Eletroforese: técnica de separação em biologia molecular

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE BIOFÍSICA
AULA IV – ELETROFORESE
CAIO PONTE CARVALHO FERREIRA
FORTALEZA
MAIO/2018
INTRODUÇÃO
A eletroforese consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de um campo elétrico (HENEINE, 2010), sendo a técnica mais utilizada em laboratórios, pois tem muitas aplicações. A vantagem da eletroforese é que as moléculas podem ser visualizadas e separadas, permitindo-se estimar o número de proteínas ou sua pureza, também pode ser utilizada para determinar o ponto isoelétrico de proteínas, como estimar sua massa molecular.
Quando a separação envolve solutos com caráter ácido-base, a mobilidade eletroforética do soluto depende do pH do eletrólito. Assim sendo, o controle do pH é aconselhável e a escolha de uma solução tampão adequada tem implicações diretas na otimização da separação (TAVARES, 1997).
O uso de géis tais como amido, poliacrilamida, agarose, e agarose-acrilamida como meio de suporte fornece uma resolução melhorada, particularmente com proteínas e ácidos nucléicos (FREIFELDER, 1982). Um método eletroforético comumente empregado para estimar a pureza e a massa molecular utiliza o detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) (NELSON & COX, 2014).
A eletroforese é utilizada na separação de proteínas, mas existem métodos que não desnaturam a proteína como a eletroforese com SDS faz, para esse caso existe a eletroforese nativa, mas existem métodos mais simples. O uso mais importante da eletroforese vem da separação de ácidos nucléicos, usados na identificação de espécies, identifica semelhanças de organismos, o que é importante na filogenia, existência de parentesco, identificação de doenças geneticamente transmitidas e outras aplicações. Está claro a importância que ela tem na pesquisa da área de biologia com também no cotidiano, como por exemplo o sistema judicial, sendo uma técnica indispensável para a educação do biólogo, foi feita essa prática.
OBJETIVOS
Calcular a massa molecular de proteínas por PAGE-SDS, após corrida eletroforética;
Verificar, em laboratório, a migração de proteínas num campo elétrico.
MATERIAIS E MÉTODOS
Preparação das Placas: Placas de vidro são lavadas com detergente e enxaguadas em água corrente, sendo, em seguida, secas e limpas com álcool 70%. Espaçadores de plástico (0,1 cm de espessura), untados com vaselina (ou gel de silicone), são dispostos entre as placas de vidro de modo a receber a mistura líquida de poliacrilamida e formação do gel.
Preparo do Gel de Separação (12,5%, para uma 1 placa do sistema médio): O gel de separação é preparado segundo as soluções descritas na Tabela 1.
Tabela 1: gel de separação
	Solução
	Componente
	Volume de solução
	1
	Água
	2545 µl
	2
	Acrilamida 30,0 g
Bis-Acrilamida 0,8 g
Água q.s.p. 100 mL
	3333 µl
	3
	TRIS 36,3 g
HCl 1M 48,0 mL
Água q.s.p. 100 mL pH 8,8
	2000 µl
	4
	SDS (10%, m/v)
	80 µl
	5
	Persulfato de amônio (10%, v/v)
	36 µl
	6
	TEMED (99%, v/v)
	6 µl
	VOLUME TOTAL
	
	8 mL
Preparo do Gel de Empilhamento (ou gel de aplicação e empilhamento da amostra): O gel de poliacrilamida a 3,5% é chamado de gel de aplicação ou gel de empilhamento, das amostras. Deve ser feito após o gel de separação já ter polimerizado, pois sua mistura constituinte é colocada sobre esse gel, perfazendo, aproximadamente 1,5 a 2,0 cm de altura. Ainda com esse gel líquido, um molde de plástico (pente com 10 dentes) deve ser introduzido para moldar os poços de aplicação das amostras. Sua polimerização é efetuada à temperatura ambiente. A Tabela 2 traz os seus constituintes.
Tabela 2: gel de aplicação e empilhamento das amostras
	SOLUÇÃO
	COMPONENTE
	VOLUME 
	1
	Água
	2216,5 µl
	2
	Acrilamida 30,0g
Bis-Acrilamida 0,8g
Água q.s.p. 100 mL
	350 µl
	3
	TRIS 6,0g
HCl 1N 48,0 mL
Água 40,0 mL pH 6,8
	375 µl
	4
	SDS (10%, m/v)
	30 µl
	5
	Persulfato de amônio (10%, v/v)
	22,5 µl
	6
	TEMED (99%, v/v)
	9 µl
	VOLUME TOTAL
	
	3 mL
Montagem do sistema de Corrida: Após preparação dos géis, as placas são fixadas em cubas verticais. Nos reservatórios das cubas é colocado tampão de corrida (Tris-Glicina, pH 8,6, diluído 1:10 com H2O ultrapura).
Preparação e Aplicação das Amostras: Para a corrida eletroforética, as amostras são tratadas com o tampão de amostra quatro vezes concentrado contendo tampão Tris-HCl 1,0 M, pH 6,8, contendo SDS (10%, v/v), 100 mM DTT (Ditiotreitol, agente redutor) (ou β-mercaptoetanol), glicerol (12%, v/v), 50 mM EDTA, 50 mM EGTA. As amostras são aquecidas por 5 minutos, centrifugadas (10.000 xg, 15 min), o sobrenadante cuidadosamente transferido para um novo tubo e aplicado nos poços do gel de empilhamento.
Corrida Eletroforética: Após a aplicação das amostras, conecta-se a cuba a uma fonte de corrente contínua e se faz a corrida usando corrente fixa de 15 mA/gel e diferença de potencial em torno de 250 volts.
Coloração e Descoloração: Após a corrida eletroforética, os géis são retirados dos moldes de vidro e imersos em solução fixadora de metanol, ácido acético e água, 400:70:530 (v/v) durante 40 minutos. Em seguida, são colocados em solução corante de Coomassie Blue R250 durante 3 a 4 horas. Transcorrido o tempo de coloração, o gel é deixado em solução descorante de álcool etílico, ácido acético e água, 200:50:250 (v/v), até a completa evidenciação das bandas. Também pode-se ser usado o nitrato de prata.
RESULTADOS
Figura 1: Resultado da corrida eletroforética
Legenda: Sigma – Quimotripsina (1); L. auriculata – Extrato de Semente (2); L. auriculata– Exsudato de sementes (3); C. jamacaru – Extrato de sementes (4); Sigma – Quimotripsina (5); L. auriculata – Extrato de Semente (6); L. auriculata – Exsudato de sementes (7); C. jamacaru – Extrato de sementes (8)
No resultado da corrida colorido com Coomassie Blue, pode-se observar oito bandas, no qual o material da banda 1 possui a proteína isolada que se quer estudar, neste caso, a tripsina. As raias de 1 a 4 contém 10 µl enquanto de 5 a 8 contém 5 µl.
DISCUSSÃO
O TEMED (tetrametiletilenodiamina) catalisa a liberação de radicais livres do persulfato de amônia que, por sua vez, iniciam a polimerização, por isso é o último a ser adicionado no gel, a polimerização fixa o líquido e após a adição de TEMED tem que ser colocado no suporte rapidamente.
O gel de empilhamento utilizado tem o objetivo de concentrar a amostra da proteína para formar bandas finas antes de entrar no gel de separação, como também produzir as cavidades onde são inseridas as amostras de eletroforese. Quando a corrente é ligada, os íons do tampão do recipiente superior migram para dentro do gel de empilhamento, enquanto os íons do tampão do gel de empilhamento migram mais à frente. À medida que isso vai acontecendo, os íons do tampão do reservatório superior encontram um pH que é bem menor do que o seu pK. Portanto, esses íons adotam sua forma neutra e se tornam eletroforeticamente imóveis, levando a um aumento de carga, após isso as macromoléculas, esse efeito faz com que cheguem no gel de corrida em formato de bandas ou discos estreitos. Quando passam para o gel de corrida eles diminuem de velocidade (VOET & VOET, 2013). O gel de empilhamento em pH de 6,8 em conjunto do gel de separação com pH em 8,8 envolvem um fenômeno chamado isotacoforese.
Se estivéssemos analisando uma proteína de massa molecular de 50 kDa, o gel de poliacrilamida mais apropriado para a visualização da proteína teria 12,5% de malha, já que uma malha com tamanhos de poros menores poderia impedir a corrida da proteína, podendo ficar retida em algum ponto do gel.
Um SDS ligado contribui com uma grande carga final negativa, tornando a carga intrínseca da proteína insignificante e conferindo a cada proteína uma razão carga-massa semelhante. A ligação de SDS desdobra parcialmente as proteínas, então a eletroforese na presença de SDS separa proteínas quase queexclusivamente com base em sua massa molecular, com os peptídeos menores migrando mais rapidamente (NELSON & COX, 2014). Outros componentes que fazem a quebra das ligações dissulfeto entre as proteínas, são o DTT e o β-mercaptoetanol e impedem a reformação da ligação. Então se forem usados o SDS junto de DTT ou β-mercaptoetanol, terão mais bandas que uma amostra apenas com SDS, pois como há a quebra de pontes dissulfeto e divisão das cadeias em subunidades, logicamente terão mais bandas.
Exatamente por causa do SDS usado nesta prática, as moléculas adquiriram uma carga negativa e migraram para o ânodo a partir da ação do potencial elétrico.
Os corantes usados para a visualização das bandas são o Coomassie Blue e o nitrato de prata, a mancha do Coomassie é mais sensível sendo melhor para a visualização de macromoléculas maiores que 100 ng. Tem capacidade de distinção entre proteínas e ácidos nucléicos, como fácil manuseio, mas tem reprodutibilidade muito baixa. O nitrato de prata revela proteínas de até 1 ng, sendo muito mais sensível, mas tem reprodutibilidade menor que o Coomassie além de ser prejudicial à saúde.
Pode-se determinar a massa molecular de uma proteína pela eletroforese comparando as distâncias da banda ao começo da cavidade da proteína com essa mesma distância do marcador molecular com massa molecular conhecida e essa migração eletroforética, expressa como mobilidade relativa, é proporcional ao logaritmo da massa molecular da proteína.
CONCLUSÃO
Pelo experimento da eletroforese PAGE-SDS, foi possível verificar a migração de proteínas num campo elétrico, como também calcular a massa molecular das proteínas e entender o processo em que as moléculas passam.
REFERÊNCIAS
FREIFELDER, David. Physical biochemistry: applications to biochemistry and molecular biology. 2nd ed.,1982.
HENEINE, I. F. Biofísica básica. 2ª edição. São Paulo: Editora Atheneu, 2010.
NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Artmed Editora, 2014.
TAVARES, Marina FM. Mecanismos de Separação em Eletroforese Capilar Separation Mechanisms in Capillary Electrophoresis. Química nova, v. 20, n. 5, p. 493-511, 1997.
VOET, Donald; VOET, Judith G. Bioquímica. Artmed Editora, 2013.