Cinetica Enzimática

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ENZIMOLOGIA APLICADA 
 CINÉTICA ENZIMÁTICA 
 
Profª. Manuela Poletto Klein 
manuela-klein@uergs.edu.br 
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g
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 A
p
lica
d
a
 
2 
Cinética enzimática 
 
o O que é cinética? 
 
o Velocidade das reações químicas/enzimáticas 
o Variável Tempo 
http://www.iq.ufrgs.br/ead/fisicoquimica/cineticaquimica 
Termodinâmica 
(espontânea) 
 
versus 
 
Cinética 
(reação v. desprezível) 
Grafite 
Diamante 
 
3 
Cinética enzimática 
 
o Ordem de reação 
 
http://www.iq.ufrgs.br/ead/fisicoquimica/cineticaquimica 
Para a reação: 
 
aA +bB → cC + dD 
 
 
Lei de Velocidade: 
 
v = kCA
α CB
β 
 
onde: 
 alfa: ordem em relação à A 
 beta: ordem em relação à B 
 
 Alfa + beta = ordem global 
 
 
 
4 
Cinética enzimática 
 
Ordem zero: 
 
http://www.iq.ufrgs.br/ead/fisicoquimica/cineticaquimica 
o Velocidade é uma constante 
 
Ex.: reações enzimáticas com alta [S] 
 
A → produtos 
 
 
 
5 
Cinética enzimática 
 
Ordem zero: 
 
http://www.iq.ufrgs.br/ead/fisicoquimica/cineticaquimica 
o Velocidade é uma constante 
 
Ex.: reações enzimáticas com alta [S] 
 
A → produtos 
 
 
 Ordem zero 
 
6 
Cinética enzimática 
 
Primeira ordem: 
 
http://www.iq.ufrgs.br/ead/fisicoquimica/cineticaquimica 
o Velocidade diretamente proporcional 
à [S] 
 
A → produtos 
 
 
 
Primeira ordem 
 
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Cinética enzimática 
 
Segunda ordem: 
 
http://www.iq.ufrgs.br/ead/fisicoquimica/cineticaquimica 
o Velocidade varia com o quadrado 
da [S] 
 
 
 
Ex.: monomolecular 
A → produtos 
 
 
 
Ex.: bimoleculares 
aA + bB → produtos 
8 
Cinética enzimática 
 
 
o Equação de Michaelis-Menten 
Velocidade 
inicial 
Concentração 
de Substrato 
9 
Cinética enzimática 
 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten 
 
o Wurtz; 
 
o Victor Henri (1903): formação [ES] é necessária; 
 
o Leonor Michaelis e Maud Menten (1913): teoria geral 
da ação de enzimas; 
 
 
 
 
10 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
• No início da reação, [P] é baixa 
 
 
 
 
 
11 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
 
• No início da reação, [P] é baixa: 
 
 
 
• v0: velocidade da reação enzimática 
 
 
 
 
 
12 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
 
• No início da reação, [P] é baixa: 
 
 
 
• v0: velocidade da reação enzimática 
 
 
 
 
 
13 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
 
• No início da reação, [P] é baixa: 
 
 
 
• v0: velocidade da reação enzimática 
 
 
 
 
 
NÃO PODE SER 
DETERMINADO 
FACILMENTE 
14 
Cinética enzimática 
 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
• Considerações: 
 
• Enzima total: [Et] 
 
• Enzima “livre”, não ligada: [E] = [Et] – [ES] 
 
• [S] >>> [Et], [ES] é negligenciável qdo comparado à [S] 
 
 
15 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
• Passo 1: taxa de formação e quebra do complexo ES 
16 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
• Passo 1: taxa de formação e quebra do complexo ES 
17 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
• Passo 1: taxa de formação e quebra do complexo ES 
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Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
• Passo 1: taxa de formação e quebra do complexo ES 
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Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
 
•Teoria do Estado Estacionário (Briggs-Haldane, 1925): 
 
Assume-se que logo após um estado transiente inicial muito 
rápido, alcança-se o estado estacionário, onde a variação 
de [ES] com o tempo é insignificante com relação as 
variações de [S] e [P]. 
 
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Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
• Passo 2: Em estado estacionário ( ) 
 
 
21 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
• Passo 2: Em estado estacionário ( ) 
 
 
22 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
• Passo 2: Em estado estacionário ( ) 
 
 
23 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
• Passo 3: Isolando [ES] 
24 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
• Passo 3: Isolando [ES] 
25 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
• Passo 3: Isolando [ES] 
Km 
26 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
 
• Passo 3: Isolando [ES] 
Km 
27 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
• Passo 4: Substituindo [ES] na equação 
28 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
• Passo 4: Substituindo [ES] na equação 
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Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
• Vmax= ocorre quando toda enzima está saturada pelo 
substrato, ou seja, [ES] = [Et] 
 
 
Assim: 
30 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
• Vmax= ocorre quando toda enzima está saturada pelo 
substrato, ou seja, [ES] = [Et] 
 
 
Assim: 
31 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
• Quando 
32 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
• Quando 
33 
Cinética enzimática 
 
o Dedução da equação de Michaelis-Menten: 
 
 
• Quando 
Km = [S] quando 
Concentração de substrato 
V
e
lo
ci
d
ad
e
 d
a 
re
aç
ão
 
34 
Cinética enzimática 
 
o Gráfico de Michaelis-Menten: Vel x [S] 
 
 
35 
Cinética enzimática 
 
 
o Interpretando Vmáx 
 
 
 
 
• Velocidade limitante da reação (constante V); 
 
• Vmáx= k2[Et]; 
 
• k2 pode ser substituído por kcat: 
 
• Cte catalítica ou nº turnover; 
 
• Nº moléculas de substrato que uma molécula de enzima 
pode converter em produto por tempo. 
 
36 
Cinética enzimática 
 
 
o Interpretando Km 
 
o Concentração de substrato correspondente a metade de 
Vmáx (metade da concentração de saturação); 
 
 
o Incorpora as constantes cinéticas para formação de ES 
e P, e dissociação de ES; 
 
 
 
 
 
o Afinidade: 
o Km alto: maior [substrato] para atingir ½ da Vmáx , 
 (baixa afinidade enzima-substrato) 
 
 
Km 
Concentração de substrato 
V
e
lo
ci
d
ad
e
 d
a 
re
aç
ão
 
37 
Cinética enzimática 
 
o Gráfico de Michaelis-Menten 
 
 Se [S] << Km: 
Reação de 1ª 
ordem 
Concentração de substrato 
V
e
lo
ci
d
ad
e
 d
a 
re
aç
ão
 
38 
Cinética enzimática 
 
o Gráfico de Michaelis-Menten 
 
 Se [S] << Km: 
Reação de 1ª 
ordem 
Se [S] >> Km: 
Reação de 
ordem zero 
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Cinética enzimática 
 
o Gráfico de Michaelis-Menten 
 
 
40 
Cinética enzimática 
 
o Gráfico do Duplo Recíproco 
 (ou de Lineweaver-Burk) 
 
 
o Tomando o duplo recíproco: 
 
o Dada a eq. de Michaelis-Menten: 
o Separando os quocientes: 
 
41 
Cinética enzimática 
 
o Gráfico do Duplo Recíproco 
 (ou de Lineweaver-Burk) 
 
 
o Tomando o duplo recíproco: 
 
o Dada aeq. de Michaelis-Menten: 
o Separando os quocientes: 
 
Eq. de Lineweaver-Burk: 
 
42 
Cinética enzimática 
 
o Gráfico do Duplo Recíproco 
 (ou de Lineweaver-Burk) 
 
 
y = a x + b 
 
o Coeficiente angular? 
o Coeficiente linear (intercepto)? 
o x? 
o y? 
 
43 
Cinética enzimática 
 
o Gráfico do Duplo Recíproco 
 (ou de Lineweaver-Burk) 
 
 
y = a x + b 
 
o Coeficiente angular? 
o Coeficiente linear? 
o x? 
o y? 
 
44 
Cinética enzimática 
 
o Gráfico do Duplo Recíproco 
 (ou de Lineweaver-Burk) 
 
 
o Erros experimentais em 
baixas [S] geram erros 
enormes em 1/v; 
 
o Em altas [S] erros são 
minimizados; 
 
o [S] : 0,5 a 10 Km. 
 
 
 
45 
Cinética enzimática 
 
Gráfico de Eadie-Hofstee: 
 
 
 
o Rearranjando: 
 
o Dada a eq. de Michaelis-Menten: 
o Dividindo por [S] e isolando v0: 
 
46 
Cinética enzimática 
 
Gráfico de Eadie-Hofstee: 
 
 
 
y = a x + b 
 
 
oResultados geralmente bons; 
 
oTem o efeito oposto do duplo 
recíproco: 
 
oAo invés de “mascarar” 
resultados ruins, tende a 
“esconder resultados 
melhores” 
47 
Cinética enzimática 
 
Gráfico de Hanes-Woolf: 
 
 
 
o Rearranjando: 
 
o Dada a equação de Michaelis-Menten: 
 
o Dividindo por Vmáx e isolando : 
 
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Cinética enzimática 
 
Gráfico de Hanes-Woolf: 
 
 
 
y = a x + b 
 
 
oRecomendado em relação ao 
duplo recíproco; 
 
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Cinética enzimática 
 
Realização de um ensaio cinético: 
 
http://www.wiley.com/college/pratt/0471393878/student/ani
mations/enzyme_kinetics/ 
 
 
• Preparar amostras de 1 mL; 
 
• [S] = variar de 0 a 200 mM; 
 
• [E] = fixar a 0,5 mM; 
 
• Tempo = 5 min; 
 
• Diluir o tampão 10 x. 
 
 
 
50 
Exercício: 
 
Considere os dados abaixo de valores de concentração de produto 
P (mM) em vários tempos t (min), para cinco diferentes 
concentrações iniciais de substrato S. 
 
 
 
 
 
 
Com base nestes dados, estimar a velocidade inicial para cada 
concentração. Logo, estimar os valores de Km e Vmáx, assumindo 
que a reação enzimática segue uma cinética de Michaelis-Menten, 
através de diferentes métodos (Michaelis-Menten, Lineweaver-
Burk, Eadie-Hofstee e Hanes-Woolf). Comparar os resultados.