Cultura de microrganismos e provas bioquímicas

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10/02/2006
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CULTURA DE 
MICRORGANISMOS E 
PROVAS BIOQUÍMICAS
Microbiologia Básica
Associação de métodos
 Diferentes espécies podem apresentar morfologia e metabolismo idênticos.
Assim, a identificação requer a observação de um conjunto complexo de
características:
 Morfologia celular: dimensões, forma, arranjos, comportamento tintorial,
estruturas e mobilidade.
 Características culturais: formas de crescimento das colônias em diferentes
meios (meio em placas, meio inclinado, meio líquido, gelatina), odor.
 Ecologia: hábitat, proveniência, condições ambientais, patogenicidade,
hospedeiros, resistência.
 Genética: sequência de genes específicos.
 Fisiologia: exigências nutritivas, fontes de carbono e nitrogênio, fatores de
crescimento
Primeiros procedimentos
 Observar características morfológicas:
 Meio de cultura líquido
 Preparar lâmina a fresco – Motilidade
 Preparar lâmina corada (Gram) – forma, arranjos
 Estriar as bactérias em placas com ágar
 observar morfologia das colônias (cor, formato, tamanho, bordas,
textura, elevação)
Cultura em placa
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Coloração de Gram
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Bacillus cereus
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Staphylococcus epidermidis
Serratia marcescens
Pseudomonas fluorescens
Coloração BAAR
 Visualização de bacilos álcool-ácido-resistentes
 Circundados por uma parede celular hidrofóbica contendo ácido micólico
 Resistem a descoloração
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Coloração de esporos
 Verde malaquita  corante primário;
 Lavagem;
 Fucsina (safranina) cora o restante da bactéria;
 Bactéria  verde e rosa;
Provas Bioquímicas
 As bactérias podem ser identificadas por características do seu
metabolismo, como a capacidade de degradar determinados substratos e
produzir gases.
 As provas bioquímicas utilizam meios de cultura e reagentes específicos
para detectar metabólitos resultantes da atividade bacteriana, auxiliando
na sua identificação.
 As provas mais conhecidas são:
 Utilização de fontes de carbono
 Utilização de fontes de nitrogênio
 Produção de enzimas
 Motilidade
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Motilidade
 A motilidade é observada através do aspecto do meio.
 Utiliza-se um meio semi-sólido o que permite o crescimento bacteriano no
interior do meio, por todo o tubo.
 Se a bactéria for móvel (motilidade positiva), o aspecto do meio será turvo
 Se a bactéria for imóvel (motilidade negativa), o crescimento só será
observado no local de inoculação.
Meios que podem ser usados:
SIM 
(Sulfato, Indol, Motilidade)
MILI 
(Motilidade, Indol, Lisina)
MIO
(Motilidade, Indol, Ornitina)
Catalase
 Algumas bactérias são capazes de produzir a enzima catalase.
 Decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) liberando água e oxigênio
molecular (O2) – produção de bolhas.
2 H2O2 → 2 H2O + O2
 Coloca-se uma gota da cultura líquida em uma lâmina e deposita-se sobre
ela uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%.
 Distinção entre Staphylococcus e Streptococcus
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Oxidase
 As bactérias que produzem a enzima oxidase apresentam um sistema de
transporte de elétrons denominado sistema citocromo oxidase.
 Na presença de oxigênio atmosférico, são oxidados pela citocromo
oxidase, formando um composto colorido.
 A determinação da oxidase é um teste diferencial importante na
identificação de bactérias Gram negativas.
Vermelho de Metila (VM)
 Avalia se as bactérias produzem ácidos a partir da fermentação da glicose
pela via ácida mista.
 Podem ser produzidos: ácido fórmico, lático, acético, provocando redução do
pH abaixo de 4,4 ( viragem do indicador).
 Todas as enterobactérias fermentam glicose.
 Porém, algumas, durante a fase final de incubação, convertem esses ácidos a
produtos não ácidos como o etanol e a acetoína, resultando num pH mais
elevado (pH 6).
 O indicador de pH é o vermelho de metila
 pH abaixo de 4,4 é vermelho
 acima de 6 é amarelo
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Voges Proskauer (VP)
 Há bactérias que utilizam a fermentação butilenoglicólica.
 Fermentam a glicose produzindo acetil-metil-carbinol (acetoína),
butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos.
 Quando KOH é adicionado, e na presença de O2 atmosférico, a acetoína é
oxidada a diacetil.
 A adição de alfa-naftol nesta reação catalisa a produção de um anel
vermelho tijolo, após 10-15 minutos.
Citrato
 Determina se a bactéria é capaz de utilizar o citrato de sódio como única
fonte de carbono para crescer.
 Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, contendo citrato de sódio,
fosfato de amônia e azul de bromotimol.
 Com a facilidade do transporte de citrato pela citrato-permease há a sua
utilização pela citrase, com produção de hidróxido de amônia que eleva o
pH, fazendo com que a reação se torne azul.
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Produção de H2S
 Algumas bactérias são capazes de degradar compostos contendo enxofre
através da tiossulfato redutase.
 Ocorre a produção de H2S que é incolor.
 O H2S reage com o ferro (indicador) formando um precipitado preto
(sulfeto ferroso).
TSI 
Three 
Sugar 
Iron
Fenilalanina
 Há bactérias que produzem enzimas que removem o grupo amina da
fenilalanina presente no meio
 Origina o ácido fenilpirúvico.
 O ácido fenilpirúvico reage com o cloreto férrico (10%) adicionado ao
meio, formando uma cor verde.
 Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias.
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Lisina
 Algumas bactérias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a
porção carboxila dos aminoácidos.
 Nas etapas iniciais de incubação, o tubo torna-se amarelo devido à
fermentação da glicose.
 Se o aminoácido é descarboxilado o meio retorna à cor púrpura. A reação
se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com óleo mineral
para agilizar o processo
Indol
 O indol é produzido pela ação da enzima triptofanase sobre o triptofano
existente no meio de cultura
 Ocorre a produção de ácido pirúvico e amônia.
 O indol pode ser detectado pela formação de um anel rosa (pink) na
parte superior do tubo, após a adição do reativo de Erlich.
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Uréia
 Há bactérias que possuem a enzima urease - capacidade de degradar a
uréia presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O.
 A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio.
 O indicador de pH é o vermelho de fenol, que em meio alcalino toma a
coloração pink.
Coagulase
 A bactéria produz a enzima coagulase, que na presença do plasma
provoca sua coagulação.
 Prova aceita universalmente para a diferenciação do S. aureus
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Meio IAL
 Utilizado para a identificação de enterobactérias.
 Em apenas 1 tubo é possível fazer 9 provas bioquímicas diferentes
 Fácil manuseio, porém, interpretação difícil.
 E. coli, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Providencia spp., Morganella
morganii, Proteus, Salmonella, Citrobacter, Serratia, Vibrio e Não
fermentadoras
Testes comerciais
 Existem testes que são comercializados para uso laboratorial
 Feitos em pequena escala – poupam espaço
 Os meios vêm prontos ou desidratados – economizam tempo e material
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H2S Ure Ind VPCit
API 20E system
Lis Gli Man Sor Sac
Bactray
Laminocultivo
 Laminocultivos são estruturas, geralmente plásticas de tampa e rosca,
estéreis.
 Contêm meios de cultura que são acondicionados em lâminas com três
divisões inseridas em um tubo transparente.
 Os meios de cultivo que compõem os Laminocultivos destinam-se a propiciar
o crescimento e o estudo das bactérias de interesse médico.
 Ex.: laminocultivo para urocultura - Contém: ágar Cled, Citrato de Simmons
e Meio I (ágar MacConkey modificado).
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Antibiograma
 Teste de sensibilidade a diversos antibióticos.
 Deve-se espalhar o inóculo de maneira uniforme sobre a placa (grande),
garantindo que nenhum espaço fique vazio.
 Fazer o cultivo em meio líquido, padronizar e mergulhar um swab.
 Passar o swab em todas as direções em uma placa contendo ágar Mueller
Hinton.
 Colocar os antibióticos a serem testados com o auxílio de uma pinça.
 Esperar crescer e medir o halo de inibição.
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