ESCHERICHIA COLI

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ESCHERICHIA COLI
Escherichia coli
A Eschericia coli, é uma bactéria bacilar Gram-negativa, da família das Enterobacteriaceae. São aeróbias e anaeróbias-facultativas. 
As E. coli possuem múltiplos flagelos dispostos em volta de sua célula e, fimbrias ou adesina, que permitem sua fixação no lúmen intestinal, impedindo que saiam do corpo através da urina ou fezes; onde promovem a fermentação dos açucares e em consequência a flatulência (gases).
A transmissão da bactéria E. coli pode ocorrer de várias maneiras, entre elas: consumo de água sem tratamento; carnes más cozidas em temperaturas inferiores a 71ºC; leites e queijos não pasteurizados; vegetais e legumes regados com água contaminada e não higienizados; banho em agua contaminada; etc.
Geralmente a E. coli não é patogênica, mas ocasionalmente pode gerar sintomas como: 
Infecção urinaria;
Gastrenterite: inflamação da mucosa do estomago e do intestino;
Apendicite;
Meningite;
Colecistite: infecção da vesícula biliar;
Peritonite: inflamação do peritônio;
Septicemia: infecção generalizada;
Seu diagnostico pode ser feito através da coleta de cultura de amostra dos líquidos infectados e observação microscópica; coproantigeno; meio de Macconkey; técnica de recombinação genética.
O tratamento é feito com uso de antibióticos e a alta ingestão de agua potável para ajudar na eliminação das bactérias e limpeza do organismo.
METODOLOGIA
Contagem direta
É a técnica mais utilizada na determinação do tamanho de uma população bacteriana, ela tem a vantagem de as células viáveis (vivas) poderem ser quantificadas, porem o tempo de incubação é longo, em geral 24h, para o aparecimento das colônias visíveis em placa. Esse tempo pode impedir o uso da técnica em áreas como controle da qualidade do leite pois não é possível manter o lote por um período longo. 
Esse método considera que cada colônia é originada do crescimento e da multiplicação de uma bactéria. Isso nem sempre é verdade, uma vez que as bactérias frequentemente crescem em cadeias, por isso as contagens em placas são feitas nas chamadas unidades formadoras de colônias (UFC).
Para a realização desse método, é essencial que somente um número limitado de colônias cresça em cada placa. Quando muitas colônias estão presentes, ocorre saturação impedindo o crescimento de algumas colônias e dificultando a contagem. Pela convenção do Food and Drug Administration, órgão norte-americano que controla alimentos e medicamentos, deve-se realizar a contagem em placas que contenham de 25 a 250 colônias.
Quando essa metodologia é empregada, deve-se utilizar o método da diluição seriada para garantir que o número de colônias na placa permaneça na faixa desejada.
Diluição seriada 
Exemplo: amostra de leite com 10 mil bactérias / mL. A inoculação de 1 mL dessa amostra em uma placa com meio de cultivo resultará no crescimento de 10 mil colônias e será impossível fazer a contagem. Mas se 1 mL de leite for transferidos para um turbo contendo 9 mL de água estéril (diluição), cada mL da amostra deste tubo conterá 1000 bactérias. Esse numero ainda é grande para fazer a contagem. Portanto, uma nova diluição seriada deverá ser realizada, transferindo 1 mL (com 1000 bactérias) para um novo tubo com 9mL de água estéril).; nesse ultimo tubo, cada mL conterá 100 bactérias, que quando inoculado deverá originar 100 colônias, que podem ser facilmente contadas.
Existem dois métodos para se realizar a contagem de bactérias em placa: método de espalhamento em placa e método pour plate.
Pour plate: No pour plate o inoculo pode ser realizado com um volume te 1 ml ou 0,1 mL da diluição bacteriana diretamente na placa de Petri. O meio de cultivo, mantido em banho-maria a 50 ºC para impedir a solidificação do ágar, é vertido sobre a amostra, que será misturada por agitação suave da placa. Após solidificação do ágar, a placa é incubada na temperatura de crescimento da bactéria. Nesse método o crescimento das colônias das bactérias ocorre dentro do meio de cultivo e na superfície do meio de cultivo. 
Spread plate: No spread plate o inoculo de 0,1 mL é adicionado a superfície do meio contendo ágar já solidificado. O inoculo é, então, espalhado uniformemente na superfície com a alça de Drigalski. Aqui as colônias irão crescer somente na superfície do meio e não entram em contato com o ágar fundido (liquido a 50 ºC).
Na contagem são selecionadas placas com quantidade de 15-150 colônias, em que apenas as colônias típicas dos coliformes totais (vermelho purpura com 0,5 mm ou mais de diâmetro, rodeadas por um halo avermelhado de precipitação de sais brilhantes) serão contabilizadas. Determina-se o número de UFC/g ou mL, multiplicando o numero de colônias típicas pelo inverso da diluição.
Método do NMP
O método clássico de contagem de coliformes totais, termotolerantes e ​E. coli ​em água e alimentos é o do Número Mais Provável (NMP), que inclui as seguintes etapas:
Teste presuntivo, em que três alíquotas de três diluições da amostra são inoculadas em uma série de três tubos de Caldo Lauril Sulfato (LST) por diluição. Após 24-48h de incubação a 35°C, é considerada suspeita (presuntiva) da presença de coliformes através da observação de crescimento com produção de gás a partir da lactose.
Para confirmação, uma alçada de cada tubo suspeito é transferida para tubos de Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB) e Caldo ​E. coli ​ (EC), meios seletivos que contém lactose. Considera-se confirmativa a presença de coliformes totais através da observação de crescimento com produção de gás no tubo de VB, após 24-48h de incubação a 35°C. Crescimentos com produção de gás no tubo de EC, após 24h de incubação a 45,5°C é considerada confirmativa presença de coliformes termotolerantes.
Os tubos de EC positivos para coliformes termotolerantes são suspeitos de presença de ​E coli. ​Para confirmação, uma alçada de cada tubo é estriada em Ágar Levine Eosina Azul de Metileno (L-EMB), meio seletivo diferencial para distinguir ​E. coli ​dos demais coliformes termotolerantes. Se houver desenvolvimento de colônias típicas de ​E. coli​ no L-EMB, duas dessas colônias são isoladas para as provas bioquímicas de indol, VM, VP e citrato (IMViC). São consideradas confirmadas as culturas com os perfis: ++-- (biotipo 1) ou -+-- (biotipo 2).
O cálculo usando Tabela NMP-1, retirada do ​Bacteriological Analytical Manual ​ (Blodgett,2006), apresenta os resultados de uma série de três tubos inoculados com alíquotas de 0,1-0,01 e 0,001g ou ml da amostra. Se as três diluições inoculadas conterem resultado positivo, o resultado é lido na linha da tabela correspondente à combinação de tubos obtida. Também é usado fórmulas para calcular resultados para diluições não decimais.
Método do substrato cromogênico
Para a determinação de coliformes totais e ​Escherichia coli ​em água, um método extremamente simples e prático é do substrato cromogênico e fluorogênico (COLILERT) AOAC 991.15. É uma técnica cultural baseada na adição de um meio de cultura definido e diferencial à amostra, em que o exato balanceamento entre todos os componentes garante a especificidade do resultado. O meio contém dois substratos para enzimas: 
ortonitrofenil-​B-​D-galactopiranosídeo (ONPG), substrato para a enzima ​B-​galactosidase dos coliformes cujo produto da reação é amarelo.
4-metilumbeliferil-​B​-D-glicoronídeo (MUG), substrato para a enzima ​B-​glicuronidase de ​E. coli​, cujo produto da reação é fluorescente sob luz UV. 
O ensaio pode ser feito de duas formas:
Presença/ausência em 100mL, adicionando-se o meio de cultura à100mL de amostra (o meio desidratado estéril é comercializado em ampolas, na quantidade necessária para 100 mL de amostra.
Número mais provável (NMP) em 100 mL, fracionando-se os 100 mL, em alíquotas de 10 mL.
Método de contagem em placas
Para a contagem de coliformes totais em alimentos, o ​Compendium (Kornacki & Johnson,2001) e o ​Standard Methods for the Examination of dairy products (​Davidson ​et al., ​2004) também recomendam o método de contagem direta emplacas de Ágar Vermelho Violeta bile (VRB). Esse método segue o mesmo princípio da contagem das enterobactérias, mas utiliza lactose em lugar de glicose, no VRB. Selecionar placas com 15-150 colônias e contar as colônias típicas de enterobactérias no VRBG: vermelho púrpura, com 0,5 mm ou mais em diâmetro, rodeadas por um halo avermelhado de precipitação de sais biliares. Em placas muito cheias as colônias são menores, não atingindo 0,5mm. Determinar-se o número de UFC/g ou mL multiplicando o número de colônias típicas pelo inverso da diluição.
Outros métodos
Outros métodos oficializados pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists) São os “KITs” analíticos como Petrifilm Coliform Count Plate, Petrifilm ​E. coli ​Count Plate, Colitrak Plus e outros.
ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO
O processo de esterilização ocorre com o aquecimento dos artigos por irradiação do calor das paredes e da base da estufa, com consequente destruição dos microrganismos por um processo de oxidação das células, após a desidratação do núcleo.
Por não ser penetrante como o calor úmido, requer o uso de temperaturas muito elevadas e tempo de exposição muito prolongado, por isso só deve ser utilizado quando o contato com o vapor é inadequado.
Métodos de esterilização
Flambagem: aquecimento do material na chama do bico de gás até o rubro (eliminação apenas das formas vegetativas de microrganismos);
Incineração: eficiente na destruição de matéria orgânica;
Raios infravermelhos: emissão de radiação infravermelha que aquece a superfície a uma temperatura de 180°C;
Estufa: promove um aquecimento rápido e uniforme na câmara, tornando o processo eficiente.
BIBLIOGRÁFIA
SILVA, Neusely da. Et al. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água. 4 ed. São Paulo – Livraria Varela, 2010.
HOSPITAL VIRTUAL BRASILEIRO. Esterilização por calor seco. Disponível em: https://blog.mettzer.com/fraude-academica-e-ilegal/ Acesso em: 21 de Agosto de 2018
UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
dEPARTAMENTO ACADÊMICO DE ALIMENTOS 
TECNOLOGIA EM ALIMENTOS
ESCHERICHIA COLI 
METODOLOGIA DE ANÁLISE DO MICRORGANISMO
CALOR SECO
MEDIANEIRA – PR
01/ 10/ 2018