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BACTÉRIAS UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCOUNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO Departamento de Biologia Departamento de Biologia –– Área de MicrobiologiaÁrea de Microbiologia Curso: AgronomiaCurso: Agronomia MICROBIOLOGIA GERAL AMICROBIOLOGIA GERAL A Profª. Elineide Barbosa de Souza BACTÉRIAS Bactérias – micro-organismos procariotas, microscópicos, unicelulares e que se reproduzem principalmente por fissão binária transversa. IMPORTÂNCIA Decomposição de matéria orgânica e fixação de nitrogênio Doenças em homens, animais e plantas Controle biológico de doenças e pragas Decomposição de matéria orgânica e fixação de nitrogênio Biorremediação Processos de fermentação Desenvolvimento de organismos transgênicos Fabricação de antibióticos e substâncias (ex. acetona, ácido glutâmico) Doenças bacterianas em plantas Murcha bacteriana em tomateiro Ralstonia solanacearum e R. pseudosolanacearum Murcha bacteriana da batata Ralstonia solanacearum Podridão negra das brássicas Xanthomonas campestris pv. campestris Galhas em coroa - roseira e framboeseira Rhizobium radiobacter (Agrobacterium tumefaciens) Podridão mole - alface Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Cancro cítrico Xanthomonas axonopodis pv. citri Cancro bacteriano da videira Xanthomonas campestris pv.viticola Sarna comum e sarna ácida da batata Sptreptomyces scabiei e S. acidiscabies Mancha aquosa do meloeiro e melancieira Acidovorax citrulli (Acidovorax avenae subsp. citrulli) Decomposição de matéria orgânica e fixação de nitrogênio Raiz de planta leguminosa apresentando nódulos de Rhizobium sp. Planta de amendoim sem e com Rhizobium sp. Processos de fermentação Fabricação de antibióticos e substâncias (ex. acetona, ácido glutâmico) Bactérias do gênero Corynebacterium são utilizadas na produção de ácido glutâmico, substância utilizada para acentuar o sabor dos alimentos Desenvolvimento de organismos transgênicos Biorremediação de pesticidas: herbicidas, inseticidas e fungicidas. Xenobióticos : compostos químicos que não estão presentes naturalmente no ambiente Biorremediação de petróleo e hidrocarbonetos Determinadas espécies especializadas na degradação do óleo, como Alcanivorax borkumensis Controle biológico de doenças e pragas Pasteuria x nematoides Bacillus thuringiensis x lagarta Controle biológico Controle biológico do nematoide das galhas (Meloidogyne javanica e M. incognita) em fumo pela pulverização da suspensão de esporos da bactéria Pasteuria penetrans. Plantas não tratadas (A) e tratadas (A) MORFOLOGIA DA CÉLULA BACTERIANA Forma, tamanho e arranjo 1. FORMA: cocos (esferas), bacilos (bastões), vibriões, espiroquetas e filamentosas (Fitopatogênicas- predomina a forma de bastonetes) - Bactérias sem parede celular não têm forma definida - As bactérias pleiomórficas podem assumir várias formas (Ex. Rhizobium) 2. TAMANHO: Bastonetes fitopatogênicos - 1 a 3 m comprimento x 0,3 a 0,8 m de diâmetro Formas especiais – Bactérias do domínio Archaea Cocos Diplococos Estreptococos Tétrades Sarcinas Estafilococos A R R A 3. ARRANJOS: Estafilococos N J O S Streptococcus sp. A R R A Cocos Diplococos Estreptococos Tétrades Sarcinas Estafilococos N J O S Staphylococcus sp. Estafilococos Bacilos Bacilo único Diplobacilos Estreptobacilos A R R AA N J O S Streptomyces sp. ESTRUTURAS DA CÉLULA BACTERIANA Funções: conter o limite osmótico interno da célula forma da célula bacteriana “ Diferenciar as bactérias em Gram positivas e Gram negativas” 1. PAREDE CELULAR Açúcares aminados (N-acetil glucosamina - NAG e N-acetil murâmico - NAM ) Composição: peptideoglicano (Heteropolímero composto de açúcares aminados e aminoácidos). Tripeptideoglicano Aminoácidos • NAM (m-acetil murâmico) e DAP (ácido diaminopimelico) – ñ estão presentes em Archea e Eucarya •DAP em todas as Gram- e algumas Gram+; cocos positivos apresentam o aminoácido lisina em vez de DAP •Forma D dos aminoácidos •Açúcares aminados com ligações - 1,4 • Peptideoglicano pode ser destruído pela Lisozina (N- acetil muramidase) Estrutura do peptideoglicano 1.1. PAREDE CELULAR –Gram positivas •Estrutura –90% peptideoglicano (1 a várias camadas) –10% ác. teicoicos e lipoteicoicos (ribitol, glicerol) Funções ácidos teicoicos: - carga negativa da superfície celular, - Ligação de Ca2+ e Mg2+ no transporte de nutrientes - regular alargamento da parede celular durante a divisão celular (regulação da autolisina) PAREDE CELULAR – Bactérias Gram positivas 1.2. PAREDE CELULAR – Gram negativas •Estrutura – Camada rígida: peptideoglicano (5-10% da espessura da célula) Função: prevenir choques osmóticos – Camada externa: fosfolipídios, porinas, lipoproteínas, lipopolissacarídios – LPS (95-90% da espessura da célula) Funções: difusão passiva de nutrientes; Funções: difusão passiva de nutrientes; barreira para antibióticos, detergentes e toxinas; sítios receptores para fagos e bacteriocinas; formação e manutenção de pares na conjugação; capacidade hidrofílica a superfície celular; toxicidade •Lipopolissacarídios (LPS) –Estrutura: lipídio A, polissacarídeo (cerne), antígeno O –Função: reconhecimento do hospedeiro, toxicidade (endotoxinas- siringomicina) PAREDE CELULAR – Bactérias Gram negativas – Espaço periplasmático nas bactérias Gram negativas (matriz periplásmica - polipeptídeos e sacarídeos, contendo enzimas - como celulases e pectinases) Funções: digestão extracelular, transporte de moléculas, movimento flagelar Bactéria Gram positiva - cor violeta Técnica de Coloração de Gram Bactéria Gram negativa – cor avermelhada, rósea 1.3. BACTÉRIAS SEM PAREDE CELULAR Protoplastos de vida livre •Micoplasmas, fitoplasmas, espiroplasmas (apresentam esteróis na membrana citoplasmática) •Termoplasma (Archaea) •Bactérias limitadas ao xilema e floema: têm parede celular ondulada 1.4. PAREDE CELULAR DE ARCHAEA Podem não ter parede celular ou ter paredes incomuns, mas sem peptideoglicanoPodem não ter parede celular ou ter paredes incomuns, mas sem peptideoglicano -Algumas possuem uma substância similar denominada pseudomureína (N- acetil talosaminurônico ao invés de NAM e não possui os D-aminoácidos, açúcares aminados com ligações -1,3 ) - Parede contendo polissacarídicas constituídas de glicose, ácido glicurônico, ácido urônico galactosamina e acetato -Camadas S (estrutura paracristalina constituída de proteínas e glicoproteínas) A ausência de peptideoglicano - confere resistência a lisozima e antibiótico penicilina 2. ESTRUTURAS EXTERNAS À PAREDE CELULAR Composição: -corpo basal (anéis) - gancho ou alça filamento helicoidal Função: motilidade rotatória (algumas bactérias não possuem flagelo) Fonte de energia – força próton motiva 2.1 FLAGELO -filamento helicoidal (proteína globular flagelina) - Antígeno flagelar (Ag H): diferentes sorotipos Ex: Escherichia coli + de 50 Ags H diferentes Características: - Mais longos que a célula (15 a 20 m de comprimento) e com diâmetro somente de uma porção do diâmetro da célula - Melhor visualizado através da microscopia eletrônica A maioria dos bacilos possui flagelos; cocos raramente Bactéria Gram Negativa: 4 anéis, sendo 2 na membrana citoplasmática e 2 na parede celular ( 1 na camada de peptideoglicano e 1 na camada externa) Bactéria Gram Positiva: 2 anéis na membrana citoplasmática (Tortora et al., 2012) Classificação das bactérias quanto a presença de flagelos Monotríquia Anfitríquia Atríquia – sem flagelo Monotríquia Lofotríquia Peritríquia Flagelos circuntecais (arranjo sub-polar em torno da circunferência cilíndrica da célula) Rhizobium radiobacter (A. tumefaciens) Movimento: TAXIA (quimiotaxia e fototaxia) Receptores dentro ou logo abaixo da parede celular Espiroquetas - filamento axial ou flagelo periplasmático•Propulsão em espiral - invasão de tecidos Ex: Treponema pallidum Motilidade por deslizamento - Presente em algumas bactérias - Lento e suave, geralmente ocorrendo ao longo do eixo da célula - Requer o contato das células com uma superfície sólida - Mais lento do que o movimento flagelar 2.2 PILI (singular=pilus) Composição: Proteína Pilina Função: Fixação (Gram negativas) Característica: Apêndices retos, curtos e finos •Pólos ou toda superfície e são várias por célula. •Adesão a superfícies e a outras células. Pili comuns (=Fímbrias) Pili Sexuais •Mais longos que os pili comuns (fímbrias) e um ou dois por célula. •Fixação das células doadoras e receptoras na conjugação bacteriana. •Receptoras de vírus. Várias classes de Pili -Fator essencial de colonização -Motilidade pulsante – deslizamento na superfície sólida Composição: polissacarídeos e/ou polipeptídeos 2.3 GLICOCÁLICE Pseudomonas aeruginosa galactose, glicose e ramnose Bacillus anthracis polímero de ácido glutâmico Camada mucilaginosa - pouco organizada, fracamente aderida à parede celular Cápsula - mais organizada e mais aderida à parede celular Classificação EPS – camada extracelular polissacarídica Funções: Fator de virulência Resistência: antibióticos, ressecamento, produtos químicos. Adesão da célula a superfícies sólidas Absorção seletiva de íons (nutrientes). Fonte de nutrientes Toxidez a plantas e animais Antígeno somáticoAntígeno somático Sítio receptor para fagos 3.1. MEMBRANA CITOPLASMÁTICA (PLASMÁTICA) Estrutura vital a célula bacteriana. Espessura de 6-8nm Composição: fosfolipídeos (20 a 30%) e proteínas (50 a 70 %) Bicamada fosfolipídica – componentes hidrofóbicos (ácidos graxos) e hidrofílicos (glicerol-fosfato), com ligações do tipo éster Estabilizada por pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas, Mg2+ e Ca2+ 3. ESTRUTURAS INTERNAS À PAREDE CELULAR Estabilizada por pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas, Mg e Ca Proteínas externas: ligação ao substrato, transporte de mutrientes Proteínas internas: produção de energia Modelo do mosaico flúido Funções da membrana citoplasmática: – Permeabilidade seletiva – Transporte de nutrientes – Produção de energia (ATP) – Formação de endosporo – Rotação de flagelo – Segregação do material celular Moléculas que conferem rigidez a membrana citoplasmática -Esteróis - presentes nas bactérias sem parede celular (micoplasmas, fitoplasmas, espiroplasmas e metanotróficas) -Hopanoides – muitas bactérias Mesossomas (invaginação da membrana citoplasmática) – produção de ATP “Artefatos, e não estruturas celulares verdadeiras” ??? Em bactérias fotossintetizantes, os pigmentos e as enzimas envolvidos na fotossíntese são encontrados em invaginações da membrana plasmática que se estendem ao citoplasma. Essas estruturas membranosas são denominadas cromatóforos ou tilacoides. Membrana citoplasmática de Archaea Arquitetura igual a das Bacteria e Eucarya Lipídios desprovidos de ácidos graxos, apresentando cadeias laterais compostas por hidrocarbonetos Ligações do tipo éter entre glicerol e hidrocarbonetos No interior da membrana forma-se uma nonocamada lipídica em algumas espécies (maior resistência a alta temperatura, por exemplo) espécies (maior resistência a alta temperatura, por exemplo) 3.2. CITOPLASMA Estruturas: Material genético Ribossomos Em Escherichia coli, o DNA possui cerca de 4,7 Mb, exibindo Composição: 80% de água. Proteínas, carboidratos, lipídios, íons orgânicos e compostos de baixo peso molecular Ribossomos Inclusões Composição: única molécula circular longa de DNA de fita dupla (cromossomo bacteriano) Localização: próximo ao centro da célula (ligado à membrana citoplasmática) 3.2.1. MATERIAL GENÉTICO (nucleoide e plasmídeo) NUCLEOIDE Em Escherichia coli, o DNA possui cerca de 4,7 Mb, exibindo aproximadamente 1 mm de comprimento, quando linearizado. Bactérias do complexo Burkholderia cepacia (17 espécies): 2 a 4 cromossomos (geralmente 3) e um ou mais plasmídeos. O tamanho do genoma completo é de 4 a 9 Mb, cerca de três vezes maior do que o genoma de Escherichia coli. PLASMÍDEOS Composição: moléculas de DNA de fita dupla, circulares (DNA extracromossômico). Contêm de 5 a 100 genes. •Funções: –Conjugação (fator F) –Toxinas –Bacteriocinas –Antibióticos –Pigmentos –Patogenicidade e virulência–Patogenicidade e virulência –Resistência a antibióticos Exemplos de características atribuídas por plasmídeos em procariotos Tipos: não conjugativos, conjugativos, epissomas (quando integrado ao DNA cromossômico) • Plasmídeo Ti de R. radiobacter (A. tumefaciens) Megaplasmídeo (2,1 megabases) ou cromossomo 2 de Ralstonia solanacearum Plasmídeo Ti ou cromossomo 2 de R. radiobacter Corpúsculso que contém proteína e RNA Composição: 40% de proteína 60% de rRNA Tipo 70 S 30S - 1 rRNA 3.2.2. RIBOSSOMOS 30S - 1 rRNA 50S - 2rRNA Funções: locais de síntese de proteínas (polissomos - agregados ao redor do mRNA) •Localização: dispersos no citoplasma em número de 5.000 a 50.000 por célula 3.2.3 INCLUSÕES CELULARES Tipos: - Polímeros de armazenamento de carbono: ácido poli-β-hidroxibutírico (PHB), glicogênio - Polifosfato e enxofre: polifosfatos (volutina ou metacromáticos) e enxofre elementar - Inclusões magnéticas de armazenamento (magnetossomos): encontrada em bactérias Função: armazenamento de materiais de reserva - Metabolismo energético. Normalmente são envoltas por membranas (magnetossomos): encontrada em bactérias aquáticas, sendo formado por ferro magnetita 3.2.4 ENDOSPOROS Função: células especializadas de repouso (resistência). Altamente resistentes à dessecação, temperatura, agentes químicos, carência nutricional. Cerne: DNA e pequenas proteínas ácido-solúveis Ácido dipicolínico CARACTERÍSTICAS DIFERENCIAIS PPAS = pequenas proteínas ácido-solúveis • Encontrados em bactérias habitantes do solo. •Gêneros mais estudados: Clostridium e Bacillus Característica Gram Positiva Gram Negativa Reação de Gram Cor violeta ou púrpura Cor vermelha Camada peptideoglicano Espessa (múltiplas camadas) Fina (camada única) Ácidos teicóicos Presente em muitas Ausentes Espaço periplasmático Ausente Presente Membrana externa da parede celular Ausente Presente Lipopolissacarídeo (LPS) Virtualmente nenhum Elevado Lipídios e proteínas na parede celular Baixo (bactérias álcool-ácido- resistentes sim) Elevado na membrana externa Estrutura flagelar 2 anéis 4 anéis Toxinas produzidas Primariamente exotoxinas Primariamente endotoxinas CARACTERÍSTICAS DIFERENCIAIS Toxinas produzidas Primariamente exotoxinas Primariamente endotoxinas Resistência à ruptura física Alta Baixa Ruptura da parede celular por lisozinas Alta Baixa Sensibilidade à penicilina e às sulfonamidas Alta Baixa Sensibilidade à estreptomicina, ao cloranfenicol e à tetraciclina Baixa Alta Inibição por corantes básicos Alta Baixa Sensibilidade a detergentes aniônicos Alta Baixa Resistência ao dessecamento Alta Baixa REPRODUÇÃO DAS CÉLULAS BACTERIANAS ASSEXUAL Fissão binária transversa ou Cissiparidade FragmentaçãoBrotamento ASSEXUADA Formação de exósporos Actinomicetos (Streptomyces spp.) TEMPO DE GERAÇÃO - célula se dividir (minutos até 24 h - 1 a 3 h) Escherichia coli -20 minutos Mycobacterium tuberculosis - 13 a 15 h Pectobacterium carotovorum – 25 minutos Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli – 134 min CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS DA CÉLULA BACTERIANA I- NUTRIÇÃO “NUTRIENTES: Substâncias ou elementos retirados do ambiente e usados para construir novos componentes celulares ou para obter energia" Macronutrientes (C, O, N, H, S, P) Nutrientes Micronutrientes (K, Mg, Na, Cl, Fe, Mn, Zn, etc.) 1- MACRONUTRIENTES 1.1- CARBONO Maioria das substâncias que compõem a célula. Compostos inorgânicos - CO2 ou carbonatos Compostos orgânicos - proteínas,carboidratos, lipídios, etc. Ex. Pseudomonas - + de 100 compostos orgânicos diferentes Fonte de energia e carbono para as bactérias Tipo Fonte(s) de energia Fonte(s) de carbono Fotolitotróficos Luz COFotolitotróficos (Fotoautotróficos) Luz CO2 Fotorganotróficos (Fotoheterotrófico) Luz Compostos orgânicos Quimiolitotróficos (Quimioautotrófico) Reações de oxidação-redução CO2 Quimiorganotróficos (Quimioheterotrófico Reações de oxidação-redução Compostos orgânicos 1.2- OXIGÊNIO Molecular (O2) - requerido como aceptor final da cadeia de transporte de elétrons aeróbia Forma combinada - água, várias moléculas orgânicas e inorgânicas 1.3- HIDROGÊNIO Componente da matéria orgânica e inorgânica Forma molecular (H2) e Forma combinada (constituintes da água e materiais orgânicos e inorgânicos)orgânicos e inorgânicos) 1.4- NITROGÊNIO Síntese de aminoácidos, purinas, pirimidinas e outros compostos nitrogenados Compostos inorgânicos - (nitratos, nitritos ou sais de amônia) Compostos orgânicos - (aminoácidos, aminoaçúcares, peptídeos) Nitrogênio atmosférico (N2) - Bactérias fixadoras de nitrogênio Ex: Rhizobium, Azotobacter (habitantes do solo) Klebsiella pneumoniae e Clostridium spp. (patógenos humanos) 1.5 - ENXOFRE Biossíntese dos aminoácidos cisteína, cistina e metionina; de vitaminas e de grupo prostéticos de várias proteínas importantes em reações de oxido-redução As fontes naturais de enxofre incluem o íon sulfato (SO42-), sulfito de hidrogênio (H2S) e aminoácidos que contêm enxofre na sua estrutura. 1.6 - FÓSFORO Síntese de ácidos nucléicos, fosfolipídios componentes da membrana citoplasmática e adenosina trifosfato (ATP) O íon fosfato (PO43-) é uma fonte importante de fósforo para a célula Grânulos de fosfatos inorgânicos - grânulos de volutina Macronutrientes Sódio (Na+) - transporte de materiais através das membranas celulares (permease - açúcar melibiose em células de Escherichia coli) 2- MICRONUTRIENTES (Elementos-traços) Ferro (Fe2+) - na respiração (co-fator enzimático do citocromo) e transporte de elétrons Sais de ferro inorgânico insolúveis - agentes queladores de ferro (Sideróforos) - solubilizar sais de ferro e transportam dentro da célula Magnésio (Mg2+) e Potássio (K+) - integridade dos ribossomos. Cálcio (Ca2+) - componente das paredes celulares das bactérias Gram- negativas Zinco (Zn+2), cobre (Cu+2), manganês (Mn+2), molibdênio (Mo+6) e cobalto (Co+2) - para ativar enzimas. Ex: Mo+6 -- nitrogenase (N2 - NH3 - fixação de nitrogênio) Micronutrientes 3- FATORES DE CRESCIMENTO Compostos orgânicos essenciais que algumas bactérias não conseguem sintetizar : Vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas. Algumas espécies durante a evolução perderam a capacidade de sintetizar até 30-40 compostos essenciaisaté 30-40 compostos essenciais II - METABOLISMO BACTERIANO Metabolismo 1- INTRODUÇÃO Catabolismo e Anabolismo Soma de todas as reações químicas dentro de um organismo vivo (reações enzimáticas) 2- CATABOLISMO (Fase degradativa) Caracteriza as reações metabólicas que "quebram" os nutrientes para produção de energia química e compostos intermediários para a célula" 2.1- DIGESTÃO DOS NUTRIENTES Digestão extracelular - fora da célula - enzimas extracelulares (composição química ideal para serem absorvidas) Digestão intracelular - dentro da célula - endoenzimas 2.2- TRANSPORTE DOS NUTRIENTES PARA O INTERIOR DA CÉLULA Difusão simples e difusão facilitada Transporte ativo e translocação em grupo Transporte de nutrientes Difusão simples (A) e facilitada (B) Transporte ativo (A) e translocação de grupo (B) Difusão simples - transporte de solutos através dos fosfolipídios; - transporte sem gasto de energia (passivo) e a favor do gradiente de concentração; - substâncias comumente tranportadas: gás oxigênio, gás carbônico, ácidos graxos. Difusão facilitada -transporte onde uma proteína carrega um soluto através da membrana; - transporte sem gasto de energia (passivo) e a favor do gradiente de concentração; - substâncias comumente transportadas: monossacarídeos (glicose), aminoácidos. Difusão simples e facilitada Transporte Ativo (exemplo: bomba de sódio e potássio) Bolinhas vermelhas: Íon sódio - mais abundante fora da célula; - Bolinhas azuis: Íon potássio- mais abundante dentro da célula; - Bola verde: ATP;- Bola verde: ATP; - Bolas cinzas: ADP + P. - O bolão cinza é a bomba de sódio e potássio. Cada vez que gasta 1 ATP (conversão da bola verde em duas bolas azul/esverdeada) ela transporta 3 sódios para fora da célula e 2 potássios para dentro da célula. 2.3- PRODUÇÃO DE ENERGIA (ATP) Fosforilação em Nível de substrato Fosforilação Oxidativa (reações de oxido-redução) Fotofosforilação 2.3.1- VIAS METABÓLICAS DE PRODUÇÃO DE ENERGIA Catabolismo dos carboidratos Catabolismo das proteínas Catabolismo dos lipídeos CATABOLISMO DOS CARBOIDRATOS Via da Glicólise (Via de Embden-Meyerhof-Parnas) ALTERNATIVAS À GLICÓLISE Via da Pentose Fosfato - Bacillus subtilis, Escherichia coli, etc. Via Entner-Doudoroff - Rhizobium, Pseudomonas e Agrobacterium (não encontrada em Gram positivas) Via da Glicólise Ciclo de Krebs ou do Àcido tricaborxílicoÀcido tricaborxílico Cadeia de Transporte de Elétrons Membrana citoplasmática Respiração x Fermentação Comparação da Respiração Aeróbia, Respiração Anaeróbia e Fermentação CATABOLISMO DAS CATABOLISMO DAS PROTEÍNAS E LIPÍDEOS 3- ANABOLISMO (Fase BIOSSINTÉTICA) Caracteriza as reações metabólicas que produzem novas estruturas celulares a partir da polimerização dos compostos intermediários e da utilização da energia provenientes do catabolismo. Biossíntese de Polissacarídeos Biossíntese de Lipídeos Biossíntese de Aminoácidos e Proteínas Biossíntese de Purinas e Pirimidinas Biossíntese de Carboidratos ANABOLISMO III CRESCIMENTO BACTERIANO 1- DIVISÃO BACTERIANA Crescimento exponencial - Tempo de geração 1 : 2: 4 : 8 : 16 : 32 : 64: ... 20 : 21 : 22 : 23 : 24 : 25: 26 : ... 2número de gerações (2,2 x 1043 células em 48h) 2- FASES DO CRESCIMENTO BACTERIANO . Fase lag: as células estão mudando seu metabolismo para se adaptarem ao novo meio. Nesta fase as células rapidamente replicam DNA e RNA e induzem a síntese de novas enzimas necessárias para a divisão celular e assim um grande aumento na atividade metabólica aparece, porém não há aumento do número de células (taxa de crescimento zero). Fase logarítmica (log) ou exponencial: nesta fase a divisão celular ocorre em uma taxa de crescimento máxima e constante para as condições fornecidas pelo meio. O logaritmo do número celular aumenta linearmente com o tempo. Verifica-se o pico de atividade e eficiência fisiológica. Fase estacionária: não há aumento ou decréscimo sensíveis no número de células. Com o acúmulo de produtos metabólicos tóxicos e/ou exaustão de nutrientes, algumas células morem enquanto outras se dividem. O número de células viáveis diminui, porém a taxa de crescimento zero. Fase de declínio ou morte: o acúmulo adicional de produtos metabólicos inibitórios e depleção dos nutrientes essenciais provocam a morte celular. A taxa de morte é acelerada e o número de células viáveis diminui de forma exponencial, obtendo-se uma taxa de crescimento negativa. Curva de crescimento de Pseudomonas syringae pv. garcae em tecidos de folha de cafeeiro, artificialmente inoculados (adaptado de Oliveira et al., 1991) Contagem de células viáveis – método de semeadura Contagem de células viáveis – método de diluição Quorum sensing Quorum sensing... ou auto-indução... ou sensoriamento populacional... Processo de comunicação célula-célula no qual genes bacterianos são expressos de acordo com a densidade populacional, após uma concentraçãodensidade populacional, após uma concentração crítica de moléculas auto-indutoras ter sido atingida (Fuqua et al,1994). Gram negativas: N – acil homoserinaslactonas Gram positivas: peptídeos modificados pós tradução; Peptídeos não modificados; g - butirolactonas (semelhantes a AHLs) Formação de biofilmes Conjugação Metabólitos secundários Quorum Alguns processos regulados por Quorum sensing Motilidade Nodulação Virulência sensing Quorum sensing – Formação de biofilmes Biofilmes – organizações de células bacterianas aderidas a uma superfície (biótica ou abiótica), envolta por uma matriz adesiva excretada pelas células (mistura de polissacarídeos). Etapas da formação do biofilme: 1 – Adesão reversível; 2 – Adesão irreversível2 – Adesão irreversível 3 – Formação de microcolônias e maturação; 4 – Biofilme maduro; 5- Desadesão (liberação). Os biofilmes podem conter apenas uma ou duas espécies ou, mais comumente, várias espécies bacterianas. Por que as bactérias formam biofilme? -Resistência a força física; - Resistência a fagocitose pelas células do sistema imune; -Proteção contra antimicrobianos, radiações UV, alterações de pH, choques osmóticos e UV, alterações de pH, choques osmóticos e dessecação. Controle dos biofilmes - Novos agentes antibacterianos capazes de penetrar nos biofilmes; -Fármacos que impeçam a formação do biofilme (ex. furanomas em superfícies abióticas); - Bactérias antagonistas que impeçam a formação ou destruam o biofilme. 3- FATORES QUE AFETAM O CRESCIMENTO BACTERIANO 3.1- TEMPERATURA Metabolismo x enzimas x temperatura Classificação das bactérias quanto a variação de temperatura ideal: Bactérias encontradas em alimentos refrigerados, nas profundezas dos oceanos e certos locais da região Ártica Ex. Polaromonas sp. (bloco de gelo do mar Antártida) - Psicrófilas: mínima - 0C ou menos ótima 15 - 20C máxima em 30C. Maioria das bactérias que degradam alimentos, patogênicas e habitantes do solo - Mesófilas: ótima - 25-40C mínima - 15-20C máxima - 43C Compostos orgânicos, mistura de fertilizantes e nascentes quentes. - Hipertemófilos: ótima – superior 80C Hipertermófilas Áreas vulcânicas, profundezas oceânicas em regiões hidrotermais - Termófilas: ótima - 50 e 60C mínima - 25-45C máxima 85C Bactéria Temperatura (oc) Mínima Ótima Máxima Pseudomonas fluorescens 4 25-30 40 Pseudomonas syringae pv. glycinae 2 24-26 35 Bactérias fitopatogênicas são tipicamente Mesófilas – ótima de 25 a 28oc Termofilia X biotecnologia A enzima termoestável DNA-polimerase (Taq polimerase), isolada da bactéria Termus aquaricus, é utilizada na reação de polimerase em cadeia (PCR) 3.2- OXIGÊNIO - Aeróbias: requerem oxigênio para o crescimento e produção de energia. Podem crescer a uma atmosfera padrão de 21% de oxigênio. Ex.: Bactérias do gênero Pseudomonas, Ralstonia, Xanthomonas, etc. (maioria das bactérias fitopatogênicas) - Anaeróbias: podem ser mortas pelo oxigênio, não podem crescer na presença do ar e não utilizam oxigênio para as reações de produção de energia. Ex.: Bactérias do gênero Clostridium - Aeróbias Facultativas: crescem na presença de ar atmosférico e podem - Aeróbias Facultativas: crescem na presença de ar atmosférico e podem também crescer em anaerobiose. Elas não requerem oxigênio para o crescimento, embora possam utilizá-lo para a produção de energia em reações químicas. Sob condições anaeróbias obtém energia por um processo metabólico chamado fermentação. Ex.: As bactérias fitopatogênicas dos gêneros Pectobacterium e Erwinia - Microaerófilas: podem utilizar oxigênio nas reações químicas para produção de energia. Não podem resistir a níveis de oxigênio (21%) presentes na atmosfera e normalmente crescem melhores em níveis de oxigênio variando de 1 a 15%. - REAÇÕES COM O OXIGÊNIO LIVRE Bactérias fitopatogênicas Superóxido dismutase Catalase e Oxidase Bactérias fitopatogênicas - Aeróbicas (maioria) -Anaeróbicas facultativas (ex. Pectobacterium carotovorum) -Anaeróbicas (ex. Clostridium puniceum) a = Aeróbias obrigatórias; b = Anaeróbias; c = Aeróbias facultativas; d = Microaeróbias; e = Anaeróbias aéreos tolerantes 3.3- POTENCIAL HIDROGENIÔNICO (pH) Bactérias Neutrófilas - grande maioria – pH ótimo em torno de 7,0 Bactérias acidófilas – pH normalmente abaixo de 6,0 Procariota mais acidófilo - Piscrophilus oshimae (Archae) pH ótimo 0,7, e acima de 4,0 a célula sofre lise (habita solos quentes e extremamente ácidos – vulcões) Bactérias alacalifílicas – pH normalmente superior a 9,0 (lagos ricos em carbonato de sódio e em solos contendo alta concentração de carbonatos). Bacillus firmus – ótimo pH 11 Bactérias fitopatogênicas grande maioria Neutrófila – pH ótimo em torno de 7,0 (Faixa de tolerância de 4,0 - 9,0) Bactéria Limites de pH Mínimo Ótimo Máximo Erwinia amylovora 4,0-4,5 6,8 8,8 Ralstonia solanacearum 5,0-5,3 6,8-7,1 9,1-9,4 pH intracelular neutro - expulsão ou absorção de íons hidrogênio pela célula, através de sistemas de transporte de prótons na membrana citoplasmática 3.4- PRESSÃO OSMÓTICA Plasmólise - perda de água por osmose -Meio isotônico: o fluxo de água para dentro e para fora da célula está em equilíbrio; a célula cresce normalmente. -Meio hipertônico: a concentração de solutos é mais alta no meio externo do que no citoplasma da célula; a célula perde água para o meio e pode desidratar e morrer. Ex. Peixe salgado, frutas em calda, mel e leite condensado - Meio hipotônico: na solução externa a concentração de solutos é muito mais baixa do que na célula; a água flui para dentro da célula que rompe. Célula em meio isotônico Célula em meio hipotônico Célula em meio hipertônico baixa do que na célula; a água flui para dentro da célula que rompe. Bactérias fitopatogênicas são não-halófilas (só toleram baixas concentrações de sais no meio) VARIABILIDADE EM BACTÉRIAS : MUTAÇÃO E RECOMBINAÇÃO 1- MUTAÇÃO Alteração na sequência de bases do DNA Classificação: mutação pontual mutação por deslocamento do quadro de leitura a) Mutação pontual Substituição de um nucleotídeo por outro em um gene. Mutação neutra ou silenciosa Mutação errônea Mutação sem sentido b) Mutação por deslocamento do quadro de leitura Adição ou perda de um ou mais nucleotídeos do gene Principais modificações observadas: - Perda da síntese de um ou mais fatores de crescimento como aminoácidos, purinas, pirimidinas e vitaminas (Auxotróficos) - Resistência a antibióticos e quimioterápicos - Perda na capacidade de produzir flagelo, pili e cápsula Transposons são segmentos de DNA com grande mobilidade, eles codificam a enzima TRANSPOSONS transposase - responsável por sua transferência para outros segmentos de DNA. AGENTES MUTAGÊNICOS Agente químico ou físico que faz com que a frequência de mutação (número de mutantes por gene em cada geração) supere a frequência espontânea normal Mutação natural - uma vez a cada 10-6 a 10-10 células Agente mutagênico - uma vez a 10-3 a 10-5 célulasAgente mutagênico - uma vez a 10 a 10 células Tipos: luz ultravioleta (UV) e os raios X ácido nitroso, corante de acridina, 5-bromouracil, sulfonato de etil metano e nitroso-guanidina Tipos de Mutações Troca de genes entre duas moléculas de DNA para formar novas combinações em um cromossomo Recombinação em bactérias: Transformação Transdução Conjugação Célula doadora x Célula receptora 2- RECOMBINAÇÃO 2.1- TRANSFORMAÇÃO2.1- TRANSFORMAÇÃO Célula receptora adquire genes de moléculas de DNA solúveis no meio, incorporando pequenos fragmentos de DNA do doador em seu próprio cromossomo Célula bacteriana competente - produzir proteína especial que liga os fragmentos de DNA doador em sítios específicos na superfície celular Laboratório - competência induzida em Escherichia coli (incubada em CaCl2 e choque térmico) DNA cromossômico e DNA plasmidial - engenharia genética. 2.2- TRANSDUÇÃO Transferência de material genético de uma célula doadora para receptora, mediada por um vírus (bacteriófago) Transdução generalizada Ocorre no ciclo lítico. Durante a fase de montagem da progêniedo fago dentro da célula hospedeira infectada, qualquer fragmento de DNA ou plasmídio da bactéria que tenha aproximadamente o mesmo tamanho do DNA do fago pode ser acidentalmente incorporado pelo capsídeo em vez do DNA fágico. Transdução especializada Quando a lisogenia é interrompida, o fago entra no ciclo lítico e é excisado do cromossomo. Como resultado, têm-se partículas resultado, têm-se partículas virais intactas (evento normal) e partículas contendo DNA do fago mais genes específicos do hospedeiro, ou seja, genes adjacentes ao ponto de inserção do fago ao cromossomo (evento raro). 2.3- CONJUGAÇÃO Material genético é transferido de uma bactéria para outra, através de contato célula-célula Gram negativas - plasmídeo (F+) codifica síntese de pili sexuais Gram positivas - co-agregação através de moléculas de superfícies aderentes (feromonas) da célula doadora Transferência de DNA plasmidial por Conjugação Transferência de DNA cromossômico por Conjugação Recombinação genética em bactérias CLASSIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS: Na classificação atual dos três Domínios e 25 Reinos (Woese, 1977), os procariotos fitopatogênicos dentro do domínio Eubacteria são encontradas nos Filos (Reinos) Proteobacteria (bactérias Gram negativas), Firmicutes (bactérias Gram positivas), Actinobactéria (Gram positiva) e Tenericutes (sem parede celular) International Committee on Systematic Bacteriology Bacteriological Code TAXONOMIA DAS BACTÉRIAS Novos epítetos - proposições ou listas no International Journal of Systematic Bacteriology (http://www.cme.msu.edu/bergeys/) Bacteriological Code International Journal of Systematic Bacteriology - Bergey's Manual IDENTIFICAÇÃO: características morfológicas, bioquímicas, sorológicas, moleculares • NOMENCLATURA: Sistema estabelecido em 1935 por Carolus Linnaeus Nomenclatura binomial – Ralstonia solanacearum Reino/Filo do domínio Bacteria: Proteobacteria, Firmicutes, Cyanobacteria, Chlamydia, Planctomycetae, Flavobacteria, Chlorobia, Spirochetes, Xenobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, Thermodesulfobacteria, Aquificae C la ss ifi ca çã o at ua l d os p rin ci pa is g ên er os d e B ac té ria s Fi to pa to gê ni ca s n o D om ín io B ac té ria ( K ad o, 2 01 0; E uz èb y) B as ea da n a co m pa ra çã o de s eq uê nc ia s rD N A 1 6S Filo (30) Classe Família Gênero Proteobacteria Gram - Alfaproteobacteria Rhizobiaceae Rhizobium Sphingomonadaceae Sphingomonas Phyllobacteriaceae ‘Candidatus Liberibacter’ Betaproteobacteria Burkholderiaceae Burkholderia Ralstoniaceae Ralstonia Comamonadaceae Acidovorax Gammaproteobacteria Xanthomonadaceae Xanthomonas Xylella Pseudomonadaceae Pseudomonas Rhizobacter Xylophylus Enterobacteriaceae Brenneria, Dickeya C la ss ifi ca çã o at ua l d os p rin ci pa is g ên er os d e B ac té ria s Fi to pa to gê ni ca s n o D om ín io B ac té ria ( K ad o, 2 01 0; E uz èb y) B as ea da n a co m pa ra çã o de s eq uê nc ia s rD N A 1 6S Enterobacteriaceae Brenneria, Dickeya Erwinia, Pantoea Pectobacterium, Salmonella Serratia, Tatumella ‘Candidatus Phlomobacter’ Firmicutes Tenericutes Clostridia Bacilli Mollicutes Clostridiaceae Bacillaceae Spiroplasmataceae Clostridium Bacillus Spiroplasma ‘Candidatus Phytoplasma’ Actinobacteria Gram + Actinobacteria Micrococcaceae Arthrobacter Microbacteriaceae Clavibacter, Curtobacterium, Leifsonia, Rathayibacter Nocardiaceae Streptomycetaceae Rhodococcus Streptomyces Gênero Gram P. celular Forma Motilidade Alfaproteobacteria Rhizobium - Sim Bastonete Monotríquia Sphingomonas - Sim Bastonete Atríquia ou monotríquia ‘Candidatus Liberibacter’ - Sim Bastonete - Betaproteobacteria Burkholderia - Sim Bastonete Monotríquia Ralstonia - Sim Bastonete Lofotríquia Acidovorax - Sim Bastonete Monotríquia Gamaproteobacteria Xanthomonas Xylella - Sim Bastonete Monotríquia Atríquia, imóvel Pseudomonas Rhizobacter Xylophylus - Sim Bastonete Mono ou lofotríquia Atríquia ou monotríquia Monotríquia Brenneria, Dickeya - Sim Bastonete PeritríquiaBrenneria, Dickeya Erwinia, Pectobacterium Pantoea Salmonella, Serratia, Tatumella ‘Candidatus Phlomobacter’ - Sim Não Bastonete Pleomórfico Peritríquia Peritríquia Atríquia, imóvel - - Firmicutes Tenericutes Clostridium Bacillus Spiroplasma ‘Candidatus Phytoplasma’ + + NP NP Sim Sim Não Não Bastonete Espiralado Pleomórfico Peritríquia Peritríquia Atríquia, rotação/contração Atríquia Actinobacteria Arthrobacter + Sim cocos - Clavibacter, Curtobacterium, Leifsonia, Rathayibacter + Sim bastonetes Atríquia / monotríquia Atríquia / - Rhodococcus Streptomyces + Sim Cocos Micelial - Atríquia, imóvel Gênero Espécie Doença Acidovorax Acidovorax citrulli Mancha aquosa do melão Rhizobium (Agrobacterium) Rhizobium radiobacter (Agrobacterium tumefaciens) Galha em coroa Bacillus Bacillus cereus Bacillus subtilis Podridão em melão e batata Podridão em manga Ralstonia (Pseudomonas) Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum) Murcha bacteriana em solanáceas e bananeira Clavibacter (Corynebacterium) Clavibacter xyli subsp. xyli Clavibacter michiganense subsp. Michiganense Raquitismo da soqueira da cana-de-açúcar Cancro bacteriano do tomateiro Clostridium Clostridium puniceum Podridão em batata e cenoura Xanthomonas Xanthomonas campestris pv. citri Cancro cítricoXanthomonas Xanthomonas campestris pv. citri Xanthomonas campestris pv. campestris Cancro cítrico Podridão negra das crucíferas Erwinia Erwinia amylovora Erwinia stewuartii Queima da macieira Murcha do milho Pectobacterium Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Podridões moles Pseudomonas Pseudomonas syringae pv. tomato Murcha bacteriana pequena do tomateiro Streptomyces Streptomyces sacabies Streptomyces ipomeae Sarna da batata, nabo, etc. Sarna da batata-doce BLX (Bactérias limitadas ao xilena) Xylella fastidiosa Clorose variegada dos citros Escaldadura das folhas da ameixeira BLF (Bactérias limitadas ao floema) Sem nomenclatura "Club leaf" do trevo
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