MÉTODOS ALTERNATIVOS PARA ENUMERAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS

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MÉTODOS ALTERNATIVOS PARA ENUMERAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS
Componente: Gustavo
Heliel 
Leanne Rosa 
Natalia Fernandes
Sarah Prinscyla
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Detecção de presença ou de ausência de microrganismos em uma amostra; 
Ex: esterilidade e ausência de microrganismos específico
Enumeração de microrganismos em uma amostra-teste; 
Baseia-se no crescimento de UFC
Caracterização e identificação de microrganismos.
Baseada em morfologia e coloração
Tecnologias Aplicáveis
Tecnologias baseadas no crescimento 
Tecnologias baseadas na viabilidade 
Tecnologias baseada nos componentes celulares, ou artefatos
Tecnologias baseadas nos ácidos nucleicos
TECNOLOGIAS PARA TESTE DE CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO
Tecnologias baseadas no crescimento
Base parâmetros bioquímicos ou fisiológicos
Bioluminescencia ATP E AK, por aplicação;
Detecção colorimétrica e de pressão do headspace pela introdução do carbono;
Utilização de carbono, reações bioquímicas e fisiológicas;
Impedância e condutividade;
Plaqueamento espiral;
Método de membrana filtrante hidrofóbica quadriculada;
Método pour plate;
Métodos de tubos múltiplos, número mais provável;
Método de filtração por membrana.
TECNOLOGIAS PARA TESTE DE CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO
Tecnologias baseadas na viabilidade
Baseia-se na coloração vital ou fluorescência clivagem enzimática
Vantagem: Universal e rápida
Microscopia direta de filtro epifluorescente;
Citometria de fluorescência por varredura e laser da membrana;
Citometria de fluxo por coloração vital ou fluorescência.
TECNOLOGIAS PARA TESTE DE CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO
Tecnologias baseadas em componentes celulares ou artefatos
Baseia-se nos componentes celulares e proporciona um alto grau de especificidade.
Vantagem: Resultados rápidos
X Desvantagem: elevado número de células
Perfis de ésteres metílicos de ácidos graxos
Espectrometria de massa por dessorção e ionização a laser assistida por matriz
Técnica de fluorescência de anticorpos
Ensaio de imunossorbância ligada a enzima
Aglutinação de látex 
Ensaio de endotoxina
Coloração de Gram
TECNOLOGIAS PARA TESTE DE CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO
Tecnologia baseada nos ácidos nucleicos
Detecção de sequencias de ácidos nucleicos.
Sondas de ácidos nucleicos ;
Amplificação de ácido desoxirribonucleico;
Técnicas de sequenciamento do ácido ribonucleico ribossômico;
Impressoes digitais PCR;
Amplificação de transcrição;
Pyrosequencig;
Ripoprinting;
Mapeamento óptico.
MÉTODOS DE ENUMERAÇÃO MICROBIANA
AUTOMAÇÃO DE MÉTODOS
Melhorias para analise
Advento plaqueador em espiral automático.
Reduz uso de consumíveis
Sistemas modernos como o AutoPlate 4000 e o protoCOL 3
Bastante usado na indústria de agua e alimento.
Reduz as diluições necessarias
Sistemas de cultura como Petrifilm e Simplate
Substitui placas ágar sólido
Simplicidade no manuseio ocupa pouco espaço
MÉTODOS DE ENUMERAÇÃO MICROBIANA
MÉTODOS ELETROQUÍMICOS
Detecção automatizada, com geração de dados eletrônicos e mapeamento da variação de impedância permite reduzir a duração do teste para 48 horas
Além de eficácia de preservação e contagem viáveis de aeróbicos totais
MÉTODOS DE ENUMERAÇÃO MICROBIANA
MÉTODOS COM BASE NA BIOLUMINESCÊNCIA
Extrai o ATP das células microbianas e medir a luz gerada por um luminometro.
Sistemas AmPiScreen e PalChek
instrumentos simples e de custo relativamente baixo
Sistemas Miliflex
Usa um dispositivo de carga acoplados (CCD), seguindo a amplificação dos fótons por fibras ópticas do sistema e fornece uma representação gráfica.
X Desvantagem: Em níveis baixos de contaminação é necessário aumentar o número de microrganismos no Meio de cultura por 12 a 48h.
MÉTODOS DE ENUMERAÇÃO MICROBIANA
TÉCNICA DE EPIFLUORESCENCIA DIRETA
Detecção rápida dos mircrorganismos cuja sensibilidade absoluta depende do molume de produto filtrado e do número de campos examinados.
Citometria de fase sólida
Identificados com um fluoróforo antes ou após a filtração.
Sistema Chem Scan RDI
Citometria de fase sólida a laser
MÉTODOS DE ENUMERAÇÃO MICROBIANA
TÉCNICA DE EPIFLUORESCENCIA DIRETA
Citometria de fluxo
Materiais filtráveis e não filtráveis
Menos sensível que a citometria de fase sólida.
Sistema D-Count
Mesmo corante vital do Chem Scan
Sistema totalmente automatizado para alto fluxo de amostras 
X Desvantagem: Não permite a detecção de célula única
MÉTODOS DE ENUMERAÇÃO MICROBIANA
TÉCNICA BASEADA NA IMPEDÂNCIA
Resistencia ao fluxo de uma corrente alternada através de um material condutor.
Uma série de curvas-padrão deve ser construída com microrganismos adequados à amostra a ser testada.
Sistema Bactometer
Descontinuada
Sistema Bactrac e RABIT
Medem a alteração da impedância no decorrer do tempo.
MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO MICROBIANA
 SISTEMAS DE IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA
Ensaios bioquímicos
Precedidos por uma coloração de Gram ou outro de diferenciação.
Comparação do perfil de reação bioquímica
X Desvantagens: Necessidade de uma colônia recente; Interpretação dos resultados pode ser subjetiva; A rapidez no resultado pode depender do sistema utilizado.
Galeria API
Rapidez e facilidade
Obtida pela referencia a uma lista que relaciona espécies isoladas com um único identificador.
Sistema Vitek
Mais sofisticado e automatizado que o API
Diferentes cartões de identificação para tipos particulares de microrganismos
MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO MICROBIANA
 SISTEMAS DE IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA
Ensaios bioquímicos
Sistema OminiLog ID
Sistema integrado contendo incubador e analisador. 
Consiste em leitor de placa capaz de analisar quantidades maiores que 50 amostras por ciclo.
MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO MICROBIANA
 SISTEMAS DE IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA
Métodos imunológicos
fenômenos de aglutinação
Perfis de ácido graxo 
estável e bem conservada, elevado grau de homoneidade dentro de diferentes grupos taxonômicos.
Sistema Sherlock
Identifica bactérias, tendo por base seu perfil único de ácidos graxos, em vez de substratos
MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO MICROBIANA
 SISTEMAS DE IDENTIFICAÇÃO GENOTÍPICA
Não dependem de variações das condições de crescimento da célula
Impressão digital genética
Caracteriza e identifica os microrganismos, utilizando fragmentos de restrição de ácidos nucleicos de genomas de bactérias e fungos.
Sistema Gene- Trak screening kit
Usa sondas para detectar o RNAr do microrganismo
Sistema Bax screening kit
Combina amplificação do DNA por PCR com detecção homogênea, para mostrar presença/ausência de microrganismos específicos
MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO MICROBIANA
 SISTEMAS DE IDENTIFICAÇÃO GENOTÍPICA
Impressão digital genética
Sistema de identificação Micro Seq
baseados na sequência de DNA dos genes RNA ribossomal, conduzindo identificação acurada e reprodutível.
Sistema de caracterização Riboprinter
Processo automatizado, inicia-se com a lise das células e corte do DNA, liberando em fragmentos via enzima de restrição
Fragmentos separados por tamanho