Aula 5 Enzimologia Gilbert Silveira

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Breve revisão da aula anterior
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Enzimologia
Professor Gilbert de Oliveira
e-mail: gilbert@bioqmed.ufrj.br
A vida e a energia para a vida
Duas condições fundamentais:
Autorreplicação
Metabolismo
Catálise enzimática
A queima de açúcares é a principal forma segundo a qual retiramos energia do meio ambiente para vivermos
Um saco de açúcar pode permane-
cer anos na prateleira do supermercado
A prateleira não tem enzimas!
Nos animais, a glicose libera sua energia química em segundos
Reações catalíticas promovem a oxidação da glicose ao quebrar ligações químicas que armazenam energia
Participam das vias bioquímicas
Enzimas realizam o controle preciso do metabolismo celular
O metabolismo energético 
é um dos principais 
temas de estudo 
da bioquímica
Permitem resposta 
e adaptação a um
meio em mudança 
O que são as enzimas?
Proteínas notáveis, altamente especializadas
Alto grau de especificidade com substratos
Poder catalítico extraordinário
Muito maior do que catalisadores sintéticos
Aceleram reações químicas
Em condições suaves de temperatura e pH
São o centro e o objeto de estudo principal da bioquímica
Atuando de forma organizada catalisam centenas de reações que degradam as moléculas dos nutrientes e conservam suas energias
Doenças ocorrem quando elas não funcionam bem
Como os cientistas descobriram as enzimas?
Um pouco de história
LOUIS PASTEUR
1835: Berzelius, conceito de catálise 
1885: fermentação do acúcar por lêvedos, 
gerando álcool
Vitalismo: o mágico élan vital
1896: Edward Buchner consegue fermentar o açúcar num extrato de lêvedo sem vida!
Fermentos, portanto, catalisavam reações químicas (açúcar a álcool) – biocatalisadores
Enzima vem do grego εν ζυμη, cuja tradução é “no lêvedo”
Louis Pasteur
1822-1895
Um pouco de história
EMIL FISCHER
Hermann Emil Fischer
1852 - 1919
 Sacarase
Quebra da sacarose em glicose e frutose
 Produziu diversos análogos de sacarose para testar se a enzima funcionava
Determinadas mutações tornavam os análogos resistentes à sacarase
Modelo de ação enzimática 
chave-e-fechadura
Um pouco de história
EMIL FISCHER
Hermann Emil Fischer
1852 - 1919
Enzimas são proteínas?
Qual a natureza das enzimas?
O químico orgânico alemão Richard 
Willstätter (1872–1942) – ganhador do 
Nobel pela estrutura da clorofila – 
conseguiu separar o componente enzimático de um preparado biológico e não encontrou nenhuma proteína!
1926 (EUA) – J Summer cristaliza a urease e conclui: enzimas são proteínas!
 Willstater criticou os resultados…
James Batcheller Sumner
1887-1955
SIM! Mas como funcionam?
 Kunitz e Northrop 
Eletroforese e centrifugação: enzimas 
estão na fração protéica!
Mesmo em quantidades proteícas 
indetectáveis pelos métodos, as 
enzimas continuavam tendo atividades
 Como as milhares de reações catalíticas eram possíveis a uma proteína?
John Howard Northrop
1891-1987
POLÍMEROS DE AMINOÁCIDOS?
1902: Emil Fischer (Estrasburgo) e Hofmeister (Berlim), proteínas eram formadas de aminoácidos que, ligados por ligações peptídicas, formavam cadeias polipeptídicas
Finalmente, Sanger
Frederick Sanger
13 August 1918
 1952 
Publica a primeira estrutura primária
de uma proteína: a Insulina, com 51
aminoácidos
O trabalho mostrava também que a 
estrutura das proteínas poderia ser
descrita pela sua sequência de aminoácidos, do N ao C terminal
A sequência, entretanto, não ajudava a prever a função da proteína (antes da bioinformática)
CONCLUSÃO: HISTÓRIA DA BIOQUÍMICA
As enzimas realizam reações catalíticas e transformam moléculas umas nas outras
Os organismos biológicos são ricos em enzimas e as enzimas funcionam também fora dos organismos biológicos → biotecnologia!
As enzimas são proteínas formadas por polímeros de aminoácidos
A multiplicidade de função se dá pela interação tridimensional formada (modelo chave-fechadura) por interações 
não-covalentes a partir de uma série de 
aminoácidos ligados covalentemente 
(ligação peptídica)
>gi|386828|gb|AAA59172.1| insulin [Homo sapiens] 
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR
REAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Toda enzima é proteína?!
Não!, há alguns RNAs que funcionam enquanto enzimas também
Componente químico adicional necessário para a função
Cofator: íons inorgânicos
Coenzima: moléculas orgânicas complexas
Se liga muito firmemente: grupo prostético
Enzima completa: holoenzima
Parte protéica: apoenzima ou apoproteína
Nomenclaturase das enzimas
Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou à atividade realizada
Urease – hidrolisa a uréia
DNA-polimerase – polimeriza DNA
Pepsina – pepsis vem do grego (digestão)
Reação enzimática
Reação se dá em fases: 
Enzima aumenta a velocidade das reações
Os catalisadores aumentam a velocidade das reações por que diminuem a energia de ativação
Equilíbrio químico
As enzimas realizam, muitas vezes, as reações nos dois sentidos 
A concentração de substratos e produtos é o que define a velocidade das reações
Poder catalítico das enzimas vem da energia livre liberada na formação de ligações fracas quando da interação enzima-substrato
Interações fracas entre ES são otimizadas no estado de transição
Bastonase
Estabiliza o substrato
Pauling (1946): Enzima deve ser complementar ao Estado de transição (ET), não ao substrato
ET não é forma estável
Interações fracas entre a enzima e o substrato propulsionam a catálise enzimática
Necessidade de múltiplas interações fracas! Isso explica porque algumas proteínas são tão grandes
Especificidade enzimática
Deriva da formação de múltiplas interações fracas entre a enzima e a molécula do substrato específico
Redução da entropia pela ligação
Dessolvatação do substrato
Ajuste induzido, proteína também muda de conformação
Cinética enzimática
Experimentos de mutagênese sítio-dirigida permitem que os pesquisadores investiguem o papel de cada aminoácido na função protéica
A concentração do substrato [S] influi na velocidade das reações catalisadas por enzimas
Velocidade máxima é a velocidade de catálise enzimática quando todos os sítios ativos estão ocupados com substratos.
Constante de Michaelis
Km = [S] correspondente a ½ Vmax; 
Cinética enzimática
Km
Preferência pelo substrato
Cinética enzimática
Km
Afinidade pelo substrato
Inibição REVERSÍVEL
Inibição competitiva
Inibidor compete pela ligação ao sítio ativo.
Geralmente inibidor tem estrutura similar ao substrato.
Se liga a enzima, e não ao complexo ES.
Reação REVERSÍVEL, logo aumento de substrato diminui a inibição, simplesmente por competição entre eles. QUEM TEM MAIS GANHA. 
Inibição REVERSÍVEL
Inibição competitiva
Inibidor compete pela ligação ao sítio ativo.
Geralmente inibidor tem estrutura similar ao substrato.
Inibição REVERSÍVEL
Inibição Incompetitiva
Inibidor liga em um sítio distinto do sítio ativo, e ao contrário da inibição competitiva, ele se liga somente ao complexo ES
Inibição REVERSÍVEL
Inibição Incompetitiva
Inibidor liga em um sítio distinto do sítio ativo, e ao contrário da inibição competitiva, ele se liga somente ao complexo ES
Inibição REVERSÍVEL
Inibição Não competitiva
Inibidor liga em um sítio distinto do sítio ativo.
Ele se liga tanto à enzima como ao complexo ES
Inibição REVERSÍVEL
Inibição Não competitiva
Inibidor liga em um sítio distinto do sítio ativo.
Ele se liga tanto à enzima como ao complexo ES
Resumo
Non competitive
Inibição IRREVERSÍVEL: ligam-se covalentemente com ou destroem o grupo funcional da enzima que é essencial para atividade ou então forma uma associação não covalente estável. 
A atividade enzimática depende do pH
Enzimas possuem um pH (ou faixa de pH) ótimo na qual a atividade catalítica é máxima.
Porquê? Valendo 0,25 pts 
2 motivos.
A hexocinase
Sofre um ajusteinduzido quando ligada ao substrato
Fosforila um resíduo de glicose
Primeiro passo da via glicolítica
Adição de Xilose “engana” a enzima e faz com que ela fosforile a água
A lisozima
Agente antibacteriano natural encontrado nas lágrimas e clara de ovo
Peptideoglicano da parede de bactérias é seu substrato
Constituinte da parede microbiana que protege da lise osmótica
Enzima rompe ligação glicosídica
Monômero com 129 aa’s
Mecanismo específico de ação enzimática ainda é controverso
“mesmo uma infinidade de experimentos não pode provar que algo esteja certo, mas um único experimento pode provar que está errado”. 
 Albert Einstein
Medicamentos
Muitos inibidores de enzimas são usados para tratar doenças; desde as dores de cabeça até a AIDS
Penicilina (Alexander Fleming, 1928)
Peptideoglicano: polímero de açúcares e D-aa’s da parede bacteriana
Penicilina interfere na síntese do peptideoglicano ao mimetizar um segmento D-Ala-D-Ala
Inibem reação de transpeptidase
Inibidores irreversíveis
Os Beta-lactâmicos
Penicilina: degradada no 
ambiente do estômago
Penicilina V: estável em meio ácido pode ser administrada em via oral
Amoxilina: ampla faixa de ação; antibiótico β-lactâmico + prescrito
O ataque da Ser à porção amida do anel leva a um produto acil-enzima que é praticamente irreversível
Transpeptidase inativa!
Bloqueia síntese da parede bacteriana
Rompe-se devido à pressão osmótica
As Beta-lactamases
Enzimas que quebram o anel beta-lactâmico das penicilinas
Disseminaram-se em bactérias submetidas à pressão seletiva
O mau uso dos antibióticos
Guerra contra as bactérias
Acido clavulânico: inativa irreversivelmente as Beta-lactamases
Clavulin: amoxilina + ácido clavulânico
Foram encontradas bactérias resistentes ao ácido clavulânico...
Desenvolvimento e descoberta de novos antibióticos é uma indústria em crescimento
AZT (azidotimidina)
Mimetiza um nucleotídeo de timina
Azida no lugar de hidroxila
Prejudica a ação da transcriptase reversa
Atrasa o desenvolvimento dos vírus, ainda que, 
aos poucos o vírus se torne resistente
Transcriptase reversa mutante passa a não reconhecer mais o AZT
Outros tratamentos
Inibidores de protease
Impedem a protease do HIV de clivar as proteínas produzindo componentes maduros
Inibidores de integrase
Impedem o vírus de integrar seu DNA no genoma do hospedeiro
Inibidores de fusão
Interferem nas proteínas gp120 e gp41 ou bloqueiam receptores celulares de ligação ao HIV
Coquetel anti-AIDS
dificulta a adaptação do vírus a várias frentes moleculares de ataque, diminui comprovadamente o número de vírus no sangue
Enzimas regulatórias
Possui atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a certos sinais
Ajustes na velocidade da via metabólica permite que as células se adaptem a condições em variação
Tipos mais comuns
Enzimas alostéricas (ligações reversíveis a compostos)
Modificações covalentes
Ativadas por remoção de segmentos peptídicos (irreversível)
Subunidade regulatória é normalmente diferente da subunidade catalítica
Enzimas alostéricas
Homotrópicas: o ativador é o próprio substrato (hemoglobina)
Heterotrópicas: outro ativador
Enzimas alostéricas
Mais de um sítio regulatório
Cada um específico para um regulador
Aspartato-transcarbamoilase
12 cadeias polipeptídicas
Azul: catalíticas
Vermelho/Amarelo: regulatórias
Enzimas alostéricas são reguladoras
... de vias bioquímicas
Normalmente são o primeiro passo da via
“economiza” a execução das outras reações
Único passo de regulação da via
Inibição por retroalimentação: São inibidas pelo produto do último passo
Inibição alostérica heterotrópica
Regulação por modificações covalentes 
500 tipos diferentes Modificações pós-traducionais covalentes já foram descritos
Proteínas inteiras podem ser adicionados como a ubiquitina e a sumo
Ubiquitinilação marca proteína para degradação
Sumoilação é encontrada em proteínas nucleares
Mudanças substanciais afetam de forma significativa a função da enzima
Fosforilação é a mudança mais comum
Podem haver vários sítios fosforiláveis
Conclusões
A atividade das vias metabólicas é regulada pelo controle da atividade de certas enzimas
O conhecimento do mecanismo de ação das enzimas permite desenvolver medicamentos que inibam essa ação
A inibição de uma enzima pode ser reversível, competitiva
Os principais mecanismos de catálise são: ácido-básica, covalente e por íons metálicos
As enzimas são catalisadores eficazes, aumentando a velocidade de ocorrência de uma reação