Sequenciamento de DNA

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Sequenciamento de DNA
Método enzimático ou de Sanger: para o método de Sanger ocorrer é necessário que haja dideoxinucleotídeos na reação. A diferença entre em nucleotídeo normal (dNTP) e um dideoxinucleotideo (ddNTP) é a ausência do grupamento hidroxila que faz com que o próximo dNTP não tenha onde se ligar e isso faz com que a replicação pare. 
Como ocorre o método:
Em quatro tubos de ensaios são adicionados: DNA, DNA polimerase, primer, nucleotídeos e um tipo de ddNTP diferente.
Dentro de cada tubo a replicação começa e termina em locais diferentes e com isso no final do processo há fragmentos do mesmo DNA de diferentes tamanhos. 
O conteúdo desses tubos é aplicado em gel de poliacrilamida e separado por tamanho pela eletroforese em uma voltagem elevada, os fragmentos menores ficaram mais em baixo e os maiores mais em cima. 
Para obter a sequência do DNA, a leitura é feita de baixo para cima, resultando em fragmentos que se sobrepõem, e formam a fita completa de DNA. 
Método de sequenciamento automático: No sequenciamento automático, os nucleotídeos são marcados com quatro fluorocromos diferentes, um para cada nucleotídeo (A, C, G, T). Esse método necessita de um DNA de fita simples e, normalmente, é clonado em um vetor M13 ou outro vetor comercial. O método baseia-se na síntese de uma segunda fita de DNA complementar ao DNA molde, na presença de um primer complementar à sequência adjacente ao sítio múltiplo de clonagem do vetor. O fragmento de Klenow da DNA polimerase I inicia o elongamento da cadeia complementar a partir da extremidade 3' do primer; os dNTP (dATP , dTTP, dGTP, dCTP) são selecionados de acordo com o pareamento ao molde e ligados a cadeia por ligações fosfodiéster. 
A reação ocorre assim como no método de Sanger, mas no lugar de usar uma DNA polimerase comum utiliza-se uma Taq polimerase. Como, para cada dNTP, utiliza-se um fluorocromo diferente, a eletroforese é realizada em um único canal do gel de sequenciamento. À medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos são excitados e a luz emitida, em diferentes comprimentos de onda, é detectada por um fotomultiplicador. Esta informação é traduzida na forma de sequência por meio de um computador e apresentada no eletroferograma. 
Montagem de uma sequencia de DNA extensa: Estes fragmentos de tamanho reduzido são sequenciados e remontados, obtendo o que chamamos de consenso, que esperamos ser bem próximo à sequência de molécula que foi inicialmente fragmentada. 
Na prática, numa análise bastante simplificada, o genoma é dividido em pedaços menores, mas ainda grandes e esses são fragmentados em pedaços menores ainda que são sequenciados e montados obtendo um contig para cada pedaço grande surgido da primeira quebra. 
Para cada contig é gerada uma sequência consenso. Montamos então os consensos, resultando em um contig maior que culminará no consenso final.
Um contig é representado pelo alinhamento múltiplo entre os fragmentos envolvidos e a partir deste alinhamento a sequência consenso poder ser obtida.