Enzimologia: Estudo da Atividade Enzimática

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Enzimologia LOT-2017 - Estágio PAE 
Supervisor: Fernando Segato 
Aluna: Fernanda Valadares 
 
Outubro de 2014 
 
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA 
§  A Atividade Enzimática refere-se a propriedades catalíticas de 
uma enzima. 
§  Enzimas, em geral, proporcionam reações únicas e essa 
característica pode ser usada para quantificá-las: 
 
 
 
 
 
 
onde: 
E = enzima; S = substrato; P = produto 
˜  Desaparecimento do substrato e formação do produto de reação em 
função do tempo de uma reação catalisada por uma enzima 
˜  Definição da Atividade enzimática: 
o  1 UI (unidade internacional de enzima) corresponde à 1 μmol de 
produto formado por minuto de reação 
o  consumo de 1 μmol de substrato por minuto 
ATIVIDADE = Velocidadei 
d[P]/dt = - d[S]/dt 
˜  A atividade é expressa com base em UI por alguma medida de 
volume ou massa. 
o  UI/volume (UI/ml; UI/L) 
o  UI/massa (UI/mg) 
 
˜  Atividade Específica 
A expressão da atividade enzimática em UI/massa de proteína 
total existente na solução 
˜  Tabela de purificação 
 
o  Exemplo: Purificação de polifeoloxidases (PFO) da polpa de 
pinha madura 
( LIMA, et al. 2001) 
i)  Identificação de uma enzima em especial em uma espécie 
distinta, como um organismo ou um tecido 
Zimograma da atividade de β-glucosidase Screening da atividade de celulases 
produzidas por fungo 
ii)  Determinação da quantidade de enzima em uma amostra 
 
o  DNS: ácido 3,5-dinitrosalicilico 
O método de Miller, 1959, estima a concentração de açúcares redutores. 
 
 
 
 
 
 
 
 
AMARELO LARANJA 
(540nm) 
˜  A atividade enzimática medida in vitro, sob condições 
controladas, muitas vezes não se assemelham aos in vivo. 
 
o  Inibição pelo produto 
o  Compostos repressores da atividade 
o  Ausência de co-fatores da atividade 
o  Atividade sinérgica de outras enzimas 
˜  Um estudo dos parâmetros que afetam a atividade enzimática 
possibilita a extrapolação para a atividade esperada ocorrer in 
vivo. 
˜  Leonor Michaelis e Maud Menten, 1913: 
 
o  A atividade de enzimas depende de condições definidas 
para temperatura, pH, natureza e força dos íons. 
o  Ensaios enzimáticos apenas podem confiantemente 
comparados quando tais condições sejam consideradas . 
Ø  Para o estudo do efeito 
isolado de um dos 
fatores acima é 
necessário manter todos 
os outros fatores fixos 
˜  Valores extremos de pH causam desnaturação das proteínas 
i)  Alteração do estado de 
protonação dos grupos 
funcionais dos 
aminoácidos e co-fatores 
envolvidos na reação 
catalítica 
ii)  Alteração da estrutura 
tridimencional da proteína 
nativa 
Ø  Adição de cargas 
pode causar repulsão 
interna 
Ø  Neutralização das cargas 
evolvidas nas forças 
atrativas que mantém a 
estrutura 
 
˜  Diferentes enzimas diferem o pH em que apresentam 
atividade ótima 
˜  Tampões ajustam e 
estabilizam o pH desejado 
durante o ensaio enzimático. 
o  
 
Tripsina: deve ser armazenada em pH 3,0 embora seu 
pH ótimo seja de 9,5, afim de suprimir autólise 
 
˜  Força iônica, concentração e natureza dos componentes do 
tampão deve ser considerado (maioria entre 0,05 e 0,2 M) 
 
˜  Lista de tampões biológicos 
˜  Diferentes proteínas tem 
diferentes energias de ativação. 
˜  A estrutura tridimensional das 
enzimas são termo sensíveis e 
começam a desestabilizar em 
altas temperaturas. 
˜  Dependência da temperatura de 
pré-incubação da enzima. 
˜  Enzimas termoestáveis 
o  Taq polimerase: 
•  DNA polimerase proveniente da bactéria extremófila encontrada em 
fontes hidrotermais. 
•  A temperatura ótima de atividade é 75-80°C. 
o  Geleificação do leite UHT devido a ação de 
 proteases e lipases termoestáveis que 
permanecem ativas após o processo de 
esterilização. 
Taq Polimerase meia vida Temperatura 
5 minutos 97,5°C 
40 minutos 95°C 
120 minutos 92,5°C 
˜  Pode-se definir o(s) substrato(s) e co-fatore(s) de uma enzima de 
acordo com sua função fisiológica. 
˜  Xilose isomerase - (Glucose isomerase) 
 
 
Substrato fisiológico 
Substrato industrial 
“High Fructose Corn Syrup (HFCS)” 
Costa et al. 2013 
Fragmentos do entrenó da 
cana de açúcar. As quatro 
frações indicadas: A – 
Casca; B – Córtex; C – 
Interface córtex –medula; 
D - Medula 
˜  O estado físico, grau de pureza, solubilidade e estabilidade do 
substrato influenciam na atividade enzimática. 
˜  “Quantidade de enzima necessária para..“ 
 A atividade enzimática pode diferir de acordo com 
"afinidade" da enzima pelo substrato ou pelo tipo de substrato em 
termos de susceptibilidade estrutural à transformação 
 
˜  Exemplo: Hidrólise da celulose em diferentes regiões da cana de 
açúcar 
˜  Para um excesso de S no meio reacional, a velocidade da reação é 
determinada pela segunda etapa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A eficiência catalítica de 
diferentes substratos 
pode ser comparada de 
acordo com seu Km. 
 
Km = Constante de 
Michaelis 
 
Relaciona a afinidade de 
ligação da enzima e 
substrato 
˜  Formação do produto em função do tempo 
˜  A inclinação da reta pode ser 
assumida como velocidade máxima 
de conversão e usada para o calculo 
de atividade 
˜  A quantidade de enzimas em uma reação enzimática deve ser 
o mais baixo possível 
 
 
 
 
 
˜  Ensaios com parada de reação 
 
Parada da reação devido desnaturação da enzima: 
o  Ácido forte 
o  Álcali ou detergente 
o  Aquecimento 
o  Inibidores irreversíveis (como íons de metais pesados) 
o  Agentes complexantes (EDTA) 
o  Resfriamento em gelo 
 
 
˜  Ensaios Contínuos 
O progresso da reação é seguido no momento em que a mesma 
ocorre. 
 
 - Conveniente pois o resultado é imediato 
 
 - Nem todas as enzimas apresentam ensaios que possam 
 ser observados continuamente. 
 
Ensaios que permitem observar a atividade das enzimas causam 
mudanças: 
o  Absorbância 
o  Florescência 
o  Viscosidade 
o  pH 
˜  Ideal: Métodos que permitem a medição do produto ou 
substrato na presença um do outro 
˜  Atividade de beta-glicosidase 
4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside 
Celobiose 
˜  Métodos de separação do produto do substrato 
TLC: cromatografia de camada delgada 
Products of starch degradation by 
crude enzyme preparation 
Cromatografia líquida de alta performace 
HPLC 
˜  Existem diversos protocolos de ensaios de atividade enzimática