinação do LPS. Podem se basear no formação de gel ou no desenvolvimento de cor.
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