Aula_11_-_Tecnologia_do_DNA_recombinante

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TECNOLOGIA DO DNA TECNOLOGIA DO DNA 
RECOMBINANTERECOMBINANTE
Genes foco central da genética
até 1970: inferências indiretas sobre os genes
• nenhum gene tinha sido isolado
• nenhuma seqüência de DNA examinada diretamente
Aspectos Fundamentais da Tecnologia do Aspectos Fundamentais da Tecnologia do 
DNA recombinanteDNA recombinante
? ?
?
?
A Tecnologia do DNA recombinante (Engenharia 
Genética) que vem se desenvolvendo desde os 
primórdios da década de 1970, sofreu um 
considerável progresso com o desenvolvimento dos 
Projetos Genomas...
Definição:
Descreve as técnicas para obter, amplificar e 
manipular fragmentos específicos de DNA
DNA recombinante: União não natural de DNAs de fontes 
não homólogas, em geral de organismos diferentes
���� criação de novos genótipos que seriam 
impossíveis pelas técnicas de genética clássica
���� possibilitou o isolamento gênico
Daniel Nathans, Hamilton Smith e 
Werner Arber descrevem as nucleases
de restrição, enzimas que reconhecem e 
cortam sequências curtas específicas de 
DNA em pontos determinados. 
1968 – É identificada e isolada a primeira 
ENZIMA DE RESTRIÇÃO
DOIS ACONTECIMENTOS RELEVANTES...
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
O que são?
As Enzimas de Restrição são proteínas com função 
enzimática, produzidas normalmente por bactérias 
contra infecções virais
Atualmente existem mais de 3000 
enzimas de restrição conhecidas
As Enzimas de Restrição reconhecem seqüências 
específicas no DNA (4, 6 ou 8 pares de base). 
Essas seqüências são denominadas sítios de 
Restrição
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Na década de 60, pesquisadores descobriram que as
bactérias possuem enzimas que "cortam" ou "digerem" DNA 
de organismos estranhos ou externos, protegendo desta 
forma as células bacterianas de invasores, como por 
exemplo, os vírus. Estas enzimas, conhecidas como 
enzimas de restrição ou endonucleases de restrição, foram 
isoladas e purificadas para uso em pesquisas. Cada enzima 
é capaz de reconhecer e "cortar" uma seqüência específica 
de DNA, conhecida como "seqüência de reconhecimento" ou 
"sítio de restrição"
enzimas que clivam o DNA nas ligações fosfodiéster não 
terminais
reconhecem uma seqüência específica de bases ao longo 
da molécula de DNA 
cliva a molécula após esse reconhecimento específico, 
geralmente em sequências de 4, 6 e 8 bases –
palíndromas
fazem parte de um sistema celular de modificação e 
restrição que tem como função proteger a célula contra 
DNAs “estranhos”
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
As Enzimas de Restrição reconhecem e clivam 
seqüências específicas no DNA
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
� cortam apenas seqüências alvo-específicas de DNA
� qualquer DNA contêm sítios alvo ao acaso para essas enzimas
� DNA é cortado em fragmentos definidos de tamanho adequado para 
clonagem
� sítios de restrição: não são relevantes para funcionamento organismo e não 
são cortados in vivo 
� maioria dos organismos não tem enzimas de restrição
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Enzima de restrição EcoRI (E. coli):
reconhece a seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA:
5’- GAATTC - 3’
3’- CTTAAG - 5’
Palíndromo de DNA
5’- G AATTC - 3’
3’- CTTAA G - 5’
Corte um par de “pontas adesivas” unifilamentares idênticas
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Enzimas de restrição diferentes
reconhecem e cortam palíndromos 
específicos
A enzima de restrição EcoRI corta uma molécula de DNA circular 
portadora da seqüência-alvo, resultando em uma molécula linear 
com pontas adesivas unifilamentares
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Hind III isolada da bactéria Haemophilus influenza
5’ A AGCT T 3’
3’ T TCGA A 5’
A enzima Hind III é somente um exemplo desta classe de 
enzimas conhecidas como endonucleases de restrição. 
De fato, já foram isoladas mais de 900 enzimas de 
restrição de 230 cepas de bactérias, algumas com 
especificidade de sequência e outras não.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
• As enzimas de restrição geram:
– Extremidades sem ponta, ponta cega - “blunt ends”;
– Extremidades coesivas, colantes – “sticky ends”.
5’CCGAT ATCTA 3’ 5’ ATGGATCCTC 3’
3’GGCTA TAGAT 5’ 3’ TACCTAGGAT 5’
Blunt ends Sticky ends
Ação da enzima:
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Extremidades sem pontas
Extremidades coesivas
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
• A cadeia de DNA pode ser hidrolisada (quebradas) para dar origem a 
pontas cegas ou pontas coesivas
• Duas cadeias com pontas cegas podem ser unidas por um DNA-ligase, 
mesmo sendo de origens diferentes
• Uma cadeia com pontas coesivas liga-se com maior facilidade a cadeias 
com sequências complementares
HaeIII
EcoRI
AluI
NotI
HindIII
Ponta cega
Ponta cega
Pontas coesiva
Pontas coesiva
Pontas coesiva
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO:
• EcoRI
– E = gênero Escherichia
– co = espécie coli
– R = linhagem RY13
– I = primeira endonuclease isolada 
Característica dos nomes das enzimas de restrição:
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Sítios de reconhecimento e clivagem por algumas enzimas de restrição
Enzima Organismo de origem Sequência-alvo
5' -->3'
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C
Bgl II Bacillus globigii A* G A T C T
Eco RI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C
Hind III Haemophilus influenzae Rd A* A G C T T
Kpn I Klebsiella pneumoniae G G T A C * C
Pst I Providencia stuartii C T G C A * G
Sma I Serratia marcescens C C C * G G G
Sal I Streptomyces albus G G * T C G A C
Taq I Thermophilus aquaticus T * C G A
Xma I Xanthamonas malvacearum C * C C G G G
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Várias enzimas de restrição foram 
identificadas com especificidades 
diferentes
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Corte por 
enzima de 
restrição e 
eletroforese
Como analisar meu 
DNA ???
Corte por enzima 
de restrição e 
eletroforese
Corte por enzima 
de restrição e 
eletroforese
Forma simples e rápida de separar fragmentos de DNA por 
tamanho;
Gel de agarose ou poliacrilamida; 
DNA tem carga negativa – migra para o polo positivo;
Migração diferencial inversamente proporcional ao 
tamanho: quanto menor a molécula de DNA – mais rápido 
migra e vice-versa
ELETROFORESE
ELETROFORESE
ELETROFORESE
Cuba de eletroforese
amostra
Gel de agarose
Fonte de corrente 
elétrica
ELETROFORESE
DNA corado 
com EtBr sob luz 
ultravioleta
Gel de agarose
Visualização feita após coloração com brometo de etídio
→ complexo do DNA + corante + UV = 
fluorescência
ELETROFORESE
Paul Berg obtém as primeiras moléculas 
de DNA recombinante, unindo DNA de 
diferentes espécies e inserindo esse 
DNA híbrido em uma célula hospedeira
1972 – O Primeiro DNA RECOMBINANTE
é produzido
Vetores de clonagem são moléculas de DNA usadas na 
construção do DNA recombinante
Foram os responsáveis
chaves nos avanços realizados
na Genética e Biologia 
Molecular
VETORES DE CLONAGEM
Os Vetores de Clonagem permitem a análise de 
seqüências de DNA de interesse em diferentes 
hospedeiros biológicos
O que são vetores ?
“Vetores” são agentes que podem carregar um fragmento 
de DNA para dentro de uma células hospedeira. Quando 
são utilizados para reproduzir um fragmento de DNA são 
chamados de vetores de clonagem. Quando utilizados 
para expressar um certo gene contido em um fragmento 
de DNA, são chamados de vetores de expressão.
VETORES DE CLONAGEM
Plasmídeos
VETORESDE CLONAGEM
� Clonagem molecular começou com a construção de plasmídeos
artificiais que se replicam na bactéria E. coli
Adaptados para receber pedaços de DNA de outros 
organismos gerando “DNA recombinante” que pode ser 
multiplicado pelas bactérias produzindo bilhões de 
cópias iguais (clones moleculares) para estudo
PLASMÍDEOS – o vetor de clonagem “pop star”
VETORES DE CLONAGEM
Meio eficiente de 
amplificar DNA clonado...
O que são PLASMÍDEOS?
� pequenas moléculas DNA circular (2.000 a 200.000 pares de 
bases) diferentes e adicionais ao cromossomo bacteriano 
principal
� encontrados em bactérias e em alguns outros organismos
� replicam seu DNA independente do cromossomo bacteriano
� contêm genes que conferem caracteres adicionais à bactéria 
Ex. resistência a determinados antibióticos
úteis para selecionar céls transformadas por plasmídeos
VETORES DE CLONAGEM
Plasmídeos
– Origem de replicação ori
para replicação no 
hospedeiro bacteriano
– Sítios únicos de restrição 
para inserção do DNA que 
será clonado
– Marcador de seleção (gene 
de resistência à antibióticos: 
tet – tetraciclina, amp –
ampicilina)
– Exemplos: pBR322, pUC18
Características essenciais de um plasmídeo:
VETORES DE CLONAGEM
Plasmídeos
Replicação autônoma –
várias cópias
ORI
Marcas de seleção –
resistência a antibióticos
Sítio para clonagem –
diversos sítios 
reconhecidos por 
diferentes endonucleases
de restrição - variabilidade
Marcas de distinção – capacidade de 
distinguir entre bactérias transformantes 
com plasmídeos com inserto das com 
plasmídeos sem inserto
Características essenciais de um plasmídeo:
Plasmídeos VETORES DE CLONAGEM
VETORES DE CLONAGEM
Plasmídeos
Sítio 
clivagem 
único para
Eco RI
Gene marcador de seleção 
(ampr). Este quando 
introduzido em uma 
bactéria, confere a mesma 
resistência à ampicilina
Origem de 
replicação
pUC18
VETORES DE CLONAGEM
Plasmídeos
� plasmídeos com grandes inserções de DNA: perdem a inserção
� fragmentos DNA > 20kb não são úteis para clonagem
Fago lambda
� cabeças do fago acomoda moléculas de DNA não maiores que 50 kb
� inserções DNA doador de cerca de 10 a15 kb
VETORES DE CLONAGEM
Cosmídios
� levam inserções de DNA três vezes maiores que levados pelo λ ( 45 kb)
� vetores híbridos de fagos λ e plasmídeos:
DNA pode ser replicado na célula como em plasmídio
DNA pode ser embalado como um fago
YACs, BACs e PACs
Cromossomos artificiais
vetores que aceitam inserções DNA > 35 a 45 kb
para clonar grandes segmentos de cromossomos
YACs:
� inserções DNA exógeno 200 a 500 kb
� usam células de leveduras como hospedeiras
� úteis projeto Genoma Humano (grande capacidade de transporte)
VETORES DE CLONAGEM
BACs:
� cromossomos artificiais de bactérias
� aceitam grandes inserções (até 300 kb)
� menos complexos e mais fáceis de construir que YACs
� se replicam na bactéria como os plasmídios
� substituindo YAC no estudo onde 
grandes inserções são necessárias 
construção de mapas físicos de 
cromossomos inteiros
VETORES DE CLONAGEM
PACs:
� cromossomos artificiais derivado do bacteriófago P1
� levam inserções de 80 a 100 Kb
� podem ser replicados em bactérias
� como os BACs formam menos inserções híbridas que YACs
VETORES DE CLONAGEM
1.Contêm um marcador genético para seleção
2.Habilidade de promover replicação autônoma
3.Contêm sítios de restrição únicos para facilitar a 
clonagem do inserto de DNA
4.Apresentam uma quantidade mínima de DNA não-
essencial para otimizar a clonagem
VETORES DE CLONAGEM
Todos os vetores de clonagem compartilham 
propriedades em comum:
• Como vetor recebe DNA de outro organismo? 
� Vetor digerido por enzima de restrição e aberto 
� Pedaço de DNA de origem diferente (inserto) digerido 
com a mesma enzima de restrição é “inserido” no vetor 
aberto
• Como vetor e inserto são unidos? 
� Enzima DNA Ligase
• Resultado? 
� CLONAGEM MOLECULAR
CLONAGEM MOLECULAR
CLONAGEM MOLECULAR
Clonagem do DNA
Enzimas de Restrição
Gene
Vetor Bactéria
Transformação Amplificação
União do DNA: O fragmento de DNA e 
o plasmídeo (vetor) obtidos por digestão 
com a enzima EcoRI são misturados
Corte do DNA: Plasmídeo e DNA alvo 
digeridos com a mesma enzima de 
restrição (EcoRI).
Ligação do DNA: A enzima DNA ligase
une o vetor e o fragmento (refaz a ligação 
fosfodiéster) reconstituindo uma molécula 
circular
CLONAGEM MOLECULAR
CORTE DO DNA: Digestão enzimática da amostra de DNA
CLONAGEM MOLECULAR
UNIÃO DO DNA: Ligação dos produtos digeridos da 
amostra de DNA com o vetor plasmidial
CLONAGEM MOLECULAR
Transformação bacteriana
O processo de transferência de DNA exógeno 
para dentro das células do hospedeiro é
chamado “transformação”
DNA recombinante ligado entra na bactéria
CLONAGEM MOLECULAR
Corte e União do DNA – Produção do 
plasmídeo (vetor) + inserto
= plasmídeo recombinante 
Transformação – introdução de 
plasmídeo recombinante dentro da célula 
hospedeira (bactéria).
Objetivo: amplificação “in vivo” do DNA 
clonado
Vetor 
Fragmento de DNA Vetor 
recombinante
Vetor 
recombinante E. coliE. coli
antibiótico antibiótico
E. Coli sem 
vetor morre
E. Coli com 
vetor prolifera
Isolamento dos clones contendo o DNA recombinante
Amplificação, Seleção e Isolamento 
dos clones – distinguir as bactérias que 
tem plasmídeos das que não tem 
plasmídeos
CLONAGEM MOLECULAR
Bactéria Hospedeira transformada – colocada em meio de cultura 
para crescimento estimulado em condições que favorecem a 
amplificação do plasmídeo com consequente amplificação do DNA 
clonado → Amplificação
Antibiótico seletivo –
seleciona somente as 
bactérias que carregam o 
plasmídeo
Crescimento (amplificação) do clone bacteriano:
CLONAGEM MOLECULAR
replicação vetor e DNA doador
múltiplas cópias de si próprio
colônia resultante: 
bilhões de cópias com inserções idênticas DNA doador
CLONE DE DNA RECOMBINATECLONE DE DNA RECOMBINATE
AMPLIFICAÇÃO DO DNA RECOMBINANTE
CLONAGEM MOLECULAR
Um único vetor entra na 
bactéria e é amplificado pela 
replicação que ocorre na 
divisão celular
grande número de cópias 
do fragmento doador
CLONAGEM MOLECULAR
AMPLIFICAÇÃO DO DNA 
RECOMBINANTE
Geralmente, são utilizados marcadores que são 
inativados com a inserção do DNA estranho no 
plasmídio.
Exemplo: sistema de diferenciação branco-azul
• plasmídios da série pUC possuem um gene que 
codifica a produção da b-galactosidase (lacZ) de E. 
coli. A inserção do DNA estranho no sítio de 
clonagem do plasmídeo causa a interrupção do 
gene, levando a perda da função da b-gal.
Como resultado:
• colônias brancas (b-gal inativa) - positivas (com 
inserto)
• colônias azuis (b-gal ativa) - negativas (sem inserto)
CLONAGEM MOLECULAR
Seleção de clones recombinantes
CLONAGEM MOLECULAR
Seleção de bactérias com inserto
Extração de DNA plasmidial:
• Existem vários métodos para isolar DNA plasmidial de uma 
bactéria: Lise alcalina em combinação com o detergente SDS
• A exposição da suspensão bacteriana a um detergente 
fortemente aniônico em pH alto, abre a parede celular, 
desnatura o DNA cromossômico e proteínas e libera o DNA 
plasmidial no sobrenadante.
CLONAGEM MOLECULAR
ISOLAMENTO DOS CLONES
Verificando a sua Clonagem....
1. Selecionar colônias bacterianas brancas e incubá-las 
separadamente em meio de cultura apropriados 
contendo o antibiótico de seleção (37OC/ 12 horas);
2. Extrair o DNA plasmidial das bactérias oriundas dasculturas em análise;
3. Digerir separadamente o DNA plasmidial oriundo de 
cada uma das culturas. Utilizar para isso, a mesma 
enzima de restrição utilizada quando do início da 
clonagem (no nosso caso Eco RI);
CLONAGEM MOLECULAR
4. Analisar os produtos das digestões dos diferentes 
DNAs plasmidiais em gel de agarose e selecionar seu 
clone.
Verificando a sua Clonagem....
CLONAGEM MOLECULAR
Clone = Vetor plasmidial
contendo um DNA de 
interesse
Extrair e cortar o DNA do genoma doador
Inserção dos fragmentos em vetores – DNA recombinante
Transformação das bactérias
Clonagem da bactéria (mesmo vetor)
COMO ISOLAR UM GENE DO DNA?COMO ISOLAR UM GENE DO DNA?
Selecionar clone com inserção contendo gene de interesse
COMO ISOLAR UM GENE DO DNA?COMO ISOLAR UM GENE DO DNA?
ESCOLHA DE UM VETOR DE CLONAGEM
� devem ser moléculas pequenas
� capazes de replicação prolífica em célula viva
� existência de sítios de restrição convenientes que possam ser 
usados para a inserção do DNA a ser clonado
� existência de mecanismo para a fácil identificação e recuperação da 
molécula recombinante
Numerosos vetores de clonagem atualmente em uso
Escolha depende tamanho DNA que precisa ser clonado
CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA
Coleção de clones feitos da amostra original de DNA ou 
cDNA
Biblioteca Biblioteca genômicagenômica ou ou cDNAcDNA
Tarefa: achar o clone que contenha o gene desejado
Dois tipos de bibliotecas:
���� tipo vetor utilizado 
tamanho genoma e facilidade manipulação
���� fonte de DNA
Vetores plasmidiais e fagos
� pequenas quantidades DNA
� clonar genes organismos genoma pequeno
Cosmídeos
� quantidades maiores de DNA
YACs, BACs e PACs
� portam maiores quantidades DNA de todos
TIPO VETOR UTILIZADO
FONTE DE DNA
Biblioteca genômica
Biblioteca de cDNA
� contêm todo o genoma – genes nas formas nativas
� clonar o genoma inteiro
� regiões transcritas do genoma menor que genômica
� procurar um gene específico que é ativo em um tipo específico 
de tecido em planta ou animal
Síntese do cDNA bifilamentar do mRNA
FONTE DE DNA
“Dependem da tendência natural de um filamento único 
de ácido nucléico encontrar e se hibridizar a outro 
filamento”
5’- AGCTAGGGATCTTCGGATAAATACCCGTTACGTACTATTG...-3’
3’- AAGCCTATTTATGGGCAAT-5’sonda
clone
SONDASONDA: trecho clonado de DNA com seqüência 
homóloga ao do gene desejado
� utilizada para encontrar um clone específico 
� utilizada para encontrar fragmento de DNA ou RNA
DETECÇÃO GENE DE INTERESSE
Detecção de clones específicos que contêm 
fragmento de interesse
Biblioteca
(centenas de milhares de fragmentos clonados)
triagem
encontrar o DNA recombinante 
contêm gene de interesse
sonda especsonda especííficafica
Uma biblioteca genômica pode ser feita clonando-se 
genes em bacteriófagos λλλλ
Identificação de um clone específico em uma biblioteca
De onde vem o nucleotídeo para se fazer uma sonda?
���� cDNA do tecido que expressa o gene de interesse
Pâncreas: fonte de mRNA
fazer sonda cDNA para achar gene da insulina
���� gene homólogo de um organismo correlato
Gene clonado fungo Neurospora
pode ser usado como sonda para encontrar gene homólogo 
fungo correlato Podospora
���� se o produto protéico do gene interesse é conhecido e 
se foi obtida seqüência de aminoácidos
sonda feita com base no conhecimento código genético
redundância do código:
várias seqüências possíveis DNA podem codificar 
a proteína em questão
seleção curto trecho aa com redundância mínima
síntese de todos os filamentos possíveis de DNA 
contendo nucleotídeos alternativos
Uma seqüência curta de uma proteína é usada para 
estabelecer um conjunto de oligonucleotídeos redundantes 
para uso como uma sonda, de modo a recuperar o gene que 
codificou a proteína
IMPLICAÇÕES DA TECNOLOGIA DO DNA 
RECOMBINANTE
seqüência caracterizada manipulada para alterar o genótipo 
do organismo
���� Engenharia genética
Tecnologia do DNA problemas biológicos, médicos ou na 
agricultura
���� Engenharia genética
plantas resistentes a pragas, plantas adaptadas a condições 
diferentes de nutrientes ou solo, animais que produzem 
mais leite
� Melhoramento animal e vegetal
� Diagnóstico de doenças genéticas
� Criações de modelos animais
mutação que causa doença pode ser determinada
provocar mutação em gene específico na linhagem 
germinativa para mimetizar doença genética que ocorre em 
humanos
� Produção de proteínas raras
tratamento de doenças humanas e produção de vacinas
Insulina, hormônio de crescimento ou vacina contra hepatite
Exemplos:
área da Engenharia Genética que têm produzido 
resultados mais concretos e imediatos
Engenharia genética em plantas
Plasmídeo Ti: 
� derivado da bactéria Agrobacterium tumefaciens: doença de Galha
� T-DNA: aumenta a proliferação das células (indutor de tumor) 
� adequado ao papel de vetor usado rotineiramente para produzir 
plantas transgênicas
� DNA de interesse: pode ser recomposto no T-DNA: inserido no 
cromossomo da planta
Criação de uma planta transgênica através do crescimento 
de uma célula transformada pelo T-DNA
Plantas transgênicas: genes que conferem resistência a algumas 
peste de bactérias ou fungos
�1982: primeira insulina humana 
recombinante
Engenharia genética em humanos
Produção de insulina humana