aula 5 Proteina

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Bromatologia - Profa.Ionara F. R. Vieira
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Bromatologia 
	Turma Agronomia
3 Semestre
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PROTEÍNAS
DEFINIÇÃO
Substâncias orgânicas complexas (C, H, O, N, S, P, Fe, Cu, Zn).
Polímero de alto peso molecular
Unidade básica: aminoácidos
IMPORTÂNCIA
nutricional
propriedades sensoriais
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Unidades estruturais básicas das proteínas
AMINOÁCIDOS (aa)
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Cada aminoácido tem uma cadeia lateral (R) característica, que influencia suas propriedades físico-químicas.
Diferenças: tamanho, estrutura e carga elétrica. 
Arranjo tetraédrico  atividade ótica  isômero L e D
Só os aminoácidos L são constituintes de proteínas naturais.
AMINOÁCIDOS (AA)
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                                 alanina
valina
leucina
triptofano
fenilalanina
metionina
AMINOÁCIDOS (AA)
Apolares ou hidrofóbicas, exemplos:
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 ácido aspártico
histidina
asparagina
glicina
serina
ácido glutâmico
tirosina
AMINOÁCIDOS (AA)
Polares ou hidrofílicos, exemplos:
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PROTEÍNAS
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PROTEÍNAS
Vinte tipos de aminoácidos ocorrem naturalmente nas proteínas.
 que diferem com o tipo, número e sequência de aminoácidos na cadeia polimérica, conformação molecular tridimensional.
Apresentam 50-55% de C, 20-23 % de O, 14-18 % de N, 6-8% de H, 0-4 % de S.
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PROTEÍNAS
ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS
ESTRUTURA PRIMÁRIA
Sequência linear de aminoácidos 
Nível estrutural mais importante, dele deriva todo o arranjo espacial da molécula
Varia em 3 aspectos: número, sequência e natureza dos AA
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PROTEÍNAS
ESTRUTURA SECUNDÁRIA
Disposição espacial adotada pela cadeia polipeptídica
Estrutura helicoidal (-hélice) – interações H intra-moleculares
Estrutura foliar (folhas pregueadas) – interações H inter-moleculares
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PROTEÍNAS
ESTRUTURA TERCIÁRIA
Organização tridimensional da cadeia polipeptídica contendo ou não zonas de estrutura secundária definidas
Estabilização:
Ligações dissulfeto (Cys + Cys = cistina)
interações de hidrogênio
Interações eletrostáticas
Interações dipolares
Interações hidrofóbicas 
Forças de Van der Waals
Grupos hidrofóbicos dispostos no interior da molécula
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PROTEÍNAS
ESTRUTURA QUATERNÁRIA
Resultado de associações não covalentes de unidades protéicas iguais ou diferentes
Estas subunidades se mantém unidas por forças covalentes, como pontes dissulfeto, e ligações não covalentes, como pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, etc. 
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Fonte de aminoácidos na dieta e de energia.
Aminoácidos essências (lisina, triptofano, metionina, leucina, isoleucina e valina) não podem ser sintetizados pelo organismo humano.
Proteínas alimentares são digeríveis, não tóxicas e palatáveis. Têm diferentes estruturas moleculares, atributos nutricionais e propriedades físico-químicas.
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PROTEÍNAS NO ALIMENTO
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Responsáveis por compostos aromáticos e substâncias coloridas formadas por reações térmicas ou enzimáticas ocorridas durante obtenção, preparação e armazenamento dos alimentos. 
Componentes estruturais de muitos alimentos naturais, frequentemente determinam sua textura, por exemplo, de produtos de carne e peixe. 
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PROTEÍNAS
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Isoladas são usadas nos alimentos como ingredientes devidos a suas propriedades funcionais, p.e., sua capacidade de atribuir aparência, textura ou estabilidade desejáveis ao produto: agentes gelificantes, emulsionantes, espumantes e espessantes.
Alergias e intolerâncias – proteínas de leite, ovos, castanhas, etc.; celíacos, fenilcetunúricos.
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PROTEÍNAS
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IMPORTÂNCIA
Conhecer o valor nutritivo
Determinação da composição centesimal de um alimento e análise para rotulagem
Estimar rendimento industrial
Avaliar a qualidade (ex.: glúten  qualidade da farinha)
Avaliar a influência nas propriedades sensoriais
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MÉTODOS FISICO-QUÍMICOS DE DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS 
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MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO
A. Métodos que utilizam a determinação de Nitrogênio:
Kjeldahl **
Dumas **
Destilação direta
Métodos que utilizam técnicas nucleares: ativação por nêutrons; ativação por prótons
B. Métodos químicos e físicos
Reação do Biureto **
Interação proteína-corante (Dye-binding) **
Método do Reagente de Folin-Ciocalteau ou Método do fenol reagente **
Titulação com formol
Espectroscopia no IV ou no UV **
Refratometria
Turbidimetria **
Espectroscopia eletrônica
Polarografia
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 É a determinação mais utilizada.
Considera que as proteínas têm, em média, 16% de nitrogênio.
Fator geral (F) na transformação de nitrogênio para proteínas é de 6,25%. 
%Proteinas = F x %N
Fatores de conversão específicos: trigo-5,70; leite- 6,38; gelatina- 5,55.
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Análise de nitrogênio
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Desenvolvido em 1883 por Johann Kjeldahl. 
Não mede proteínas diretamente. A quantidade de proteínas presentes é calculada a partir da concentração de N no alimento.
Necessita de um fator de conversão (F) para converter a medida de N para proteínas. 
F = 6,25 (equivalente a 0,16gN/ g proteína) é usado para muitas aplicações, existem outros fatores de conversão. 
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Proteínas - Kjeldahl
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KJELDAHL
É o principal método para determinação de proteínas em alimentos - é padrão e largamente usado. 
Tem alta precisão e boa reprodutibilidade.
O método Kjeldahl é dividido em três etapas: digestão, destilação e titulação.
 
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Método Kjeldahl
1a etapa: Digestão
O alimento é colocado no frasco de digestão e então digerido pelo aquecimento na presença de ácido sulfúrico (um agente oxidante que digere alimentos), e um catalisador (cobre, selênio, titânio ou mercúrio). 
A digestão converte o N do alimento (ou outro na forma de nitratos ou nitritos) em amônio, e a matéria orgânica em C02 e H20. O gás amônia não é liberado numa solução ácida porque a amônia está na forma de íon (NH4+) que se liga ao íon sulfato (SO42-) e assim permanece na solução:
CHON (alimento)  (NH4)2SO4 + C02(g) + H20 (g) (1)
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Método Kjeldahl
2a etapa: Neutralização e DESTILAÇÃO
Depois da digestão o frasco de digestão é conectado no destilador de nitrogênio. Adiciona-se hidróxido de sódio, que converte o sulfato de amônio em gás amônia:
(NH4)2SO4 + 2 NaOH  2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2)
A amônia formada é liberada da solução. Por destilação por arraste a vapor a NH3 é transferida do frasco de digestão para um erlenmeyer contendo ácido bórico em excesso. 
NH3 + H3BO3  NH4+ + H2BO3- (íon borato) (3)
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DIGESTOR
DESTILADOR
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Método Kjeldahl
3a etapa: Titulação 
O conteúdo de N é estimado por titulação do borato de amônio com ácido sulfúrico ou clorídrico. 
H2BO3- + H+  H3BO3 (4)
A concentração dos íons H+ gastos na titulação equivalem à concentração do nitrogênio.
O conteúdo de N é então convertido em proteínas usando um fator apropriado:
 %Proteina = F x %N
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Falhas do processo (Kjeldahl): 
1. Não é uma medida ‘verdadeira’ de proteínas, dosa todo N - protéico e não protéico (purinas, piridinas, vitaminas, uréia, aminas, amidas, etc.). 
	Pode melhorar a técnica precipitando a proteína e separando com lavagem (retira o N não protéico), mas, no entanto pode carregar peptídeos e aminoácidos.
3. F dá erros quando o conteúdo em N é muito diferente de 16%. Diferentes proteínas necessitam de diferentes fatores de correção pois tem diferentes seqüências de aminoácidos
5. Desvantagem: utiliza substâncias corrosivas/muito oxidantes
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DESTILAÇÃO DIRETA 
Modificação do método de kjeldahl.
Sem digestão.
Amostra + NaOH/Na2SO4  NH3 
Mistura-se com H3BO3 e titula-se com ácido.
Necessita de curva de calibração.
É usado como rotina em alguns alimentos, produtos crus (no qual o tempo é mais importante que a exatidão).
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Método Dumas (1831)
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Também determina N total. 
Princípio: Combustão a 700-900°C – produz CO2, H2O e N2. 
O N2 liberado é analisado volumetricamente ou por técnica instrumental.
N2 pode ser medido quando passa através de uma coluna que tem um detector de condutividade térmica no final. 
 
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Método Dumas
Necessário converter o teor de N na amostra para teor de proteínas - F.
Problemas: sujeita à erros  pequena qtde de amostra – amostra pode ser não representativa. 
Equipamento - melhora precisão; 
- mais rápido, uns 4-10 minutos por medida, comparado com 4-6 horas para Kjeldahl;
- não necessita de reagentes ou catalisador. 
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Turbimétrico
Fundamento: medida da turbidez causada pela proteína precipitada. Agentes precipitantes: ác.tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido Sulfosalicílico.
 Precipitante + proteína  turbidez
Mede-se o grau de turbidez.
Rápido, simples (proteínas líquidas).
Desvantagens: não é usado p/sólidos; depende da proteína; depende de padrões; precipitação de interferentes.
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Métodos Espectrofotométricos
As principais diferentes entre os testes são os grupos químicos responsáveis pela absorção da radiação, exemplo: ligações peptídicas, grupos aromáticos, grupos básicos proteínas agregadas.
A concentração de proteínas é determinada a partir da curva de calibração. 
As curvas de calibração de absorbância (ou turbidez) versus concentração proteínas é preparada usando uma série de soluções de concentração conhecida. 
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Métodos espectrofotométricos UV e visível
Desvantagens: é necessário que as proteínas estejam diluídas em soluções transparentes, e que não contenham substâncias que absorvam no mesmo comprimento de onda que as proteínas.
Preparação de alimentos exigem muitas etapas: homogeneização, extração por solventes, centrifugação, filtração, que podem consumir muito tempo e trabalho.
 Absorbância depende do tipo de proteína. 
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Princípio - Sais de Cu+2 em soluções alcalinas produzem cor violeta ou roxa quando interagem com ligações peptídicas.
Medida feita em um Colorímetro ou espectrofotômetro. 
Faz-se a reação e após uns 15-20 minutos lê-se a absorbância a 540 nm.
Determina proteínas.
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Teste do Biureto (Riegler, 1914)
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Cor formada depende de cada proteína e a intensidade é proporcional à quantidade.
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B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
Reação das proteínas com reagente de fenol Folin-Ciocalteau e reagente de Biureto (Cu+2 em condições alcalinas).
 Oxidação de aminoácidos aromáticos - tirosina e triptofano - com aparecimento de uma coloração azul. 
Cor azul  colorímetro (500 a 750 nm)  curva padrão.
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B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
Desvantagens: 
É lento: operações múltiplas e período de incubação
Necessita de uma curva padrão com proteína conhecida
Intensidade da cor depende de cada proteína.
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C. Métodos Espectofotométricos UV
Princípio - proteínas possuem absorção UV em 280nm (aminoácidos aromáticos: tirosina, triptofano, fenilalanina.
Rápido, simples, não usa reagentes e não destrutivo.
Pouco exato - depende da composição dos aminoácidos.
Ácidos nucléicos podem interferir.
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Método Dye-binding
Corantes que reagem quantitativamente com proteínas.
Lisina, histidina e arginina reagem com -SO3H.
Corante + proteína  complexo insolúvel.
Mede-se o excesso de corante colorimetricamente.
A quantidade de proteína :
Corante ligado = corante inicial – corante livre.
Corantes: Laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo e preto amino 10B.
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DYE-BINDING
Fundamento:
Boa correlação com o Kjeldahl.
Rápido, simples, exato, econômico.
Desvantagens: 
Aquisição do equipamento
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Amostra + corante (exc.)
Formação de um complexo insolúvel
Separação (centrifugação ou filtração)
Mede o excesso de corante que não reagiu
Por diferença obtém-se a quantidade de proteína
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Separação de proteínas
Solubilidade
Cromatografia:
			 - tamanho, 
		 	 - carga, 
 			 - adsorção.
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Análise de aminoácidos
Determinar a composição de aminoácidos nas proteínas.
A proteína é hidrolisada  usando um ácido forte ou enzimas  libera aminoácidos.
Cromatografias separam os aminoácidos  troca iônica, afinidade ou por absorção. 
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