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Universidade Eduardo Mondlane
Faculdade de Agronomia e Engenharia Florestal
Departamento de Ciências Biológicas
Curso de Engenharia Agronómica 
Disciplina: Fisiologia Vegetal
Tema: Determinação do potencial osmótico na plasmólise incipiente de Rhoeo discolor
Relatório #01
Grupo no 5
Subgrupo II
Discentes:					Docentes:
Da Costa, Adelino José			Professor Doutor. Orlando Quilambo
Macaza, Angelina						dr. Mauro Machipane
Magul, Saimo						dra. Célia Martins
								Dra. Sónia Ventura Guilundo
								Dra. Iris Victorino Machaeie
						Monitores:
							Cândido Zunguze
					Mário Fijano
Determinação do potencial osmótico na plasmólise incipiente de Rhoeo discolor
Maputo, Março de 2015
	
	
	Da COSTA, MACAZA, MAGUL
	1
	
INTRODUÇÃO
Plasmólise é um fenómeno que acontece quando a célula vegetal é submersa a um meio hipertónico, que provocará a liberação de água do vacúolo, ou seja, ocorrerá o processo de osmose. Isso causa uma contracção do volume da célula, e posteriormente do citoplasma que se distanciará parcialmente da membrana celular. Apesar disso, nem sempre a plasmólise destrói a célula, se for realizado o processo de desplasmólise (da plasmólise), que consiste em colocar a célula em meio hipotônico, ela poderá recuperar seu turgor.
O potencial hídrico celular (Ψc) é a medida da energia livre da água da célula (Correia, 2012). É com essa medida que podemos saber se ocorrerá preferencialmente a entrada ou a saída da água da célula através da plasmalema (fenómeno osmótico). Não é fácil obtermos essa medida na célula, pois ela é o resultado de duas pressões simultâneas: a pressão hidráulica exercida pela parede celular sobre o protoplasto (Ψp) e a pressão osmótica condicionada pelos solutos e pela temperatura da célula (Ψπ) (Assis Prado & Casali, 2012). Somando os dois componentes, o hidráulico (Ψp) e o químico (Ψπ), obtem-se o valor do potencial hídrico celular (Ψc). Ou seja, Ψc = Ψp + Ψπ. 
No entanto, se a célula está plasmolizada a plasmalema não tem contacto mais com a parede em pelo menos uma área significativa da região entre a parede e a plasmalema. Essa área pode ser visualizada sob microscópio óptico (Assis Prado & Casali, 2012). 
Entre a plasmalema e a parede entra a solução que a célula plasmolizada está submersa. Essa falta de contacto entre a plasmalema e a parede celular indica que a plasmalema não empurra mais a parede da célula. Pode haver contacto em algumas áreas entre a plasmalema e parede na célula plasmolizada, mas a plasmalema não mais empurra a parede e a parede não mais reage empurrando a plasmalema. Dessa forma, não há mais pressão de parede na célula plasmolizada (Correia, 2012).
 Assim, a pressão que a parede exerce sobre o protoplasto é igual a zero na plasmólise. A plasmólise serve para anularmos Ψp e, portanto, o potencial hídrico se iguala ao potencial osmótico (Ψc = Ψπ). Em células plasmolizadas a relação entre os componentes do potencial hídrico tornam-se simplificadas, não há mais o componente hidráulico e podemos estimar o valor de Ψπ se soubermos a energia livre da solução utilizada que induziu o início da plasmólise na maioria das células do tecido vegetal. Esse início da plasmólise em mais da metade das células do tecido vegetal é denominado de plasmólise incipiente ou limite plasmolítico (Assis Prado & Casali, 2012 citando Meyer et al., 1969, p. 64). Para tecidos vegetais, considera-se que a plasmólise incipiente se manifesta quando 50% das células estão plasmolizadas.
Rhoeo discolor (L’Hérit.) Hance (Commelinaceae) é uma espécie de planta originária do México e pode ser cultivada para aulas práticas sob pleno sol ou a meia sombra em canteiro (CRUZ, 2006). A epiderme inferior da folha apresenta coloração roxa e é útil para essa aula, pois o vacúolo das células é naturalmente preenchido com antocianina nesse tecido.
OBJECTIVOS
Objectivo geral
Determinar o potencial osmótico de tecidos foliares de Rhoeo discolor empregando o método de plasmólise incipiente.
Objectivos específicos
Observar tecidos epidérmicos com diferentes intensidades de plasmólise e indicar o significado hídrico desses diferentes estados da célula;
Definir potencial osmótico (Ψπ) pressão de turgescência (Ψt) e potencial de água (Ψc) da célula; 
Estimar o potencial osmótico celular na solução em que ocorreu o limite plasmolítico; e
Identificar as relações entre Ψπ, Ψt e Ψc antes, na plasmólise incipiente e após a plasmólise incipiente.
MATERIAIS E PROCEDIMENTOS 
Materiais
	Material vegetal 
	Folhas de Rhoeo discolor
	
Objectos 
	7 Copos de 50ml - Azlon
2 Copos de 100ml - Azlon
1 Pipeta graduada – Assistent
9 Tubos de ensaio
9 Lâminas e lamelas
Microscópios ópticos
Régua
	Solução 
	Sacarose 1M
	Solvente
	Água destilada
Procedimentos
Marcou-se 9 tubos de ensaio com enumeração de 1 a 9 correspondentes às diluições de sacarose com diferentes valores de molalidade: 0,10; 0,15; 0.20; 0,25; 0,30; 0,35; 0,40; 0,45 e 0,50M.
Preparou-se as diluições de sacarose com um volume final de 15ml para cada concentração de sacarose da solução, a partir da solução de 1M que nos foi fornecida, e usou-se a pipeta para homogeneizar a solução mas sempre antes de usar em cada solução diluída de diferente concentração lavou-se.
Passou-se apenas 10ml das soluções diluídas para os tubos de ensaio já marcados e fechou-se.
Cortou-se as folhas de Rhoeo discolor em peças quadradas de 0.5cm2 e introduziu-se 5 peças em cada tubo de ensaio, homogeneizou-se e mantivesse em incubação durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Depois da incubação, removeu-se as peças de epiderme e fez-se preparação temporária na mesma solução de sacarose onde foi incubada. Removeu-se cuidadosamente a epiderme inferior e com a epiderme virada para cima colocou-se na lâmina que já continha uma gota da solução em que esteve incubada a peça e cobriu-se com lamela. 
Para obter o volume de água destilada e de solução de sacarose a 1M necessárias para cada diluição usou-se a seguinte fórmula de diluição (Aichinger et al., 1980): V1×[ ]1 = V2×[ ]2 
Onde: 
V1 = volume da solução inicial de sacarose a ser utilizada na diluição (ml) 
[ ]1 = concentração da solução inicial (igual a 1,0 M, em todas operações) 
V2 = volume final da solução (15ml, em todos tubos de ensaio) 
[ ]2 = concentração da solução desejada (por exemplo, 0,45M) 
 
Como exemplo utilizando a fórmula (I) o valor do volume de sacarose com a concentração inicial igual a 1,0M a ser usada na diluição para obtermos uma solução de 0,45M em um volume final de 15ml: 
[ ]1 × V1= [ ]2 × V2
V1×1M = 15*0,45 V1 = 6,75 ml de sacarose para diluir com 15ml – 6.75ml = 8.25ml de água destilada. 
Já que o volume final é de 15ml, então temos que utilizar 4,5ml de solução de sacarose (V1) e mais 10,5 ml de água destilada para obtermos uma solução de sacarose diluída a 0,45 M. Tal como ilustrado na tabela.
Tabela 1 Concentração de sacarose, volume de sacarose e água para diluição.
	Volume de sacarose a 1M (ml)
	1,5
	2,25
	3,0
	3,75
	4,5
	5,25
	6,0
	6,75
	7,5
	Concentração de sacarose (M)
	0,10
	0,15
	0,20
	0.25
	0,30
	0,35
	0,40
	0,45
	0,50
	Volume de água para diluição (ml)
	13,5
	12,75
	12.0
	11,25
	10,5
	9,75
	9,0
	8,25
	7,5
Usou-se pipeta graduada para obter os volumes das soluções e transferir esses volumes para os tubos de ensaio durante as diluições. Após a transferência dos volumes para os tubos de ensaio movimentou-se os tubos de ensaio tampados vagarosamente sobre a mesa para tornar homogénea a mistura de água e sacarose. 
Após 30 minutos de permanência nas soluções de sacarose com o auxílio de uma bisturi foi retida uma fina camada da parte roxa dos cortes e foram montados entre lâmina e lamela e observados ao microscópio óptico. Colocou-se três (3) películas do mesmo tubo de ensaio em uma mesma lâmina. Com a ajuda de uma pipeta usou-se a solução de sacarose no tubo de ensaio (solução obtida na diluição)para banhar os tecidos epidérmicos entre a lâmina e lamela. Feito isso o material foi observado nas objectiva inicial de 40x, onde foi observado um campo de 18 células, e contou-se o número de células plasmolizadas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Resultados
O número total de células, células plasmolizadas e sua percentagem em cada concentração de sacarose são apresentadas na tabela abaixo:
Tabela 2: Células plasmolisadas em diferentes valores de concentração da sacarose a 1M
	Concentração
de
Sacarose (M)
	Potêncial Osmótico
(Mpa)
	Número Total
de
Células
	Número de Células
plasmolizadas
	% Total de Células plasmolizadas
	0,10
	– 0,26
	18
	0; 0; 0
	0%
	0,15
	– 0,41
	18
	0; 1; 0
	1,9%
	0,2
	– 0,54
	18
	3; 2; 0
	9,3%
	0,25
	– 0,68
	18
	5; 3; 4
	22,2%
	0,3
	– 0,82
	18
	7; 8; 6
	38,9%
	0,35
	– 0,97
	18
	11; 8; 10
	51,9%
	0,4
	– 1,12
	18
	11; 12; 9
	59,3%
	0,45
	– 1,29
	18
	11; 14; 13
	70,4%
	0,5
	– 1,45
	18
	14; 12; 14
	74%
1 Bar=========== – 0,1Mpa
% de plasmólise = [(média do nº de células plasmolizadas)/(nº total de células)]*100
Nota: O número de células plasmolizadas e a percentagem de células plasmolizadas aumenta à medida que se aumenta a concentração da sacarose a 1M. Nas soluções menos concentradas não há plasmólise ou algumas células estão plasmolizadas. Nas soluções mais concentradas praticamente todas as células do tecido estão plasmolizadas (Tabela 2). 
Durante a observação ao microscópio óptico as diferentes lâminas, verificou-se que os tecidos submetidos às concentrações de 0,5 M em solução de sacarose apresentavam plasmólise avançada em algumas células e a maioria das células (mais de 50%) já apresentavam algum grau de plasmólise. A 0,35M as células estavam no início da plasmólise e cerca de 50% das células apresentam algum grau de descolamento da plasmalema da parede celular (coloração mais clara entre a parede e o protoplasto). A solução, nesse caso, que induziu a plasmólise incipiente é a de 0,30M. Esse valor de concentração e o valor da concentração anterior (0,30M com menos de 50% das células plasmolizadas) foram usados para calcular o valor de potencial osmótico no ponto de plasmólise incipiente. 
Figure 1: Gráfico de células plasmolizadas em função do potencial
Considerando 38,9% de plasmólise – 0,82Mpa e considerando 51,9% de plasmólise – 0,97Mpa é possível interpolar entre 38,9% e 51,9% de plasmólise para encontrar o potencial osmótico em que 50% das células se encontram plasmolizadas:
50% – 38,9% ========================= 51,9% – 38,9%
X – (– 0,82Mpa) =========== – 0,97Mpa – (– 0,82Mpa)
11.1% ===================13%
X + 0,82Mpa == – 0,15Mpa
Multiplicando em cruz:
13% (X + 0,82Mpa) = 11,1% (- 0,15Mpa);
13%X + 10,7%Mpa = – 1,7%Mpa;
13%X = – 10,7%Mpa – 1,7%Mpa;
X = – 9%Mpa/13%X
X = – 0,69Mpa
Por interpolação, o ponto onde 50% das células estão plasmolizadas é – 0,69Mpa.
Utilizando a visualização de 40X, conseguiu-se visualizar as seguintes estruturas: parede celular, membrana plasmática, núcleo, vacúolo e citoplasma. Notou-se também que o protoplasto (região interna da célula constituída pela membrana plasmática, citoplasma, núcleo e vacúolo) se desprende da parede celular ficando como se fosse murcho (Figura1).
Figura 1 Célula vegetal normal (a); Plasmólise (b); Plasmólise avançada (c) e deplasmólise (d). Onde 1-Parede celular; 2-Membrana plasmática; 3-Núcleo; 4-Vácuoolo; 5-Citoplasma
Discussão
A situação de “plasmólise incipiente (limite plasmolítico)” recebe a qualidade de limite pois soluções com menor potencial de água (mais concentradas) retirariam osmoticamente mais água das células intensificando a plasmólise e plasmolizando praticamente todas as células do tecido. Segundo Vieira et al. (2010), essa situação seria indesejada, pois não estaríamos mais na plasmólise incipiente e a célula, perdendo água, se concentraria mudando o seu potencial osmótico (Ψπ). Sob concentrações com maior potencial de água (soluções menos concentradas como a de 0,1; 0,15M) nenhuma ou poucas células estariam plasmolizadas. Nessa situação submersa em solução de maior potencial de água o protoplasma da célula ganharia preferencialmente água da solução (ou perderia muito pouco) não havendo plasmólise e mantendo certa turgescência. A pressão de turgescência (Ψt) seria ainda positiva (Pedroso, 2005).
Quando o ponto de plasmólise incipiente se manifesta o potencial osmótico das células epidérmicas de Rhoeo discolor é de – 0,69 Mpa (ver cálculos nos resultados), desigual das células em turgescência. Se há plasmólise a plasmalema pode estar ainda encostada na parede celular em alguns pontos da célula, mas não empurra a parede celular e, nessa condição, a parede celular certamente também não empurra a plasmalema e o protoplasto. Assim, o valor da pressão de turgescência (Ψt) é igual a zero, ou seja, Ψt é nulo. Então, pela equação Ψc = Ψπ + Ψt (Vieira et al., 2010), tem-se Ψc = Ψπ. Por último calculando o valor de potencial osmótico da célula (Ψπ) podemos obter o valor de potencial de água da célula (Ψc), pois os dois são iguais quando a célula está plasmolizada.[2: Potencial de água da célula][3: Potencial osmótico da célula][4: Pressão de turgescência]
Em soluções com concentrações de valor maior a plasmólise se acentua e a pressão de turgescência (Ψt) de praticamente todas as células do tecido é igual a zero. Todas as células estariam plasmolizadas e em plasmólise acentuada. Por que não usamos então qualquer solução com valor ainda menor de potencial de água para obtermos o valor de potencial osmótico (Ψπ)? Porque nessas concentrações a plasmólise já está acentuada, as células perderam água demasiadamente, se concentraram, e o valor de potencial osmótico da célula (Ψπ) não é mais aquele que originalmente as células teriam (Salisbury & Ross, 1992).
Após deixarmos os tecidos durante 30 minutos nas soluções de sacarose com diferentes concentrações as células se plasmolizaram ou não, dependendo do potencial de água da solução. O tempo de espera de 30 minutos serve para as células entrarem em equilíbrio energético com a solução (ganhando e perdendo água). Após esse período as células do tecido da epiderme de Rhoeo discolor não ganham nem perdem mais água para a solução de maneira preferencial, ou seja, a mesma quantidade de água que sai da célula também entra. Nessa situação a célula está em equilíbrio energético com a solução (Assis Prado & Casali, 2012 e Costa, 2009). O equilíbrio ocorreu após a célula ganhar água preferencialmente durante 30 minutos. Se o tecido está em equilíbrio energético com a solução, então podemos afirmar que os potenciais hídricos da célula (Ψc) e da solução (Ψs) são iguais, não há mais um sentido preferencial de passagem de água para a célula ou para a solução. Se os potenciais hídricos são iguais após os 30 minutos de espera, então podemos obter o valor de potencial de água da solução (Ψs) e consequentemente o valor de potencial de água da célula (Ψc). Após obtermos o potencial de água da célula (Ψc) certamente teremos o potencial osmótico (Ψπ) se essa célula estiver plasmolizada.
 
Notar que esse método de plasmólise incipiente para obtermos os valores de potencial osmótico (Ψπ) de um tecido vegetal, ela envolve muitos conceitos importantes em relações hídricas como potencial osmótico, potencial hídrico, potencial de turgescência, plasmólise e plasmólise incipiente. Dessa forma, esse método de determinação de Ψπ é ideal para ilustrar componentes do potencial hídrico (potencial osmótico e pressão de turgescência), suas unidades e sua determinação matemática em um estado particular da célula, a plasmólise. Seria muito difícil utilizarmos os valores da constante de dissociação para os solutos na célula e calcularmos directamente o valor de potencial osmótico (Ψπ), pois são muitos os solutos e a constante de dissociação vária em função da própria concentração dos solutos. Dessa forma, usamos apenas um soluto não tóxico e compatível como metabolismo vegetal (a sacarose, que não se dissocia em água) com a constante de dissociação igual a 1 e induzimos uma situação onde o equilíbrio energético existe entre a célula e a solução em coincidência com o evento da plasmólise incipiente (limite plasmolítico). 
CONCLUSÃO
O potencial de água da célula é a medida da energia livre da água da célula. Com o valor do potencial de água da célula podemos saber se ocorrerá preferencialmente a entrada ou saída da água da célula em contacto com outra célula ou submersa em uma solução. O potencial de água da célula é o resultado de dois componentes simultâneos, a pressão hidráulica ou de turgescência exercida pela parede celular sobre o protoplasto e a pressão osmótica exercida pelos solutos celulares. Somando os dois componentes, o hidráulico e o osmótico, obtemos o valor do potencial hídrico. No entanto, se a célula está plasmolizada a pressão que a parede exerce sobre o protoplasto é igual a zero. Assim, a plasmólise serve para anularmos a pressão de parede e igualarmos o potencial hídrico com o osmótico. Dessa forma, em células plasmolizadas, podemos estimar o valor do potencial osmótico se soubermos o potencial hídrico da solução em equilíbrio energético com a célula que induziu o início da plasmólise. Esse início da plasmólise em mais da metade das células do tecido vegetal é denominado de plasmólise incipiente. Para as células epidérmicas das folhas de Rhoeo discolor, o potencial osmótico em que 50% das células se encontram plasmolizadas é de – 0,69Mpa. 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
PEDROSO, J. J. Lima de, (2005) Biofísica Médica, 2ª Edição, Coimbra: Imprensa da Universidade de Coimbra, 2005. Capitulo 1, pp. 50
ASSIS PRADO, C. H. DE; & CASALI, C. A. (2012) Manual de Laboratório de Fisiologia Vegetal. Universidade Federal de São Carlos, Departamento de Botânica, Laboratório de Fisiologia Vegetal, São Carlos, SP, Brasil
VIEIRA, E. L.; SOUZA, G. Santos de; SANTOS, A. Ranulfo dos; SILVA, Jain dos Santos. (2010). Manual de fisiologia vegetal. São Luís: EDUFMA. 17p.
COSTA, R.C.L.da, (2009). Manual de Laboratório de Fisiologia Vegetal. Universidade Federal Rural da Amazônia-PA – apostila
CORREIA, S. (2012), WikiCiências, 3(11):0684, <http://wikiciencias.casadasciencias.org/index.php/Potencial_h%C3%ADdrico>. Arquivo capturado em 13 de Março de 2013
CRUZ, G. S. (2006). Apontamentos de Fisiologia Vegetal – Capítulo I: As Plantas e a Água Universidade de Coimbra, Portugal, 42pp.
SALISBURY, F.B. & ROSS, C.W. (1992) Plant physiology. Belmont, Wadsworth, 682 p.

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