Dermatófitos micologia

Prévia do material em texto

Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa
Mestrado em Análises Clínicas
Micologia Clínica
Pilar, cutânea, ungueal
Micoses Superficiais 
Os agentes causadores das micoses superficiais são fungos que colonizam as camadas ceratinizadas da pele, dos pelos e das unhas. As infeções causadas por estes organismos induzem pouca resposta imunitária do hospedeiro, não são destrutivas e em consequência são assintomáticas. 
Pitiríase Vesicolor 
Pitiríase Vesicolor é uma infeção fúngica superficial que ocorre em todo o mundo, preferencialmente em ambientes tropicais e subtropicais. Jovens são mais comumente afetados e pode ser adquirida por transferência direta ou indireta de material ceratinizado de pessoa para pessoa. As lesões são pequenas manchas cutâneas de tonalidades que variam da hipo a hiperpigmentação, com distribuição mais frequente no tronco, membros superiores e face, mas distribuindo-se, às vezes atipicamente, pela região crural, membros inferiores, couro cabeludo, havendo referências de regiões palmar e plantar. As manchas cutâneas são de tamanhos variáveis, desde o tamanho da cabeça de um alfinete até manchas anulares ou manchas maiores, de formas irregulares, tomando grande extensão da superfície cutânea. A infeção dos folículos pilososo, resultando em foliculite, perifoliculite e abcessos dérmicos é uma complicação rara desta doença. 
Esta patologia não é encontrada em animais e é causada pelo fungo Malassezia, um fungo antropofílico, habitante normal da pele humana. Há fatores que predispõe o desenvolvimento do fungo. 
 Clima quente e húmidos
 Elevada sudorese
 Uso de terapias imunossupressoras 
 Estado seborreico
O diagnóstico da pitiríase vesicolor é usualmente realizado apenas pelo exame clínico. A lâmpada de Wood é algumas vezes útil para confirmar o diagnóstico e detetar lesões subclínicas. Apresenta fluorescência amarelo-ouro, provavelmente devido à excreção de metabólitos (porfirinas) do fungo, sensíveis à radiação ultravioleta. Por outro lado, é possível realizar o exame direto, sendo necessário primeiro raspar a lesão e posteriormente adicionar hidróxido de potássio a 10% para clarear as estruturas fúngicas. Como resultado do exame microscópico, observa-se leveduras redondas ou ovais e hifas como também aglomerados de esporos.
Embora, não necessária para estabelecer o diagnóstico, a cultura pode ser realizada usando-se um meio suplementado com óleo de oliva como fonte lipídica. O crescimento das colónias leveduriformes ocorre após 5 a 7 dias de incubação a 30°C. Macroscopicamente obtém-se colónias lisas, cremosa, malte.
Micoses Cutâneas
As micoses cutêaneas incluem infeções causadas por fungos dermatófitos e fungos não dermatófitos. 
Dermatófitos 
Os dermatófitos são fungos que pertencem à família Arthrodermataceae, que engloba três géneros: Epidermopphyton, Microsporum e Trichophyton. São fungos com capacidade de desenvolver doença em humanos e em animais. Têm afinidade para estruturas ceratizinadas e destrui-las (Fungos ceratinolíticos), o que lhes confere capacidade de invadir a pele, os pelos e as unhas (Fungos ceratinofílicos). Afetam principalmente a camada superior e mais externa da epiderme, extrato córneo, pelos, folículos capilares e muito raramente as camadas mais profundas e tecidos, excecionalmente em indivíduos imunocomprometidos. 
Os dermatófilos podem ser classificados de acordo com o seu habitat natural ou hospedeiro: 
Geofílicos: habitat natural o solo, transmissão contacto direto com o solo (jardinagem) ou por intermédio de animais. 
Zoofílico: parasitas do pelo e pele dos animais, podendo haver a transmissão ao homem - Zoonose.
Antropofílicos: parasitas obrigatórios do homem, podendo ser transmitidos direta ou indiretamente de pessoa para pessoa. 
Esta classificação é importante para o prognóstico e para orientação terapêutica, no sentido de quanto mais adaptado se o encontra o fungo ao habitat, mais difícil a eficácia terapêutica, sobretudo a terapêutica tópica. Falar da fisiopatologia do fungo no organismo humano???
As dermatofitoses são infeções superficiais causada por fungos do tipo dermatófitos que afetam a pele, unhas e pelos. Também são vulgarmente designadas por tinea, devido ao aspeto anelar característico das lesões que dão origem. O fungo cresce num padrão centrífugo formando os tais anéis. São talvez as micoses mais contagiosas. Possuem uma distribuição cosmopolita, especialmente em regiões tropicais e subtropicais e certas espécies são características ou prevalentes de determinada região do globo como a sua virulência para o homem. A transmissão pode ser pela transferência de artoconídios ou hifas, ou material ceratínico contendo estes mesmos elementos de um hospedeiro infetado para um hospedeiro suscetível. Há fatores que predispõem o desenvolvimento destas patologias:
Calor e humidade
Higiene e estilo de vida
Imunossupressão 
Terapêutica com corticosteroides (imunossupressor)
As dermatofitoses possuem diferentes apresentações clínicas, que são influenciadas pelo tipo de espécie de dermatófitos, pelo local da infeção e pela imunidade do hospedeiro. São classificadas clinicamente de acordo com as localizações anatómicas afetadas por este tipo de fungos. Daí que a denominação de cada tipo de dermatofitose seja feita colocando um nome em latim do local do corpo humano afetado, juntamente com a palavra tinea.
Tinea corporis:
infeção da pele do tronco, pernas e braços 
lesão circular (Herpes Circinado), pruginosa e contagiosa inoculação na pele de um esporo (artroconídio) do fungo, crescimento centrífugo desencadeando uma resposta inflamatória
Etiologia: Microsporum, Trichophyton e Epidermophyton floccosum
Muito associado a infecção por contacto com um animal contaminado
Tinea cruris:
Infeção da pele das virilhas, região perianal e púbica
Lesão eritematosa que facilmente se dissemina e muito purginosa
Etiologia: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum
Contacto com toalhas, roupa contaminada 
Surto comum em escolas 
Tinea manuum:
Infeção da mão
Lesão normalmente unilateral, apresenta a forma eczematosa (vesículas em forma de anel com líquido viscos e prurido intenso) e forma hiperceratósica (aumento do tamanho das vesículas adquirindo forma de crostas)
Etiologia: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis
Contacto com toalhas, roupa contaminada, pessoa infetada, animal ou até mesmo o solo 
Eczemas predispõe mais facilmente à infeção 
Tinea pedis:
Infeção dos pés – “Pé de atleta”
Apresenta-se na forma interdigital (descamação entre os dedos, muito prurido), forma hiperceratósica (descamação dos calcanhares e da sola do pé), forma inflamatória (vesiculas na sola, interdigital)
Etiologia: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum
Suor excessivo, sapatos fechados, andar descalço em pavimentos contaminados (balneários, piscinas)
Tinea unguium:
Infeção das unhas dos pés ou mãos – Onicomicoses
Unha perda de brilho, amarela a preta, hiperceratose subungueal
Etiologia: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes var interdigitale 
Infeção predispões em unhas previamente doentes ou que sofreram um traumatismo ou em situações de Tinea pedis
Quando o pelo é infetado, o padrão de invasão fúngica pode ser ectorix, endotrix ou fávico dependendo da espécie fúngica. As hifas septadas podem ser vstas dentro da haste do pelo em todos os três padrões. No padrão ectotrix, os artroconídios são formados fora do pelo, no endotrix são formados no interior e o fávico, as hifas, os artroconídios e espaços vazios fazendo lembrar bolhas de ar. 
Tinea capitis:
Infeção do couro cabeludo
Subdivide-se em: 
Tinea tonsurantes (cabelos infetados crexcem mas partem facilmente originando alopécia, pelada) – Microsporum canis (tinha microspóricas) Trichophyton violaceum (tinha tricofiticas)Tinea favosa – Trichophyton schoenleinii
Tinea inflamatória ou quérion de Celson - Trichophyton mentagrophytes
Tendo em conta todas estas possíveis patologias, necessário ter medidas preventivas como forma de diminuir a infeção e disseminação:
 Evitar a humidade, sobretudo nas zonas intertriginosas
 Evitar calçado fechado (épocas quentes)
 Usar roupa de algodão
 Evitar contato com animais contaminados
 Todos os objetos em contato com as lesões afetadas, lavar com água a ferver 
 Tratamento adequado 
O diagnóstico laboratorial das dermatofitoses baseia-se primeiramente no exame direto da amostra biológica (unha, pele, pelo) e posteriormente o isolamento dos organismos em cultura, como forma de identificar qual o agente etiológico da infeção fúngica. 
Primeiramente necessário proceder à colheita da amostra e o seu envio para o laboratório.
Precauções especiais no momento da colheira:
 Desinfeção prévia do local, com álcool a 70%; 
 Verificar se houve utilização anterior de antifúngicos tópicos ou por via oral; 
 Recolher as amostras para caixas de Petri estéreis ou lâminas; 
 Se para o mesmo doente forem recolhidas várias amostras, individualizar as amostras correspondentes a cada localização. 
Tendo em conta o tipo de amostra: 
Cabelo
Detetar as zonas infetadas e os cabelos parasitados com a ajuda de uma lâmpada de Wood (fluorescência característica de certas dermatofitoses). A lâmpada de Wood é utilizada para determinar o grau e a extensão da lesão dermatológica; 
Recolher os cabelos fluorescentes com uma pinça e/ou as raízes dos cabelos partidos;
Eliminar os eixos muitas vezes cheios de contaminantes 
Folículos pilares
Colher o pus folicular por pressão com a ajuda de uma zaragatoa. 
Escamas: 
raspagem com um bisturi ou raspador de Vidal
Colheita do couro cabeludo com “um quadrado de alcatifa” 
Despiste dos portadores de dermatófitos
Passar várias vezes, sobre o couro cabeludo, um quadrado de alcatifa (5cmx5cm) previamente esterilizado na autoclave (20 minutos a 110°C)
Pele
Obtenção das escamas por raspagem do bordo das lesões (bisturi ou raspador de Vidal)
Se a descamação é mínima: colher com fita-cola, depois aplicar sobre uma lâmina para transporte ao laboratório
Se as lesões são húmidas: colher primeiro a serosidade com zaragatoa e depois as escamas com bisturi ou raspador de Vidal; enviar o conjunto ao laboratório
Unhas
Eliminar o bordo livre da unha
Recolher os detritos das unhas por raspagem das zonas distróficas hiperceratósicas ou anormalmente coradas, raspando até à zona de atividade do fungo 
Se existe perioníquia: colher o pus com zaragatoa 
Para o exame direto de colheitas ceratinizadas é necessário utilizar reagentes esclarecedor para permitir visualizar as estruturas fúngicas e coadjuvar no diagnóstico. Consoante o tipo de amostra poderemos utilizar hidróxido de potássio (KOH) a 20-30% ou o cloral-lactofenol. Se tivermos uma amostra de cabelos ou pelos podemos utilizar o lactofenol (cora de azul), que provoca o esclarecimento lento, 10 minutos, das estruturas fúngicas, enquanto o hidróxido de potássio cerca de 5 minutos para desencadear a sua ação. A grande vantagem da sua utilização, é que o lactofenol permite obter preparações finas e não modificar as estruturas pilares fazendo com que as preparações durem mais tempo. Se porventura tivermos uma amostra de unha aí utiliza-se hidróxido de potássio uma vez que promove o amolecimento da estrutura ceratinizada e torna a amostra mais clara. Desvantagem é a formação de artefactos filamentosos que podem induzir em erro no diagnóstico. Em alternativa pode-se adicionar ao hidróxido de potássio outros reagentes que facilitam a observação microscópica e contraste das estruturas fúngicas. Por exemplo, tinta Parker, cora de azul as estruturas fúngicas; negro de clorazol, coloração azul-esverdeada da parede fúngica; branco de calcoflúor, um fluorocromo com capacidade de se ligar aos polissacarídeos (celulose ou quitina) constituintes da parede fúngica que quando exposto a radiação ultravioleta emite fluorescência. Este último reagente possível de ser utilizado requer observação em microscópico de fluorescência. 
A amostra é colocada numa lâmina, juntamente com o reagente esclarecedor, espera-se o tempo de atuação do respetivo reagente. Coloca-se a lamela e segue-se a observação ao microscópico. Uma vez que os fungos dermatófitos são fungos filamentosos, observamos hifas septadas, hialinas, ramificadas e/ou artrósporos ou artroconídios (resultam da fragmentação da hifa em segmentos retangulares). 
Paralelamente ao exame direto, necessário efetuar o exame cultural das amostras biológicas. Permite diagnosticar uma micose em situações em que o exame direto é negativo ou se positivo, a cultura vem confirmar o diagnóstico e ajudar na identificação da espécie e poderá ser útil na avaliação da suscetibilidade aos antifúngicos. 
As amostras devem ser semeadas na superfície dos meios de cultura, com auxílio de uma ansa, pipeta de Pasteur ou zaragatoa, com movimentos de estrias em zig-zag para permitir separação dos possíveis contaminantes da amostra. As amostras “sólidas”, por exemplo, cabelo ou unhas, não devem ser colocados em profundidade, mas sim apenas aderido à superfície do meio de cultura. No caso de unhas inteiras ou fragmentos e escamas necessário cortar em pedaços pequenos antes de colocar na sementeira.
Meio de cultura utilizado para o crescimento e o isolamento dos fungos dermatófitos:
Meio Sabouraud dextrose ágar (DAS)
Meio universal – crescimento da maioria dos fungos 
Composição: 
glucose – fonte de energia para o crescimento
Peptonas – fontes de fatores de crescimento de nitrogénio
pH ácido – tolerado pelos fungos 
Amostras biológicas são polimicrobianas, há necessidade de inibir o crescimento de bactérias presentes. Nestes casos, ao meio Sabouraud pode-se adicionar antibióticos de largo espetro, cloranfenicol ou gentamicina, como forma de inibir o crescimento bacteriano e tornar o meio mais seletivo para fungos. 
Tornar o meio Sabouraud seletivo para dermatófitos é adicionado cicloheximida ou actidiona, antifúngico que limita a invasão de fungos de crescimento lento, dermatófitos, pelos contaminantes de crescimento rápido. Como as amostras biológicas superficiais podem estar contaminadas por fungos saprófitas, preferível utilizar este tipo de meio. 
Após semear, incubar a temperatura entre 25ºC e 27ºC, durante períodos variáveis de acordo com o agente etiológico envolvido, no caso dos dermatófilos após 7 a 30 dias de incubação (fungos de crescimento lento). Após o crescimento, há a necessidade de proceder à identificação baseada em critérios macroscópicos e microscópicos. Em termos macroscópicos é através da observação do aspeto da colónia:
 Cor
 Textura
 Superfície 
 Pigmento difusível no meio de cultura
Exemplo
	Espécie
	Aspeto da cultura
	Epidermophyton floccosum
	Colónia com hifas aéreas, mas baixas dando o aspeto de pele de camurça
	Microsporum canis
	Colónia algodoada ou lanosa
	Trichophyton mentagrophytes
	Colónia aveludada, rasa, pulverulenta, mas a aparência pode ser variável 
Características que nos ajudam na identificação da espécie fúngica, sendo que por vezes pode ser pouco informativa. O diagnóstico deve ser feito com base nas características microscópicas, observação das hifas e do tipo de esporo.
Quando por vezes a identificação é difícil pela ausência de aspetos característicos necessário recorrer a testes complementares. 
Dermatophyte Test Agar
Meio seletivo para dermatófitos, derivado da mudança de cor do meio 
Pode haver o crescimento de outros microrganismos como bactérias, leveduras, fungos saprófitas, mas não alteram a cor do meio ou se alterar pela morfologia da colónia podemos distingui-los 
Composição: 
Peptona de soja – fornecem amónia e são a fonte de produtos alcalinos, produzidos por dermatófitos. Quando as peptonas são metabolizadas em produtos alcalinos, ocorre uma alteração no indicadorvermelho de fenol, de amarelo para vermelho
 Dextrose – fonte de energia 
Cloranfenicol – antibiótico de largo espectro
Cicloheximida – inibição do crescimento dos fungos saprófitas 
Vermelho fenol – indicador de pH
Desvantagem: quando há a presença de pigmentos dificulta a identificação da espécie, uma vez há a alteração do meio
Interpretação dos resultados 
3 a 6 dias após a inoculação, avaliar se houve modificação da cor do meio Amarelo Vermelho (aumento do pH)
Hifas brancas aéreas e cor vermelha ao redor do crescimento fúngico – Resultado positivo para dermatófilos
Ausência de mudança de cor para vermelho – Resultado negativo para dermatófilos, conjugar simultaneamente com o resultado do meio Sabouraud
Meio de Borelli (lacrimel)
Favorece a esporulação dos dermatófitos, uma vez que no meio Sabouraud não o fazem (meio rico, o que crescem, extensão das hifas à procura de nutrientes)
Através dos esporos formados conseguimos perceber o género de fungo dermatófito que está a causar a infeção. 
Meio de floco de aveia – Não encontrei nada a explicar sobres este meio!!!! 
Meio de Christensen – Prova Bioquímica
Teste da Urease – avalia a capacidade das espécies fúngicas de produzirem a enzima Urease
Composição:
Dextrose – fonte de energia
Cloreto de sódio – manutenção do equilíbrio osmótico do meio
Fosfato monossódico – tampão
Digestão Enzimática de Gelatina - fornece amónia, carbono e aminoácidos necessários para o crescimento do organismo
Ureia – fonte de amónia para os organismos produtores de urease
A metodologia é simples e consiste em semear fragmentos da colónia no Meio de Christensen e incubar a temperatura ambiente (25 °C) por 96 horas.
Interpretação dos resultados
A decomposição da ureia pela urease causa a liberação de amónia, aumentado o pH do meio Mudança de cor do indicador de pH, Vermelho de Fenol, de amarelo (pH 6,8) para vermelho (pH 8,1).
Meio permite a distinção entre as diferentes espécies de Trichopyton, sobretudo Trichopyton rubrum (-) e Trichopyton mentagrophytes (+)
Capacidade de perfuração do cabelo 
Esta prova tem como objetivo visualizar se o fungo perfura ou não o pelo, in vitro.
Fundamento: 
Coloca-se um cabelo esterilizado em ágar gelosada, o fungo é repicado sobre o pelo. A placa é incubada a temperatura ambiente (25°C) durante períodos de 7 a 30 dias. O microrganismo vai dispor da ceratina como única fonte nutricional. Após o período de incubação, coloca-se pelo entre lâmina e lamela com lactofenol azul.
Interpretação dos resultados: positivo se for observado perfurações perpendiculares ao longo do pelo. 
Exigências nutriciais (meios Trichophyton) Não encontrei nada a explicar sobres este meio!!!!
Comportamento em meio BCPCGA (meio da glucose e caseína com indicador de bromocresol púrpura) Não encontrei nada a explicar sobres este meio!!!!
Procedimento para a preparação das lâminas para observação microscópica a partir de uma colónia de fungos filamentosos, dermatófitos.
Técnica da cultura dilacerada: aplica-se a todos os fungos filamentosos; desvantagem por promover a destruição das estruturas fúngicas
Técnica da fita-cola: aplica-se a fungos filamentos, exceto aos que formam colónias glabras (não adere à fita cola) ou em colónias cheias de esporos (dificulta a visualização das outras estruturas fúngicas)
Técnica da cultura em lâmina: não há a destruição das estruturas como o fungo cresce diretamente na lâmina. Única vantagem desta técnica é a formação de lâminas definitivas. 
Ao observar ao microscópico o dermatófito após crescer num meio específico, facilmente permite-nos visualizar as estruturas fúngicas sobretudo os artroconídios (macro ou microconidíos) percebendo qual o género infetante. 
Trichophyton
Macroconídios 
raros, forma de lápis, septos transversais
Microconídios numeroros, associados em cachos ou isalados ao longo da hifa
Local preferencial PELE, CABELO E PELOS, UNHAS
Microsporum
Macroconídios numerosos, forma de casulo/barril, extremidade afilada, septos transversais, podem estar associados em 2 ou 3 na extremidade
Local preferencial CABELO E PELE
Epidermophyton
Macroconídios numerosos, forma de raquete, septos transversais, podem estar associados em 2 ou 3 na extremidade
Local preferencial PELE
Lisboa, 16 de outubro de 2018