biomol 9 Metodos Biologia Molecular 2 2016

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Universidade de Brasília 
Métodos em Biologia 
Molecular 
aula 9 
Prof. Georgios Pappas Jr 
O DNA É O MATERIAL 
GENÉTICO!
Experimento de Hershey and Chase
bacteriófago T2 
•  Para tentar desvendar qual 
molécula era o material genético 
Alfred Hershey e Martha Chase 
criaram em 1952 o experimento 
que foi definitivo para esta questão 
•  Eles utilizaram o bacteriófago T2, 
que possuem apenas dois tipos de 
polímeros: o DNA e proteínas 
•  O DNA possui um átomo que não 
ocorre em proteínas, o fósforo 
•  Proteínas podem possuir um átomo 
ausente no DNA, o enxofre 
Hershey and Chase
•  Criaram duas amostras utilizando radiotividade: 
•  Células crescidas com 32P incorporam este isótopo no DNA 
•  Células crescidas com 35S incorporam este isótopo nas proteínas 
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COMO VISUALIZAMOS DNA NO 
LABORATÓRIO?
Eletroforese 
•  Separação de biomoléculas baseado no 
tamanho e carga 
Eletroforese em gel
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•  Separação de biomoléculas baseado no 
tamanho e carga 
•  Ao invés de uma solução, a separação é feita 
em um meio sólido criado por polímeros que 
formam um gel, como: 
–  Agarose 
–  Poliacrilamida 
Eletroforese em gel Agarose
Agarobiose é um dissacarídeo 
composto por D-galactose e 
3,6-anidro-L-galactopiranose 
•  Polímero utilizado como matriz para eletroforese 
Gel de agarose Eletroforese em gel de agarose
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•  Separação de biomoléculas baseado no 
tamanho e carga 
•  O gel é um polímero: 
–  Agarose 
•  Para fragmentos maiores de DNA ou RNA (>centenas 
de bases) 
–  Poliacrilamida 
•  Para proteínas 
•  Para fragmentos pequenos de DNA (centenas de 
bases) 
Eletroforese em gel
Dependendo da natureza do gel temos o 
ajuste fino de separação de moléculas de 
DNA 
Polyacrilamida 
 
Agarose 
 
Pulse-field 
relaxed supercoiled
Grandes moléculas de DNA são 
superenoveladas
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Efeito das topoisomerases no 
superenrolamento
Eletroforese de um plamídeo 
Efeito das topoisomerases no 
superenrolamento
Eletroforese de um plamídeo 
5 Min 30 Min 
Tratamento com Topoisomerase 
Efeito das topoisomerases no 
superenrolamento
Eletroforese de um plamídeo 
5 Min 30 Min 
Tratamento com Topoisomerase 
ENZIMAS QUE DEGRADAM 
ÁCIDOS NUCLÉICOS
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Fig. 1. Agarose gel electrophoresis of differentially fragmented calf thymus DNA (0.4 µg/lane). Fragmentation was simulated (i) by partial 
digestion of DNA with DNase for 0.25, 0.75, 2, 5, 10, 30, 60, and 180 min and 10 min with 5000× higher DNase concentration (lanes 2–9 and 10, 
respectively) and (ii) by DNA sonication for 10, 15, and 80 s (lanes 11–13, respectively). Lane 1 shows 1.5 µg of the DNA size markers 0.125 to 
23.1 and 0.05 to 1.0 kb mixed in 1:1 (w/w) 
Christos D. Georgiou , Ioannis Papapostolou 
Assay for the quantification of intact/fragmented genomic DNA 
Analytical Biochemistry Volume 358, Issue 2 2006 247 - 256 http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2006.07.035 
Tratamento com Dnase ao longo do tempo 
Sonicação do DNA 
ao longo do tempo 
APLICAÇÕES DAS ENZIMAS DE 
RESTRIÇÃO
As enzimas de restrição são 
verdadeiras tesouras moleculares
•  As enzimas de restrição são 
endonucleases que reconhecem 
sequências específicas no DNA 
–  Requerem Mg2+ 
•  Mn2+,Fe2+,Co2+,Ni2+, mas não Ca2+ 
•  São enzimas bacterianas 
–  Milhares já foram isoladas de diferentes 
espécies 
•  A engenharia genética tornou-se 
possível graças a estas enzimas 
•  Os sítios de reconhecimento são 
sequências palindrômicas 
Cleavage of EcoRI site 
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Mapa de restrição
Mapa de restrição
•  O DNA é digerido com enzimas de restrição 
com diferentes combinações de enzimas 
•  Os fragmentos são submetidos a eletroforese 
Mapas de restrição 
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•  O DNA é digerido com enzimas de restrição 
com diferentes combinações de enzimas 
•  Os fragmentos são submetidos a eletroforese 
Mapas de restrição 
Aplicações das enzimas de restrição
•  Clonagem molecular 
•  Isolamento de genes 
•  Tipagem molecular 
–  DNA fingerprinting 
Figure 8-39 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Clonagem molecular Plasmídeos
São pequenas moléculas de DNA circular, geralmente presentes em bactérias, 
e são idenpendentes e tem a capacidade de se replicar autonomamente em relação 
ao DNA cromossômico 
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Plasmídeos
Enzimas de restrição conseguem linearizar os plamídeos 
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Figure 8.3 Cleavage of DNA by the restriction enzyme EcoRI. EcoRI makes staggered, symmetrical 
cuts in DNA, leaving “sticky” ends. A DNA fragment with a sticky end produced by EcoRI digestion 
can bind by complementary base pairing (anneal) to any other DNA fragment with a sticky end 
produced by EcoRI cleavage. The gaps can then be sealed by DNA ligase. 
 
Criando moléculas hibridas
DNA Ligase 
•  Tem ação 
contrária às 
nucleases 
•  Forma ligações 
fosfodiéster entre 
extremidades 3’-
OH e 5’-P 
•  Requer fita dupla 
de DNA 
OH P 
O 
-O O 
O- 
O P 
O 
O 
O- 
DNA Ligase + 
(ATP or NAD+) 
AMP + PPi 
Clonagem de DNA: DNA recombinante
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APLICAÇÕES DAS ENZIMAS DE 
RESTRIÇÃO
Diferenças genéticas 
Diferenças genéticas
•  Mutações em sítios de restrição entre indíviduos 
diferentes resultam em clivagem diferencial ou diferentes 
perfis de restrição 
•  Portanto, podem ser utilizados para identificação de 
variantes genéticas 
•  Mutações em sítios de restrição entre indíviduos diferentes resultam em clivagem 
diferencial ou diferentes perfis de restrição 
•  Portanto, podem ser utilizados para identificação de variantes genéticas 
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Detecção de mutações: anemia 
falciforme
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Tipagem molecular
Taq1 + Pst1 Taq1 + AvaII 
Diferentes combinações de enzimas permitem distinguir cepas 
de isolados clínicos de E. coli 
Strains of organisms that have 
different antigens and different 
virulence factors may also 
show different banding 
patterns. Below is an example 
of a DNA fingerprint that 
suggests the E. coli present in 
people who drank 
contaminated apple juice was 
also present in the apple juice 
DETECÇÃO DE FRAGMENTOS 
ESPECÍFICOS DE DNA
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Algumas perguntas
•  Suponha que 
tenhamos diversos 
isolados de 
bactérias e 
gostaríamos de 
saber se algumas 
deles possuem genes 
de resistência à 
antibióticos 
conhecidos 
Algumas perguntas
•  Identificar se um gene existe no genoma 
de um organismo 
•  Identificar se existem múltiplas cópias 
ou deleção de um gene no genoma do 
organismo 
Solução possível: hibridização de DNA 
Figure 8-36 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
•  Até meados de 1970 o DNA era a 
molécula mais difícil de ser analisada 
quimicamente, devido ao seu tamanho e 
estrutura regular 
•  Frequentemente em Biologia Molecular 
nos deparamos com a necessidade de 
verificar se existe uma sequência 
específica em uma amostra de DNA 
•  Uma técnica de muito sucesso foi 
desenvolvida em 1975 por Edwin 
Southern e foi denominada Southern 
Blot 
Southern blot
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J. Mol. Biol. (1975) 98, 503-517 
Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments 
Separated by Gel Electrophoresis 
"E,. 1~. SOUTHERN 
Medical Research Council Mammalian Genome Unit 
DeIaartment of Zoology 
University of Edinburgh 
West Mains Road, Edinburgh, Scotland 
(Received 3 March 1975, and in revised form 26 June 1975) 
This paper describes a method of transferring fragments of DNA from agarose 
gels to cellulose nitrate filters. The fragments can then be hybridized to radio- 
active RNA and hybridsdetected by radioautography or fluorography. The 
method is illustrated by analyses of restriction fragments complementary to 
ribosomal RNAs from Esoherichia coli and Xenopus lacvis, and from several 
mammals. 
1. I n troduc t i o n 
Since Smith and his colleagues (Smith & Wilcox, 1970; Kelly & Smith, 1970) showed 
that a restriction endonuclease from HaemoThilns influenzae makes double-stranded 
breaks at specific sequences in DNA, this enzyme and others with similar properties 
have been used increasingly for studying the structure of DNA. Fragments produced 
by the enzymes can be separated with high resolution by electrophoresis in agarose 
or polyacrylamide gels. For studies of sequences in the DNA that are transcribed into 
RNA, it would clearly be helpful to have a method of detecting fragments in the gel 
that are complementary to a given RNA. This can be done by slicing the gel, eluting 
the DNA and hybridizing to RNA either in solution, or after binding the DNA to 
filters. The method is time consuming and inevitably leads to some loss in the resolv- 
ing power of gel electrophoresis. This paper describes a method for transferring 
fragments of DNA from strips of agarose gel to strips of cellulose nitrate. After hybri- 
dization to radioactive RNA, the fragments in the DNA that contain transcribed 
sequences can be detected as sharp bands by radioautography or fluorography of the 
cellulose nitrate strip. The method has the advantages that it retains the high resolv- 
ing power of the gel, it is economical of RNA and cellulose nitrate filters, and several 
electrophoretograms can be hybridized in one day. The main disadvantage is that 
fragments of 500 nucleotide pairs or less give low yields of hybrid and such fragments 
will be under-represented or even missing from the analysis. 
2. Materials, M e t h o d s and Results 
(a) Restriction endonuclease~ 
EcoRI prepared according to the method of u (1971) was a gift of K. 
Murray. HaeIII prepared by a modification of the method of Roberts (unpublished 
data) was a gift of H. J. Cooke. 
503 
•  O Southern blot é realizado através dos 
seguintes passos: 
1.  Digestão do DNA com enzimas de 
restrição 
2.  Separação dos fragmentos em gel de 
agarose 
3.  Desnaturação do DNA em solução 
alcalina 
4.  Transferência dos fragmentos do gel para 
uma membrana de náilon (ou 
nitrocelulose) 
•  Tratar com radiação ultravioleta para ligar o DNA à 
membrana 
5.  Hibridização com sonda marcada com 32P 
6.  Detecção após autoradiografia 
Southern blot
Figure 8-38 (part 1 of 4) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Transferência para membrana
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Figure 8-38 (part 2 of 4) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Transferência para membrana
Figure 8-34b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Marcação radioativa de sondas
Figure 8-38 (part 4 of 4) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Hibridização e auto-radiografia
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