Liofiliz e criopr

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Curso de Biotecnologia 
Métodos Instrumentais em Biotecnologia 
Métodos de preservação e 
armazenamento de amostras biológicas 
Liofilização 
 
Grego: LYEIN, “dissolver, afrouxar”, mais PHILOS, 
“afinidade”: “amigo do solvente” 
 Definição 
• Método controlável de desidratar materiais 
lábeis, freqüentemente de origem biológica, 
através da dessecação sob pressão reduzida. 
 
Lucas
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Liofilização 
Objetivos 
 Aumentar o tempo de prateleira dos produtos, mantendo 
 sua estabilidade e conservando suas propriedades após 
 reconstituição com solvente. 
Lucas
Realce
Liofilização 
 
Histórico 
• Séc. XV – XVI: Civilização Inca: 
liofilização de batatas 
AUMENTAR A DURABILIDADE DOS 
ALIMENTOS 
• Século XX: 
 
 - Altman e Gersh: Secagem de material histológico; 
 
- II Guerra Mundial (soro liofilizado para vítimas dos 
campos de batalha); 
 
- Ernst Chain: Prêmio Nobel 1945: Liofilização 
da Penicilina 
 
A liofilização remove a água e outros solventes 
do produto congelado pelo processo de 
sublimação. 
 
 
IMPEDE QUE OCORRAM REAÇÕES 
QUÍMICAS, FÍSICAS E BIOLÓGICAS 
Lucas
Realce
Lucas
Realce
O que é a sublimação? 
A sublimação é a mudança do estado sólido 
para o estado gasoso, sem passar pelo estado 
líquido. 
Diagrama de fases da água 
A liofilização só pode ocorrer quando a temperatura e a 
pressão parcial do vapor da água forem inferiores às do 
ponto triplo da água. 
0,0098°C 
4,58 
Lucas
Realce
O ponto triplo de uma substância é a 
temperatura e a pressão nas quais os três 
estados da matéria (sólido, líquido e 
gasoso) coexistem em equilíbrio 
termodinâmico. 
Lucas
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sólido gasoso 
Ex.: Gelo seco 
Sublimação 
Que tipo de produtos são liofilizados? 
• Bio produtos: 
- enzimas, hormônios, antibióticos, vitaminas, 
hemo-derivados, anticorpos, vacinas 
inativadas, etc. 
- fármacos que podem ser usados para 
diagnóstico e terapêutica; 
Lucas
Realce
Outras aplicações... 
• Preservação de: 
- células, 
- enzimas, 
- vacinas, 
- vírus, 
- leveduras, 
- soros, derivados sangüíneos, 
- algas, 
- frutas, vegetais, carnes, peixes e alimentos em 
geral. 
Lucas
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• Ossos e tecidos (medicina); 
• Organismos vivos (fungos, bactérias); 
• preservação de flores, documentos e livros 
antigos, taxidermia de animais, etc. 
• Comida dos astronautas e mochileiros 
 
Outros usos: 
• Livros danificados por inundações. 
• Café solúvel 
 
Lucas
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Exemplos de produtos liofilizados: 
Soro 
banana liofilizada 
Equipamento que promove a 
liofilização: Liofilizador 
Modelos de Liofilizadores 
De bancada Aplicação Industrial 
• Câmara de secagem: 
• recebe o material para secagem; 
 
 - Lembra um armário com várias prateleiras; 
 - Suporta baixas pressões; 
 - fechado hermeticamente. 
 - Está ligada ao condensador. 
 
 
Lucas
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• Condensador : 
- opera a temperaturas abaixo de -40°C, 
dependendo do material. 
 
- Quanto maior for o gradiente de temperatura 
entre o produto e o condensador, maior será a 
velocidade de secagem. 
Lucas
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Etapas da Liofilização 
 • Congelamento 
 
- Primeira etapa do processo. O desempenho do processo 
depende deste estágio. 
 
- A característica de cada produto é decisiva para 
qualidade da liofilização. 
 
- A formação de cristais de gelo durante o estágio de 
congelamento, tem influência na consistência do produto 
final, cor e retenção de aroma. 
Lucas
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• Secagem Primária – A água congelada é 
removida por sublimação, formam-se poros 
no interior do produto que está sendo secado. 
 Eliminação de 90 % da água. 
 
• Secagem Secundária – Ocorre a remoção da 
umidade sublimada (Remoção de 10 % da 
água – Produto sublimado) 
 
 
Lucas
Realce
Lucas
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Curva de liofilização de uma formulação farmacêutica de um sal em baixa 
concentração. 
1ª etapa 
2ª etapa 
Remoção de umidade residual 
Nível do 
Mar: 
760 Tor 
Importante!!! 
 
• A água ou solução aquosa existente no 
produto que pretende-se sublimar deve 
estar na fase sólida; 
 
• A maioria dos liofilizadores trabalham com 
dez graus Celsius negativos ou a uma 
pressão absoluta de aproximadamente 
2mmHg (760 mmHg = nível do mar). 
 
• Após a liofilização do produto, proceder 
embalagem à vácuo para armazenamento. 
 
Lucas
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Liofilizador 
Amostra 
Congelada 
Amostra seca 
Saída da água 
(gelo) como 
vapor 
- Morango em natura 1000g, após liofilizado – 
92g; 
 
- Banana em natura 1000g, após liofilizada – 
200g; 
 
- Camarão em natura 1000g, após liofilizado – 
165g 
 
Peso de algumas frutas antes e após o 
processo de liofilização 
Liofilização 
• Vantagens em relação a outras técnicas de 
desidratação: 
- Evita qualquer alteração química em decorrência do 
calor e umidade; 
- Mantém intacta sua composição química original; 
- Alta durabilidade, se bem acondicionado (meses ou 
anos); 
- Facilidade de reconstituição (estrutura porosa). 
Lucas
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• Desvantagens 
–Muitos organismos não sobrevivem ao 
processo; 
–Viabilidade ocasionalmente insatisfatória; 
–Requer mão-de-obra especializada; 
–Requer equipamentos sofisticado. 
 
Lucas
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Liofilização e a Coleção de microrganismos para 
o futuro!! 
ATCC: American Type Culture Collection (USA) 
 
Centro de Coleção de Culturas Padrão: 
www.atcc.org 
 
(armazenamento de algas, bactérias, linhagens 
celulares, DNA, vírus, tecidos, oncogenes...) 
 
- 50.000 cepas; 
- 9.500 espécies 
Processo de liofilização para preservação de microrganismos 
Sob vácuo, o gelo transforma-se 
diretamente em vapor d’água 
resultando em desidratação dos 
microorganismos 
Ultrafreezer 
Nitrogênio líquido 
 
 
 
 
Objetivo: 
Garantir a preservação de células e organismos 
a longo prazo, através de congelamento, 
interrompendo as vias metabólicas. 
 
 
 
 
CRIOPRESERVAÇÃO 
Lucas
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Congelamento em Ultrafreezer 
Armazenamento abaixo de – 30°C 
Lucas
Realce
Lucas
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Congelamento em Nitrogênio Líquido 
 Armazenamento a – 196°C; 
 
 Congelamento gradual: evitar “efeito 
 Leidenfrost.” 
 
Lucas
Realce
Lucas
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Nitrogênio Líquido – N2 
 Ponto de congelamento: - 209,9º C 
 Ponto de ebulição: - 195,8º C 
Classificação e Rotulagem de 
Perigo 
***Gás asfixiante, podendo causar queimaduras graves 
quando em contato com pele e olhos. 
Utilização de EPI no manuseio de N2 
líquido 
Equipamentos de proteção individual: 
• Proteção respiratória: Linha de ar comprimido respirável 
isenta de óleo ou aparelho de respiração autônomo deve 
estar disponível para situações de emergência em locais 
confinados. 
• Proteção para as mãos: Utilizar luvas 
Criogênicas para o manuseio de cilindros 
 
• Proteção para os olhos: Utilizar 
óculos de segurança com 
proteção lateral. 
Lucas
Realce
Lucas
Realce
Botijões para armazenamento de N2 líquido 
Figura 1. Desenho esquemático de um tanque criogênico mostrando o armazenamento 
 de amostras mergulhadas em nitrogênio líquido a -196°C (A) ou na sua fase de vapor a -150°C 
 (B) 
Como evitar lesões celulares 
decorrentes do congelamento 
• Aplicar a velocidade de congelamento ideal 
para o tipo de células em questão; 
 
• Utilizar agentes crioprotetores que minimizem 
a formação de cristais de gelo e reduzam a 
desidrataçãocelular. 
Lucas
Realce
Lucas
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• agentes crioprotetores 
– reduzem danos durante o congelamento e 
descongelamento 
– estabilidade ao microrganismo contra os 
efeitos adversos da estocagem 
 
Exs.: 
• leite desnatado (skim milk) 10% 
• leite desnatado 10% + inositol 5% 
• sacarose 7% + peptona 7% 
• inositol 5% em soro de sangue de cavalo 
 
Lucas
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Agentes crioprotetores 
• Diminuem a quantidade de água livre; 
• Diminuem a formação de gelo; 
• Diminuem a temperatura de congelamento; 
• Penetram nos tecidos e células; 
• Alguns podem ser tóxicos!!! 
Lucas
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Lesões celulares geradas pela criopreservação: 
Evitar a cristalização; 
Propiciar a vitrificação 
Lucas
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Vitrificação 
Definição: processo físico que envolve a 
transição de uma solução da fase líquida à um 
estado amorfo e envidraçado. 
Eventos fisico-químicos que ocorrem durante os três principais métodos de criopreservação 
Figura 4. Diagrama mostrando as diferentes etapas do congelamento lento 
(metodologia clássica) 
Favorecem a vitrificação: 
- Rapidez de congelamento; 
- Concentração da solução: 
Ex.: uso de crioprotetores. 
Alcor e a Cryonics Institute 
Referências Bibliográficas 
• Pelczar Jr M.J., Chan E.C.S., Krieg N.R. Microbiologia: Conceitos e 
Aplicações. 2ª Ed. V.1, Edit. Pearson Makron Books, 2005. 
 
• Santis G.C., Prata, K.L. Revisão: Criopreservação de célulasprogenitoras 
hematopoiéticas. Medicina (Ribeirão Preto) 2009;42(1): 36-47. 
 
• Constantino H., Pikal M.J. Biotechnology: pharmaceutical aspects. 
Lyophilization of Biopharmaceuticals. V.2. Edit. AAPS Press, 2004. 
(books.google.com.br)