Métodos sorológicos de Diagnóstico e Pesquisa

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Métodos sorológicos de 
Diagnóstico e Pesquisa
Reação Ag-Ac in vitro
Testes sorológicos
� Uso de soro ou outros fluidos biológicos de 
paciente p/ diagnóstico laboratorial
� Demonstração de anticorpos específicos = 
diagnóstico presuntivo (indireto)diagnóstico presuntivo (indireto)
� Demonstração de agente infeccioso ou 
antígeno do agente = diagnóstico diret
Vantagens dos testes sorológicos 
� Rapidez
� Simplicidade
� Possibilidade de automação� Possibilidade de automação
� Armazenamento de material biológico
� Baixo custo operacional 
� Oferta de kits comerciais padronizados
Aplicações dos testes sorológicos 
� 1 – Diagnóstico presuntivo e diferencial
� 2 – Diferenciação de fases da doença
� 3 – Diagnóstico de alergias
� 4 – Diagnóstico de doenças autoimunes 
� 5 – Diagnóstico de imunodeficiências congênitas
6 – Seleção de doadores de sangue� 6 – Seleção de doadores de sangue
� 7 – Seleção de doadores de órgãos para enxertos
� 8 – Dosagens hormonais
� 9 - Prognóstico da doença 
� 10 – Avaliação da eficácia da terapêutica instituída
� 11 – Avaliação da imunidade específica (vacinação) 
� 12 – Pesquisa de antígenos em células ou tecidos
� 13 – Pesquisas epidemiológicas
� 14 - Pesquisa básica e aplicada
Áreas de conhecimento que utilizam 
métodos sorológicos 
� Imunologia
� Patologia
� Alergologia
� Microbiologia (bact., vírus, fungos)� Microbiologia (bact., vírus, fungos)
� Morfologia
� Hematologia
� Endocrinologia
� Oncologia
Forças de ligação envolvidas nas 
reações:
� Conjunto de reações fracas que 
estabilizam a ligação entre 
moléculas de antígenos e de 
anticorpos:anticorpos:
� Pontes de hidrogênio
� Ligações iônicas
� Forças hidrofóbicas
� Forças de Van der Waals
Fatores que interferem na ligação entre 
Ag e Ac
� Especificidade dos anticorpos
� Afinidade dos Ac
� Avidez dos Ac
� Concentração dos Ac e antígenos
� Classe dos anticorpos envolvidos
� Pureza dos antígenos utilizados 
Afinidade x avidez
� Afinidade: Força de ligação resultante do 
total de forças não-covalentes entre um 
único sítio de ligação do Ac e um único 
epítopo do antígeno. Depende do grau de 
complementariedade entre as duas 
moléculas. 
� Ac de baixa afinidade ligam-se de modo � Ac de baixa afinidade ligam-se de modo 
fraco e tendem a se dissociar com 
facilidade. Ac de alta afinidade
estabelecem ligações fortes e mais 
duradouras.
� Avidez: Força resultante de interações múltiplas
entre uma molécula de anticorpo e os epítopos de 
um antígeno complexo. Quanto mais sítios de 
ligação tiver um anticorpo (ex. Fragmento 
Fab<IgG monomérica<dímero<pentâmero).
� Em geral quanto maior a avidez, melhor seu 
efeito biológico final (ex. reconhecimento de 
antíegos complexos sobre a superfície de 
Afinidade x avidez
antíegos complexos sobre a superfície de 
patógenos)
� A baixa afinidade de um Ac pode ser compensada 
por sua elevada avidez.
Fatores que interferem na ligação entre 
Ag e Ac
� Concentração dos anticorpos 
(equilíbrio entre concentração de Ag 
e Ac)
� pH do meio de reação� pH do meio de reação
� Temperatura de reação
� Tempo de reação
Equilíbrio de concentração de Ag e Ac
Fatores que interferem na ligação entre 
Ag e Ac
� Concentração dos anticorpos (equilíbrio entre 
concentração de Ag e Ac)
� pH do meio de reação: pH ácido=desfaz reação
� Temperatura de reação: em geral o aumento de 
temperatura torna a reação mais rápida. Cuidado: 
não deixar denaturar os componentes da reação. não deixar denaturar os componentes da reação. 
Reações com complemento devem ser à baixa 
temperatura.
� Tempo de reação: Quanto maior o tempo, mais 
fortes as ligações Ag-Ac e maior a probabilidade 
de dar reação positiva. Algumas reações ocorrem 
em minutos, outros requerem muitas horas. Em 
geral dependem da quantidade de reagentes 
usados na reação.
Conceitos básicos em sorologia
� Título 
� Teste de referência
� Sensibilidade
� Especificidade
Falso-positivo, falso-negativo� Falso-positivo, falso-negativo
� Reação cruzada 
� Precisão
� Acurácia ou exatidão
� Reprodutibilidade
� Limiar de reatividade (cut off)
Título
� Título de uma soro ou solução de anticorpos 
(Igs), refere-se à máxima diluição na qual um 
teste continuando dando reação positiva.
� Por exemplo, quando dizemos que um soro deu 
título de 1:5000 para toxoplasmose, significa que 
mesmo diluindo-se a amostra 5000 vezes, a mesmo diluindo-se a amostra 5000 vezes, a 
reação continua positiva.
� Uma mesma amostra pode ter título de 1:100 em 
um tipo de teste (por exemplo no teste de 
precipitação) e título de 1:10.000 em outro teste 
(por exemplo ELISA). Isso dependerá do limiar de 
detecção de cada ensaio. 
Teste de referência
� Teste já conhecido e usado para um 
determinado propósito, com o qual uma 
nova metodologia deve ser comparada 
durante sua padronização. São chamados 
também de padrão-ouro.também de padrão-ouro.
� Por exemplo, qualquer teste sorológico 
proposto para o diagnóstico da doença de 
Chagas, deve ser comparado com o 
xenodiagnóstico, baseado na demonstração 
de que o paciente tem o parasita circulante. 
� A sensibilidade de um teste sorológico refere-se 
à percentagem de resultados positivos na 
população sabidamente doente, isto é, a 
proporção de resultados positivos verdadeiros. 
Resultado falso-positivo = refere-se a reações 
Sensibilidade de um teste sorológico
� Resultado falso-positivo = refere-se a reações 
positivas em indivíduos sabidamente sadios
� O termo sensibilidade é também usado para 
definir o limiar de detecção de um método, isto 
é, a quantidade mínima de Ac detectável. 
Especificidade de um teste sorológico 
� A especificidade é definida pela 
percentagem de resultados negativos em 
pacientes sabidamente sadios, isto é, à 
proporção de resultados negativos 
verdadeiros. Em outras palavras, um verdadeiros. Em outras palavras, um 
teste com alta especificidade fornece 
poucos dados falso-positivos. 
� Resultados falso-negativos: corresponde 
às reações negativas em pacientes 
sabidamente doentes. 
Reação-cruzada
� Uma reação cruzada é resultado da 
similaridade tridimensional entre duas 
moléculas de antígenos diferentes.moléculas de antígenos diferentes.
� Assim, um Ac gerado contra uma das 
moléculas pode reagir com a outra, ainda que 
sua afinidade seja mais baixa.
� Um exemplo prático das reações cruzadas é a 
que se observa entre alguns anticorpos 
contra leishmania que reagem cruzadamente 
com antígenos de tripanossomas
Precisão
� Expressa a concordância dos resultados 
obtidos após várias repetições e traduz a 
possibilidade de erro acidental do método.
� Quanto maior a precisão do teste, menor a 
influência que sofre das condições de influência que sofre das condições de 
execução (temperatura, pH, manuseio, 
tempo, etc)
A B
Exatidão ou acurácia
� Determina a capacidade do teste em 
fornecer resultados muito próximos ao 
verdadeiro valor do que está sendo 
medido. Detecta erro do sistema ou 
tendência de desvio.tendência de desvio.
A B
Reprodutibilidade
� Refere-se à obtenção de resultados 
iguais em testes realizados com a 
mesma amostra, por pessoas 
diferentes em locais diferentes.diferentes em locais diferentes.
Limiar de reatividade (“cut off”)
� O limiar de reatividade ou cut off de um 
teste é entendido como o ponto de corte 
de um teste, isto é, o valor acima do qual 
se deverá considerar o resultado como 
positivo.positivo.
� A rigor, não existe um teste sorológico 
que estabeleça claramente o que é um 
resultado positivo e um negativo, pois 
sempre existem amostras cujos 
resultadosficam em uma zona “duvidosa”
Limiar de reatividade (“cut off”)
a
b
%
a
b
a
b
%
b
Títulos
bb
Títulos
A = não doentes; b = doentes 
Antígenos solúveis e antígenos 
particulados
� Reações com antígenos Solúveis:
� Precipitação em gel
� Precipitação em meio líquido
� ELISA
� Radioimunoensaio
� Quimioluminscência
� Western-blot
� Reações com antígenos particulados:
� Hemaglutinação
� Aglutinação de látex
Antígenos solúveis e antígenos 
particulados
� Imunofluorescência (citometria de 
fluxo)
� Imuno-histoquímica
Interação Ag Interação Ag Interação Ag Interação Ag –––– AcAcAcAc
Formação de complexos dependente da doseFormação de complexos dependente da doseFormação de complexos dependente da doseFormação de complexos dependente da dose
Reação de precipitação em meio 
líquido 
Reação de precipitação Reação de precipitação Reação de precipitação Reação de precipitação ---- OUCHTERLONYOUCHTERLONYOUCHTERLONYOUCHTERLONY
Imunodifusão dupla de Ouchterlony 
Reação de precipitação Reação de precipitação Reação de precipitação Reação de precipitação ----
MANCINIMANCINIMANCINIMANCINI
Imunodifusão radial de Mancini
Nefelometria
Reação-cruzada – tipagem ABO
ImunofluorescênciaImunofluorescênciaImunofluorescênciaImunofluorescência
Imunofluorescência Imunofluorescência Imunofluorescência Imunofluorescência –––– variações do métodovariações do métodovariações do métodovariações do método
Radiação 
U.V. ou 
laserlaser
photo
n 
Imunofluorescência 
indireta para Giardiaindireta para Giardia
Detecção de autoanticorpos Detecção de autoanticorpos Detecção de autoanticorpos Detecção de autoanticorpos 
FITC – isotiocianato de fluoresceína – verde 
Tex – Texas red - vermelha
Ensaios 
Imunoenzimáticos (EIE)
UTILIZAM UMA ENZIMA PARA GERAR O SINAL DA REAÇÃO 
ANTÍGENO-ANTICORPO
Enzyme-Linked
Immunosorbent AssayImmunosorbent Assay
ELISA ELISA ELISA ELISA ---- EnzymeEnzymeEnzymeEnzyme----Linked ImmunoSorbent AssayLinked ImmunoSorbent AssayLinked ImmunoSorbent AssayLinked ImmunoSorbent Assay
Método indireto
ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Reação indireta
ELISAELISAELISAELISA
Método de captura ou sanduíche
ELISAELISAELISAELISA
Captura para IgM
ELISAELISAELISAELISA
Competição com anticorpo marcado
ELISAELISAELISAELISA
Competição com antígeno marcada
Western BLOTTINGWestern BLOTTINGWestern BLOTTINGWestern BLOTTINGWestern BLOTTINGWestern BLOTTINGWestern BLOTTINGWestern BLOTTING
Western BLOTTINGWestern BLOTTINGWestern BLOTTINGWestern BLOTTING
Immunoblotting 
Imuno-histoquímica
RadioimunoensaioRadioimunoensaioRadioimunoensaioRadioimunoensaio
Antígenos de agentes infecciosos
Hormônios
medicamentos
RadioimunoensaioRadioimunoensaioRadioimunoensaioRadioimunoensaio