Metabolismo bacteriano e meios de cultura

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Metabolismo de microrganismo
Meios e métodos de cultivo
Prof. Dr. Lucas Gonçalves Ferreira
UNIFESP - 2015
Célula bacteriana
 As estruturas bacterianas revela que sua arquitetura
é formada por diferentes macromoléculas:
Célula bacteriana
 A composição química de uma célula bacteriana:
Nutrição bacteriana
 As estruturas da célula bacteriana são formadas por
diferentes macromoléculas:
Nutrição bacteriano
 Os precursores das macromoléculas podem ser retirados do
microambiente ou ser sintetizados a partir de compostos mais
simples pela bactéria
*A retirada dos precursores prontos do microambiente
sempre é mais vantajoso
Nutrição bacteriano
Nutrição bacteriano
 Os nutrientes podes ser divididos em 2 categorias:
- Macronutrientes (~90%): Carbono, Oxigênio Hidrogênio,
nitrogênio, enxofre
*Requeridos em grandes quantidades por serem os principais
constituintes dos compostos orgânicos celulares e/ou serem
utilizados como combustíveis
- Micronutrientes – minerais (~10%): Ferro, magnésio,
manganês, cálcio, zinco, potássio, sódio, cloro, cobre, cobalto,
selênio e outros
*Ambos essenciais para o metabolismo bacteriano
Nutrição bacteriano
 Macronutrientes:
 Oxigênio: Elemento importante de várias moléculas orgânicas e
inorgânicas
 Carbono: Presente na maioria das substancias que compõem a
célula. As bactérias utilizam o carbono inorgânico existente no
microambiente na forma de carbonato ou CO2
 Hidrogênio: É componente frequente de matéria orgânica e
inorgânica, e constitui um elemento comum de todo material
celular
Nutrição bacteriano
 Macronutrientes:
 Nitrogênio: Componente essencial dos aminoácidos – protéinas -
ácidos nucléicos e vitaminas
 Enxofre: Componente dos aminoácidos (cisteína e metionina),
vitaminas e proteínas importantes na reação de óxido-redução
 Fósforo: O fósforo é encontrado na célula incorporado a
moléculas importantes como os nucleotídeos e como fosfato
inorgânico – incorporado por reações metabólicas - a síntese do
ATP a partir de ADP e fosfato
Nutrição bacteriano
 Micronutrientes (minerais): Ferro, magnésio, manganês,
cálcio, zinco, potássio, sódio, cobre, selênio e outros são
encontrados sempre na forma inorgânica
Necessárias ao desenvolvimento da bactéria, mas em quantidades
variáveis, dependendo do elemento e do microrganismo
Alguns (magnésio, potássio, fosforo e ferro) são requeridos em
quantidades maiores quando comparado com os outros
*São adicionados aos meios de cultura
Nutrição bacteriano
 Os nutrientes podes ser divididos em 2 categorias:
- Macronutrientes (~90%): Carbono, Oxigênio
Hidrogênio, nitrogênio, enxofre
Papel importante na estrutura e metabolismo bacteriano
- Micronutrientes – minerais (~10%): Ferro, magnésio,
manganês, cálcio, zinco, potássio, sódio, cloro, cobre, cobalto,
selênio e outros
Papel importante nas funções enzimáticas
Fisiologia bacteriana
Crescimento bacteriano
 Exigências nutricionais
 Condições físicas: 
temperatura, 
Atmosfera
e pH
Crescimento bacteriano
Fisiologia bacteriana
Crescimento bacteriano
 Exigências nutricionais
 Condições físicas: 
temperatura, 
Atmosfera
e pH
Crescimento bacteriano
Exigências nutricionais
Fontes de energia
 doadores de H+ para gerar ATP (ex: glicose)
 receptores de H+ (Ex: oxigênio e sulfato)
Crescimento bacteriano
Fontes de carbono
 as bactérias retiram o carbono de fontes inorgânicas 
(CO2) e fontes orgânicas (aa, carboidratos)
 bactérias autotróficas: utilizam CO2 como única 
fonte de energia
 bactérias heterotróficas: utilizam CO2 e fontes 
orgânicas
Crescimento bacteriano
Fotossíntese ou fotossintéticas
 bactérias que utilizam luz para produzirem energia
Fontes de nitrogênio
 nitrogênio atmosférico
Fontes orgânicas (aa)
Fontes inorgânicas (amônia, nitratos, etc)
Crescimento bacteriano
Fatores de crescimento
 ácido fólico (multiplicação)
Aminoácidos
vitaminas
Água
 sais
 membrana plasmática 
absorve estes nutrientes
Crescimento bacteriano
Outros compostos
 Magnésio
Sódio
Potássio
Cálcio
zinco
Manganês 
Ferro
Enxofre
*Estes sais podem ser encontrados na água utilizada no 
preparo dos meios de cultura
Crescimento bacteriano
Crescimento bacteriano
Crescimento bacteriano
1. Fase Lag: período variável, onde ainda não há um 
aumento significativo da população 
* é um período onde o número de organismos permanece 
praticamente inalterado (Adaptação)
2. Fase Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão 
plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, 
sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando
3. Fase Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão 
escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se mais 
abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da 
população, ou seja, o número de células que se divide é 
equivalente ao número de células que morrem
Crescimento bacteriano
4. Fase de Declínio: A maioria das células está em 
processo de morte, embora outras ainda estejam se 
dividindo. A contagem total permanece relativamente 
constante, enquanto a de viáveis cai lentamente
Crescimento bacteriano
Fisiologia bacteriana
Crescimento bacteriano
 Exigências nutricionais
 Condições físicas: 
temperatura, 
Atmosfera
e pH
Crescimento bacteriano
Fisiologia bacteriana
Condições físicas
Temperatura
Psicrófilas: abaixo de 20°C – Temperatura ótima: 10°C
Mesófilas: em torno de 20 a 45°C – T. ótima: 37°C
Termófilas: acima de 45°C – T. ótima: 60°C
*37°C – interesse médico
Crescimento bacteriano
Crescimento bacteriano
*Termófilas extremas: acima de 100°C
Aeração
Aeróbios estritos: presença de oxigênio (Mycobacterium 
tuberculosis)
Facultativos: crescem na presença ou ausência de oxigênio 
(enterobactérias)
Anaeróbias estritas: ausência de oxigênio (Clostridium 
tetani)
Crescimento bacteriano
Durante as reações de redução de oxigênio são formados 
vários intermediários tóxicos (H2O2) 
(a) Aeróbios estritos
(b) Anaeróbias estritas
(c) Anaeróbios Facultativos
Crescimento bacteriano
pH
 pH neutro (varia de 6 a 7,0)
 Adicionamos ao meio de cultura solução tampão para 
estabilizar o pH
Crescimento bacteriano
Crescimento bacteriano
Crescimento bacteriano
Crescimento bacteriano
Metabolismo bacteriano
 Uma vez garantidos pelo ambiente os nutrientes e as 
condições adequadas
 As bactérias vão transformá-los em suprimento de 
energia e de matéria-prima
 Como matéria prima, os nutrientes vão ser 
transformados em estruturas celulares ou em 
moléculas acessórias à sua síntese e funcionamento
 A continua tomada de nutrientes permite que a 
bactéria atinja o seu objetivo máximo, a multiplicação
Metabolismo bacteriano
Metabolismo bacteriano
Processos químicos que ocorrem durante a biossíntese 
(anabolismo) e degradação (catabolismo) de substâncias
Transformando-os em energia 
Importância
Metabolismo bacteriano
Impacto dos microrganismos 
Identificação 
bacteriana
Síntese de produtos
farmacêuticos
Biorremediação
Aditivos
alimentícios
Ciclo de
nutrientes
Metabolismo bacteriano
Fundamentos do metabolismo
Metabolismo bacteriano
Metabolismo bacteriano
Metabolismo bacteriano
Processos químicos que ocorrem durante a biossíntese 
(anabolismo) e degradação (catabolismo) de substâncias
energia
Metabolismo bacteriano
Energia
 Obtida através da quebra de moléculas orgânicas
 Armazenada na 
forma de ATP
 Utilizada na síntese de moléculas e varias outras 
funções celulares
O ATPconsiste em uma adenina, uma ribose e três grupos 
fosfato, é a energia fundamental para o funcionamento da 
célula bacteriana 
Metabolismo bacteriano - Energia
Metabolismo bacteriano - Energia
Catabolismo: são as reações químicas reguladas por 
enzimas que liberam energia, são hidrolíticas, ou seja, 
utilizam água nas quais quebram ligações químicas e são 
exergônicas (produzem mais energia do que consomem)
Metabolismo bacteriano - Energia
Anabolismo: são as reações reguladas por enzimas que 
requerem energia, geralmente os processos anabólicos 
envolvem reações de síntese por desidratação, ou seja, 
liberam água, e são endergônicos (consomem mais 
energia do que produzem)
Metabolismo bacteriano - Energia
Metabolismo bacteriano - Energia
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia.
Metabolismo bacteriano
Sistema de
armazenamento
e transferência
de E
Componentes celulares
como proteínas (enzimas),
DNA, RNA, carboidratos,
lipídeos, etc.
Produtos da degradação
servem como unidades
para a produção de
compostos celulares
Síntese
Compostos e 
estruturas
Degradação
Quebra de
substratos ou
nutrientes
E liberadaE requerida
Crescimento celular,
reprodução, 
manutenção
e movimento
 Reações de óxido-redução - são reações químicas onde ocorrem 
transferências de elétrons entre duas ou mais substancias químicas
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia.
Molécula rica
em energia
Metabolismo bacteriano – Produção de energia
Vias metabólicas e produção de energia
• Metabolismo de carboidratos
– Glicólise  oxidação da glicose em ácido pirúvico
– Vias alternativas à glicólise
• Via Pentose Fosfato
• Via Entner-Doudoroff
– Respiração celular
• Respiração aeróbica
• Respiração anaeróbica
– Fermentação
• Ácido lática
• Alcoólica
Metabolismo bacteriano
Glicólise ou Via Embder-Meyerhof
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia.
1a Etapa
Metabolismo bacteriano
Glicólise ou Via Embder-Meyerhof
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia.
2a Etapa
Metabolismo bacteriano
Glicólise ou Via Embder-Meyerhof
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia.
1º Etapa: 
Consumo de 2 ATP
2º Etapa: 
Produção de 4 ATP e 2 NADH
Saldo
2 ATP e 2 NADH
Metabolismo bacteriano
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia.
Metabolismo bacteriano
Respiração celular
 Processo de geração de energia por meio de oxidação 
de moléculas, liberando gradativamente a energia 
neles contidas, a qual é utilizada na síntese do ATP
• Aeróbia (presença de O2)
– Aceptor final de elétrons é o oxigênio
• Anaeróbia (Ausência de O2) 
– Aceptor final de elétrons é uma molécula 
inorgânica
Metabolismo bacteriano
Fermentação
 Fermentação é um processo biológico em que moléculas 
ricas em energia são degradadas parcialmente, com 
liberação de menor quantidade de energia do que na 
respiração 
 É a forma de obter energia utilizada por certas 
bactérias em situações de necessidade 
O inicio dos vários tipos de fermentação são semelhantes: 
uma molécula de glicose é quebrada em duas moléculas de 
ácido pirúvico, liberando energia, a qual é utilizada para 
produzir ATP
Metabolismo bacteriano
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia.
Metabolismo bacteriano
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia.
Metabolismo bacteriano
Metabolismo bacteriano
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia.
Metabolismo bacteriano
– Energia é 
liberada 
passo a 
passo em 
uma série 
de reações 
bioquímicas
• Biossíntese de açúcares e polissacarídeos
• Biossíntese de aminoácidos e 
nucleotídeos
• Biossíntese de ácidos graxos e lipídeos
Energia para síntese de compostos celulares: ácidos nucléicos
(DNA, RNA), substâncias nitrogenadas (aa, enzimas, proteínas),
carboidratos (peptidoglicano), lipídeos....
ATP para processos como divisão celular, mobilidade, transporte
ativo de nutrientes, entre outras funções
Metabolismo bacteriano - Anabolismo
Biossíntese de polissacarídeos
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia.
Metabolismo bacteriano
Biossíntese de lipídios
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia.
Metabolismo bacteriano
Biossíntese de aminoácidos e proteínas
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia
Metabolismo bacteriano
Biossíntese de aminoácidos e proteínas
MADIGAN, M.T. et al. Microbiologia de Brock
Metabolismo bacteriano
Biossíntese de purinas e pirimidinas
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia
Metabolismo bacteriano
TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia
Metabolismo bacteriano
Metabolismo bacteriano
Meios de Cultura
 Isolamento bacteriano:
Apresentam substâncias essenciais para o
crescimento bacteriano, a partir da semeadura do
material clínico
 Identificação bacteriana:
Esses meios são utilizados quando a bactéria já
está isolada
Tais meios permitem a determinação das
características metabólicas (produção de pigmentos,
enzimas e antígenos específicos, etc.)
Meios de Cultura
Composição básica dos meios de cultura:
 hidrolisados de proteínas – fonte C e N
- extrato de levedura/ extrato de carne 
 carboidratos – dissacarídeos, hexoses e pentoses
 tampões – (PO4) estabilidade de pH
 inibidores – corantes e metais pesados 
 indicadores de pH - vermelho de fenol
 outros indicadores – citrato férrico: H2S 
 ágar – consistência 
Meios de Cultura
Composição básica dos meios de cultura:
* Culturas em laboratório – produzem ácidos que
interferem com seu próprio crescimento
* Sais de fosfato são utilizados para a manutenção do
pH do meio – não são tóxicos e fornecem nutriente
essencial para o crescimento
Meios de Cultura
Meios de Cultura
Tipos:
1. Sólidos
2. Semi-sólidos
3. Líquidos - são designados de caldos (broth) 
*são isentos de ágar
Meios de Cultura
 O crescimento de bactérias num meio líquido é
observado pela turvação do meio, formação de uma
película na sua superfície, ou aparecimento de
sedimento
 Nos meios sólidos o crescimento bacteriano é
evidenciado pelo aparecimento de colônias
 Os meios sólidos podem ainda ser vertidos em tubos
de ensaio de vidro, os quais são inclinados, de modo a
que, durante a solidificação do meio
Meios de Cultura
- Líquidos e Sólidos -
= turbidez
Meios de Cultura - Líquidos
Meios líquidos (caldo)
Meios semi-sólidos
 motilidade bacteriana
Feito em baixa 
concentração de ágar de 
0,05 a 0,3%
A B
A: límpido – bactéria imóvel
B: turvo – bactéria do tipo móvel
Meios de Cultura – Semi-sólidos
A.monotríquias (único flagelo em uma das extremidades);
B. lofotríquias (tufo de flagelos em uma ou ambas as
extremidades);
C. anfitríquias (único flagelo em cada extremidade);
D. peritríquias (cercadas de flagelos).
Meios de Cultura – Semi-sólidos
Meios sólidos = colônia 
Meios de Cultura - Sólidos
Meios sólidos
• Meios enriquecidos: meios para o crescimento da
maioria das bactérias, os quais contem substancias
enriquecedoras (soro, sangue de carneiro ou sangue
humano)
Exemplos: AS, AC
• Meios seletivos: meios para seleção de determinados
grupos bacterianos, os quais contem substancias que
inibem o crescimento de outras bactérias distintas
daquelas que nos interessam
Exemplos: TCBS, MC
• Meios diferenciais: permitem a identificação de
microrganismos, são meios sólidos com composição
química adequada para evidenciar uma característica
bioquímica
Meios de Cultura
• Meios de enriquecimento: são variaçõesdo meios
seletivos e permitem o crescimento de determinados
microrganismos que estão em menor concentração na
amostra em relação aos da microbiota
Exemplos: Caldo Selenito e Tetrationato
• Meios para anaeróbios: meios pré-reduzidos na
coleta e manutenção de bactérias anaeróbias, são
adicionadas substancias redutoras (ácido ascórbico
0,1%, cisteina 0,1% e tioglicolato de sódio 0,1%) que
se combinam com o oxigênio
• Meios purificados: Mueller Hinton 
Meios de Cultura
• Meios enriquecidos: meios para o crescimento da
maioria das bactérias, os quais contem substancias
enriquecedoras (soro, sangue de carneiro ou sangue
humano)
Exemplos: AS, AC
• Meios seletivos: meios para seleção de determinados
grupos bacterianos, os quais contem substancias que
inibem o crescimento de outras bactérias distintas
daquelas que nos interessam
Exemplos: TCBS, MC
• Meios diferenciais: permitem a identificação de
microrganismos, são meios sólidos com composição
química adequada para evidenciar uma característica
bioquímica
Meios de Cultura
Ágar sangue
Usado para identificar Staphylococcus/Streptococcus sp
 5% de sangue
Meios desidratados podem ser 
utilizados como base para o ágar sangue 
 Tríptico de soja (TSA), infusão de cérebro e coração (BHI) e 
o ágar Columbia
Meios de Cultura
Ágar chocolate
 hemácias hemolisadas
Fatores de crescimento (suplemento VX, 
vitaminas, aa)
Mais enriquecido que o ágar sangue
aquecer o ágar sangue até que este apresente coloração 
achocolatada, obtida pelo aquecimento a 80C em banho-maria por 2 
minutos
Usado para identificar Neisseria gonorrhoeae e Haemophilus influnzae
Meios de Cultura
• Meios enriquecidos: meios para o crescimento da
maioria das bactérias, os quais contem substancias
enriquecedoras (soro, sangue de carneiro ou sangue
humano)
Exemplos: AS, AC
• Meios seletivos: meios para seleção de determinados
grupos bacterianos, os quais contem substancias que
inibem o crescimento de outras bactérias distintas
daquelas que nos interessam
Exemplos: TCBS, MC
• Meios diferenciais: permitem a identificação de
microrganismos, são meios sólidos com composição
química adequada para evidenciar uma característica
bioquímica
Meios de Cultura
Ágar Mac Conkey
peptona, lactose, NaCl, sais biliares e 
vermelho de metilo como indicador de 
pH)
cristal de violeta e sais biliares 
(impede crescimento de G+)
Isolamento de bacilos G-
Não indicado para isolar 
Streptococcus sp e Staphylococcus sp
(G+) 
Usado para identificar enterobactérias – E. coli
Ágar Manitol
Alta concentração de NaCl (7,5%)
Usado para identificar Staphylococcus sp
• Meios enriquecidos: meios para o crescimento da
maioria das bactérias, os quais contem substancias
enriquecedoras (soro, sangue de carneiro ou sangue
humano)
Exemplos: AS, AC
• Meios seletivos: meios para seleção de determinados
grupos bacterianos, os quais contem substancias que
inibem o crescimento de outras bactérias distintas
daquelas que nos interessam
Exemplos: TCBS, MC
• Meios diferenciais: permitem a identificação de
microrganismos, são meios sólidos com composição
química adequada para evidenciar uma característica
bioquímica Exemplos: AS, MC
Meios de Cultura
Ágar Manitol
Alta concentração de NaCl (7,5%)
Possui o carboidrato manitol, que 
possui indicador de pH (fenol 
vermelho)
 Fenol vermelho
•Se estiver em meio ácido – amarelo
•Se estiver em meio neutro – róseo-claro (sem 
bactéria)
•Se estiver em meio alcalino - pink
pH ácido: utiliza o manitol (manitol +)
pH alcalino: não utiliza o manitol (manitol -)
Staphylococcus aureus – manitol +
Staphylococcus epidermidis –
manitol -
Ágar Mac Conkey
Indicador de pH vermelho neutro
Carboidrato lactose
 Vermelho neutro
•pH ácido– róseo
•pH neutro – incolor
•pH alcalino - incolor
pH ácido: fermentou lactose (Lac +)
pH alcalino/neutro: não fermentou (Lac -)
Ágar Mac Conkey
Ágar sangue
Diferenciam bactérias com a 
capacidade de lisar as hemácias, 
causando hemólise
 α hemólise: hemólise parcial - S. pneumoneae
β hemólise: hemólise total - S. pyogenes
γ hemólise: não hemolítico - Enterococcus faecalis
TCBS (Tiosulfato citrato bile e sacarose)
Ágar Verde Brilhante
Meio seletivo para Salmonella sp
Vermelho de fenol ( lac+ amarela e lac- rosa)
Agar Salmonella-Shigella (SS)
Meio de carvão ativado (Karmali)
Isolamento de Campylobacter spp
COMO ESCOLHER O MEIO DE 
CULTURA?
Fatores a serem considerados:
1. A origem do material a ser analisado
2. O agente etiológico que imagina estar presente na 
amostra
3. As necessidades nutricionais deste possível agente
Vias Respiratórias
Microbiota Normal Potenciais Patogenos Meios culturas
Streptococcus mutans
Streptococcus salivarus
Streptococcus pygones
Streptococcus pygones 
Streptococcus pneumoniae
AS
Staphylococcus aureus*
Staphylococcus epidermidis
AS
Haemophylus sp
Neisseria sp
Neisseria meningitidis
Haemophilys influenzae tipo B
ACHOC com 
suplementado com 
os fatores V e X
Difteroides 
Enterobacterias
Anaeróbios
Corynebacterium diphtheriae
Klebsiella pneumoniae
Enterobacterias
Pseudomonas aeruginosa
MC
Mycobacterium sp Lowenstein-Jensen 
L-J
Microbiota Normal Potenciais Patogenos Meios culturas
Enterococcus sp Streptococcus agalactiae 
Enterococcus sp
AS
Staphylococcus sp coagulase 
negativa
Neisseria gonorrhoeae Tayer Martin
(TM) ou ACHOC 
Difteroides 
Enterobacterias MC
Anaeróbios Anaeróbios Meios para anaerobios
MICRORGANISMOS EM ALTA 
CONCENTRAÇAO E CULTIVO PURO
AS e MC
Trato Genital
Microbiota Normal Potenciais Patogenos Meios culturas
Staphylococcus sp coagulase 
negativa
Streptococcus agalactiae 
Enterococcus sp
AS
Difteroides S.aureus AS
E.coli
Proteus sp
MC
Pseudomonas aeruginosa MC
Pele e mucosa
Trato Gastrointestinal
Microbiota Normal Potenciais Patogenos Meios culturas
Enterococcus sp
MC
SS
VB
Caldo selenito ou 
Tetrationato
TCBS
Carvão ativado
Skirrow ativado
Staphylococcus sp coagulase 
negativa
Enterobacterias
Não fermentador
Salmonella sp
Shigella sp
E.coli diarreiogenicas 
Campylobacter sp
Vibrio sp
Yersinia sp
Anaeróbios Clostridium difficile Meios para anaerobios
Sítio estéreis
Potenciais Patogenos Meios culturas
LCR
Neisseria meningitidis
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae
Listeria monocytogenes
ACHOC +V+X
AS
E.coli MC
TRATO URINARIO 
Enterobacterias
MC
Enterococcus 
Staphyococcus aureus 
Staphylococcus saprophyticus
AS
Não Fermentador MC
Amostra Tempo critico Frasco e meio de 
transporte
Hemocultura 30 minutos 
(não refrigerar)
Frasco com meio de 
cultura 
T .Respiratório 30 minutos Tubo seco estéril
Urina 1 hora ou refrigerada até 
24 h
Pote seco estéril
Fezes 30 minutos ou 12h em 
meio de cultura 
Cary Blair
Amostras clínicas
Amostra Tempo critico Frasco e meio de 
transporte
LCR Imediatamente 
( não refrigerar)
Tubo seco estéril
Líquido pleural Imediatamente 
( não refrigerar)
Tubo seco estéril
Swab Imediatamente 
( não refrigerar)
Tubo seco estéril ou meio 
semi solido (Stuart ou 
Amies) 
Suspeita de 
anaeróbios
30 minutos Meio de transporte 
apropriado
Feridas e 
tecidos
30 min ou 12 horas (meio 
de transporte)
Meio de transporte 
apropriado
Meios de cultura para transporte e 
conservação
Cary Blair
 coliformes fecais
A carência de uma fonte de nitrogênio impede 
consideravelmente a multiplicaçãoda bactéria
Composição nutritiva garante sua sobrevivência
- Conservação e validade: 4 a 10°C de 6 a 8 
semanas
Meio Stuart
A carência de uma fonte de nitrogênio impede 
consideravelmente a multiplicação da bactéria
Haemophilus spp, Pneumococcus, Salmonella spp, 
Shigella spp, entre outros
Conservação e validade: 4 a 8°C de 1 a 2 semanas
Ágar 
nutriente
Conservação e manutenção de culturas em 
temperatura ambiente
Método opcional para laboratórios que não 
dispõem do método de crioconservação 
Usado para bacilos Gram positivos
Outros meios de cultura
Mueller Hilton CLED
* Diferenciar microrganismos causadores 
de infecção urinária
AS – potencialização da hemólise
S.aureus β lisina
Streptococcus agalacteae
Quando encontrar com β
lisina potencializa a 
hemólise
Ágar SS
Salmonella sempre produz H2S (sulfeto
de hidrogênio) – coloração preta
Meios bioquímicos
 TSI (tríplice açúcar ferro)
Fermentação de açúcares
Produção de H2S
Produção de gás
 Indol
Citrato de Simmons lisina
Conservação de culturas puras
Após a obtenção de uma cultura pura deverá ser adotado 
um método de conservação destas culturas vivas
Conservação por um curto período (dias a meses)
Armazenar de 4°C a 10°C
Repiques frequentes
Nitrogênio líquido (-196°C)
Freezers a -70°C/-120°C
Liofilização – congelamento a seco – as amostras são 
congeladas, desidratadas e fechadas à vácuo, o que 
possibilita a viabilidade das culturas por muitos anos
Conservação por longos períodos (meses a anos)
Inoculação
Inóculo
Semeado em meio 
de cultura
microrganismo se multiplica 
e da origem a uma colônia 
Quais Os Métodos De Cultivo?
Inoculação:
 Esgotamento por estrias – através de uma alça ou
agulha realiza o esgotamento do material clinico no
meio de cultura adequado
 Semeadura da superfície – o inóculo é espalhado na
superfície do ágar com uma alça de Drigalsky
“formado de um L”.
 “Pour Plate” (semeadura em profundidade) – o inóculo
juntamente com meio de cultura fundido (45C) é
vertido na placa de petri
 Diluição- diluição seriada do inóculo, e semeado por
esgotamento ou semeadura na superfície
Quais Os Métodos De Cultivo?
Técnica de esgotamento por estrias
Técnica de esgotamento do inóculo
Condições De Cultivo
.
Após a inoculação, o meio de cultura deve ser
incubado num ambiente adequado aos requisitos de
crescimento dos microrganismos:
• Temperatura de crescimento
• Aeração
• pH
• Tempo de incubação
Isolamento de aeróbios
Semear a bactéria (placa ou tubo)
- Presença de oxigênio
Isolamento de anaeróbios
Isolamento de capnéicos
Altas concentrações de CO2
Identificação Microbiana
 Identificação é obtida pela detecção do
microrganismo ou seus produtos
-identificação pelo isolamento e cultura bacteriana
-identificação de um produto microbiano específico
(detecção de toxinas, identificação de um gene
especifico e sorologia (detecção de anticorpos))
Identificação Microbiana
1. Características de cultivo
2. Características morfológicas 
3. Características metabolismo
4. Características antigênicas
5. Características genéticas
Identificação Microbiana
1. Características de cultivo
2. Características morfológicas 
3. Características metabolismo
4. Características antigênicas
5. Características genéticas
Identificação Microbiana
1. Características de cultivo
Observar a características da colônia no meio em 
crescimento (forma, dimensão, brilho, pigmento, etc)
Identificação Microbiana
1. Características de cultivo
2. Características morfológicas
3. Características metabolismo
4. Características antigênicas
5. Características genéticas
Identificação Microbiana
Bacterioscopia
Coloração de GramColoração de Gram
Gram Negativas
- Bacilos
Gram Positivas
- Cocos 
Coloração de Gram
Gram Negativo
- Diplococos
- Polimorfonucleares 
Coloração de Gram
1. Características de cultivo
2. Características morfológicas 
3. Características metabolismo
4. Características antigênicas
5. Características genéticas
Identificação Microbiana
Avaliar o metabolismo bioquímico 
para identificar a espécie
Microrganismos Provas bioquímicas 
Staphylococcus Catalase, oxidase, coagulase, Dnase, novobiocina
Streptococcus Catalase, hipurato de sodio, bile esculina , NaCl 6,5%, 
optoquina, CAMP-Teste e bacitracina
Haemophilus Catalase, oxidase, redução de nitrato, indol, necessidade 
de X e V, crescimento em ágar sangue, utilização de 
sacarose
Neisseria Catalase, oxidase, redução de nitrato, utilização de 
maltose, sacarose, lactose e glicose
Enterobacterias Catalase, oxidase e outros
Não fermentadores Catalase, oxidase, e outros
Identificação bacteriana 
• Pesquisa de enzimas
• Oxidase (enterobactérias)
• Urease
• Descarboxilase
• Desaminase
• Triptofanase
• Produção de H2S
• Produção de gás
• Motilidade
• Fermentação de açúcar
Prova da oxidase
• Possuem a enzima citocromo oxidase
Triple sugar iron agar - TSI
• Determinar capacidade do microrganismo em utilizar
carboidratos específicos presentes no meio, com ou sem
produção de gás, juntamente com a determinação de uma possível
produção de hidróxido de enxofre.
– Glicose (0,1%)
– Lactose (1%)
– Sacarose (1%)
– Peptona
– Vermelho de fenol
– Citrato férrico de amônio e tiossulfato de sódio
Precipitado preto
4H++4e+3S2O3
Tiosulfato redutase
Bactéria
2SO3 + 2 H2S
+
Fe
Meio
Não fermentador
Não fermentador de
lactose e sacarose
Não fermentador de lactose
Triple sugar iron agar - TSI
Glicose 
(0,1%)
Lactose 
(1%)
Sacarose 
(1%)
Peptona 
Vermelho 
de fenol
pH 
7,4
O2
glicose
ácidos
O2
Glicose
Sacarose
ácidos
O2
sacarose
Lactose
Fermentador dos três açúcares
Glicose
Lactose
Sacarose
ácidos
O2
Urease
• Determinar capacidade do microrganismo em cindir a uréia,
formando duas moléculas de amônia, pela ação da enzima urease,
alcalinizando o meio.
– Uréia (20%)
– Vermelho de fenol
NH2
NH2
C = O +2 H2O CO2 + H2O + NH3 (NH4)2C03
urease
pH alcalino
Indicador VF
Meio Rosa
Bactéria
Fenilalanina desaminase
• Determinar capacidade do microrganismo em desaminar a
fenilalanina, formando ác. fenilpirúvico (pela ação da enzima
fenilalanina desaminase), que é detectado pela adição de uma
solução de cloreto férrico.
– Fenilalanina
– Solução de cloreto férrico 10%
CH2-CH-COOH
NH2
+ ½ O2 - 2H
CH2-CH-
COOH
O
+ NH3
+
FeCl3 Meio verde
Citrato
• Determinar capacidade do microrganismo em utilizar citrato
como única fonte de carbono. As bactéria que utilizam citrato
retiram N2 de sais de amônia, alcalinizando o meio pela
transformação de amônia em NH4OH.
– Citrato de sódio
– Azul de bromotimol
– Fosfato monoamoniacal
Citrato
Citritase Oxalacetato + acetato
Piruvato + CO2
(fonte de C) + fonte de N = crescimento
NH4 (pH alcalino)
azul
bromotimol
Meio
azul
Descarboxilação de aminoácidos
• Medir a habilidade enzimática de um microrganismo em
descarboxilar um aminoácido, dando origem a uma amina, o que
resulta na alcalinização do meio.
– Aminoácido (lisina, ornitina e arginina)
– Peptona
– Púrpura de bromocresol
– Cresol vermelho
– Glicose
– Óleo mineral
R –CH – NH2 –COOH R –CH – NH2 + CO2
enzima
pH alcalino + indicador = Roxo
Indol
• Determinar capacidade do microrganismo em hidrolisar o
triptofano, produzindo indol, ácido pirúvico e amônia, pela ação
da enzima triptofanase. A presença do indol é verificada pelaformação de um complexo vermelho após adição de uma solução
de p-dimetilaminobenzaldeído.
– Triptofano
– Reativo de Kovacs (p-dimetilaminobenzaldeído)
Triptofanase 
Piruvato + NH3
+ + Indol
p-dimetilaminobenzaldeido
Complexo Vermelho
Triptofano
Motilidade
• Determinar se o microrganismo é móvel ou não.
– Meio semi-sólido
– Cloreto de trifeniltetrazólio (opcional)
• Formação de um pigmento vermelho insolúvel onde há crescimento 
bacteriano.
Meio semi-sólido (0,4 %) + TTC 
Crescimento
bacteriano
TTC reduzido Complexo 
vermelho
Verificar:
 H2S
 Gás de glicose
 Uréia
 Fenilalanina desaminase
 Fermentação de glicose
Verificar:
 Motilidade
 Indol
 Lisina
EPM 
Mili
Identificação de bacilos Gram negativos
Fermentação da Glicose
+ -
Oxidase
Enterobactérias
Oxidase
- +
Aeromonas
Vibrio
Campylobacter
Plesiomonas
- +
Acinetobacter Pseudomonas 
Identificação de bacilos Gram 
negativos
 Identificação de Enterobactérias
Identificação de bacilos Gram negativos
Identificação de bacilos Gram negativos
Identificação de Cocos-gram-positivos
 Identificação de cocos Gram positivos
Catalase
Staphylococcus
+
Streptococcus
Enterococcus 
-
Catalase +
Dnase ou Coagulase
+ -
S. aureus Novobiocina 
S. saprophyticus S. coagulase neg
R S
Identificação de Cocos-gram-positivos
Catalase +
Dnase ou Coagulase
+ -
S. aureus Novobiocina 
S. saprophyticus S. coagulase neg
R S
Identificação de Cocos-gram-positivos
NaCl 6,5%
- +
 Identificação de coco Gram positivos
Catalase
Staphylococcus
+
Streptococcus
Enterococcus
-
Identificação de Cocos-gram-positivos
 Identificação de coco Gram positivos
Catalase
Staphylococcus
+
Streptococcus
Enterococcus 
-
Identificação de Cocos-gram-positivos
Cepas com beta-hemólise
Realizar a prova do bacitracina e 
CAMP-Test 
Identificação de Cocos-gram-positivos
Teste de sensibilidade à bacitracina
Realizado apenas para os microrganismos que possuem
beta-hemólise.
Identificação de Cocos-gram-positivos
Camp-test
Este teste é baseado na detecção de uma substância
(fator CAMP), a qual potencializa a ação lítica da beta-
hemolisina de S. aureus sobre hemácias de carneiro, tendo
como efeito a formação de uma área de hemólise sinérgica,
típica, em forma de seta ou meia-lua, quando esses
microrganismos são semeados sob a forma de estrias
perpendiculares.
S. aureus Streptococcus beta-hemolítico
Identificação de Cocos-gram-positivos
positivo
negativo
Identificação de Cocos-gram-positivos
Cepas com alfa-hemólise
Realizar a prova da optoquina 
Identificação de Cocos-gram-positivos
Teste de sensibilidade à optoquina
Realizado apenas para os microrganismos que possuem
alfa-hemólise.
Identificação de Cocos-gram-positivos
Resumo
Identificação de Cocos-gram-positivos
1. Características de cultivo
2. Características morfológicas 
3. Características metabolismo
4. Características antigênicas
5. Características genéticas
Identificação Microbiana
Aglutinação em lâmina 
A confirmação sorológica envolve a
reação na qual o microrganismo
(antígeno) reage com o anticorpo
correspondente (específico)
Esta reação in vitro produz aglomerados
macroscópicos (aglutinação)
Aglutinação em látex
• Aglutinação em látex para a detecção qualitativa direta de antígenos de H.
influenzae tipo b, S. pneumoniae, Streptococcus sp, N. meningitidis dos Grupos
A, B, C, Y ou W135 e Escherichia coli K1
•A aglutinação evidente ocorre quando a 
amostra contém qualquer desses 
antígenos bacterianos, os quais reagem 
com os respectivos anticorpos 
(específicos) aderidos ao látex
1. Características de cultivo
2. Características morfológicas 
3. Características metabolismo
4. Características antigênicas
5. Características genéticas
Identificação Microbiana
Características genéticas – biologia molecular
• PCR
• Hibridização – sondas 
Identificação Microbiana
Reação da Polimerase em Cadeia 
(Polymerase Chain Reaction) - PCR
A Reação ocorre em três etapas:
1) Denaturação - em que as fitas complementares de DNA
separam-se, dando acesso aos primers e à DNA polimerase
2) Renaturação (anelamento) - em que os primers anelam-se 
seletivamente com o DNA template
3) Síntese (extensão) - em que os primers são extendidos pela 
DNA polimerase utilizando os dNTPs como substrato
Esta reação é cíclica e cada etapa ocorre a uma temperatura
Reação da Polimerase em Cadeia - PCR
Reação da Polimerase em Cadeia - PCR
94oC 94oC
55oC
72oC 72oC
5 min
5 min
1 min
1 min
1 min
30x
denaturação
anelamento
extensão
Variações da reação:
- PCR-RFLP (restriction fragment lenght polymorphism)
- Nested-PCR
- RT-PCR (reverse transcriptase)
-Multiplex PCR
- Real Time PCR
Referências Bibliográficas