artigo trabalho michele enzimas

Prévia do material em texto

DETERMINAÇÃO DAS ENZIMAS: FOSFATASE ALCALINA E 
Y-GLUTAMIL TRANSFERASE
A. A. Couto, B. C. Araújo, D. R Salau, J. J. G. Francelino, M. S. N. Souza, V. C. Fragnani, **E. P. Farias. 
*Acadêmicos do curso de farmácia, Curitiba-PR, Brasil
** Profª orientadora, Curitiba-PR, Brasil
e-mail: michelli.snsuza@hotmail.com
	XXV Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica – CBEB 2014
	2
	[IFMBE PROCEEDINGS]
	
Resumo: A determinação de enzimas em laboratório clínico é importante, pois auxilia no tratamento de inúmeras doenças. Observar as dosagens auxilia na definição de diagnósticos, prognósticos, acompanha-mento, determinar grau da lesão e auxiliar na cura dessa patologia. Em forma de pesquisa bibliográfica, esse artigo descreve brevemente como deve ser feita uma determinação laboratorial das enzimas fosfatase alcalina, e y- glutamil transferase. 
Palavras-chave: Enzima, fosfatase alcalina, y-glutamil transferase. 
Abstract: The determination of enzymes in clinical laboratory is important as it assists in the treatment of numerous diseases. Observing the dosages helps in the definition of diagnoses, prognosis, follow-up, determine degree of the lesion and assist in the cure of this pathology. In the form of a literature search, this article briefly describes how a laboratory determination of the enzymes alkaline phosphatase, and γ-glutamyl transferase should be made. Keywords: Enzyme, alkaline phosphatase, γ-glutamyl transferase.
INTRODUÇÃO
A maior parte das reações químicas do nosso organismo são catalisadas por enzimas. As ações das enzimas consistem em associar-se a um substrato e formar um produto, depois ela é liberada intacta para se juntar a outro substrato e repetir o processo [1]. Essa ação pode ser esquematizada da seguinte forma: 
 Enzima + substrato complexo E-S → produto + Enzima [1]
A maior parte das enzimas são proteínas, e suas atividades são medidas no plasma sanguíneo, tecidos ou eritrócitos. Suas atividades permanecem constantes em condições normais demonstrando o equilíbrio entre os processos. Alterações na atividade dessas enzimas ocorrem quando há lesão celular extensa, proliferação celular e aumento na renovação celular, aumento na síntese enzimática, obstrução de ductos [2]. 
Na tabela 1, temos a distribuição de algumas enzimas de importância diagnóstica, relacionando sua principal fonte e principais aplicações clínicas. 
Tabela 1
	Enzima
	Principais fontes
	Principais aplicações clínicas
	Amilase
	Glandulas salivares, pâncreas, e ovários
	Enfermidade pancreática
	Aminotransferases
	Fígado, músculo esquelético, coração, e rim, eritrócitos.
	Infarto do miocárdio, doenças do parênquima hepático, e doenças muscular. 
	Antígeno prostático específico
	próstata
	Carcinoma de próstata
	Creatina quinase
	Músculo esquelético, cérebro, coração, músculo liso.
	Infarto do miocárdio, enfermidades musculares. 
	lipase
	Pâncreas
	Enfermidade pancreática
	Fosfatase ácida
	Próstata e eritrócitos
	Carcinoma da próstata
	Fosfatase alcalina
	Fígado, ossos, mucosa intestinal, placenta, rim
	Doenças ósseas, enfermidades hepáticas
	Y – glutamil transferase
	Fígado e rim
	Enfermidade hepatobiliar, alcoolismo
Ref: Motta, V. T. Bioquiica clinica: princípios e interpretações. Belo Horizonte – MG, 1998.
A seguir iremos descrever como é determinada em laboratório as duas ultimas enzimas citadas na tabela 1: a enzima fosfatase alcalina (F.A.) e a Ɣ- glutamil transferase.
MATERIAIS E MÉTODOS
Para a realização desse artigo foi escolhido o método de pesquisa bibliográfica, onde foram pesquisados livros, artigos, trabalhos acadêmicos e bula de kit de teste para análise em laboratórios dessas duas enzimas em questão. Foram pesquisados arquivos entre os anos de 1998 a 2018 utilizando palavras: enzimas, fosfatase alcalina e Ɣ- glutamil transferase.
1. FOSFATASE ALCALINA (F.A.)
São enzimas inespecíficas, capazes de catalisar reações de transfosforilação e hidrolisar monoésteres de fosfato, pirofosfato, diésteres de fosfato. Ela é denominada alcalina por ser mais eficiente em pH acima do neutro. Ela está presente na mucosa intestinal, fígado, túbulos renais, baço, ossos e placenta [2]. 
FUNÇÃO
A Fosfatase alcalina hidrolisa em pH alcalino monoésteres de fosfato, diésteres de fosfato, pirofosfato, e catalisa reações de transfosforilação. Ela pode também hidrolisar o ATP (trifosfato de adenosina – responsável por armazenar energia) e liberar o fosfato inorgânico. Ela também tem a função de desfosforilação, ou seja, de remover grupos fosfatos de outras moléculas, podendo ser nucleotídeos, proteínas ou alcalóides [3]. 
ATIVIDADE DE ENZIMA
A alteração da atividade da enzima F.A. pode estar relacionada a doenças do fígado e dos ossos e sua determinação laboratorial é importante para mensurar e diagnosticar de forma correta a doença. Quando a enzima tem uma: 
Atividade elevada: pode estar relacionada a cirrose, obstrução intra ou extra-hepática (obstrução parcial ou total do colédoco), doença de paget, hiperparatire-oidismo, osteomalácia, carcinoma osteo-blástico com metástase, tumores primários ou metastático do fígado ou no osso, recuperação de fraturas ósseas, e também na fase de crescimento normal dos ossos. 
Atividades menores: pode estar ligadas a tumores hepáticos, hepatites, drogas hepatotóxicas, hipotireoidismo, hipofosfatemia, desnutrição, doença celíaca, fraturas ósseas, osteomalácia e raquitismo.
O aumento da atividade enzimática ainda pode ser observado no terceiro trimestre de gravidez e podem indicar complicações na gravidez como hipertensão ou pré-eclampsia [2]. 
INTERESSE CLÍNICO
Determinar os níveis da enzima F.A. em laboratório é importante para diagnosticar principalmente, doenças do fígado e dos ossos [1]. 
MÉTODO DE DETERMINAÇÃO
Segundo Motta (2009), tem 4 formas de se determinar a atividade da enzima fosfatase alcalina. Antes de decidir qual dos métodos irá utilizar, deverá ser colhida uma amostra do paciente, em jejum de 8 horas. Essa amostra é um soro ou plasma heparinizado e deve ser levado para ensaio de determinação logo após coleta, pois a fosfatase aumenta de 3 a 10 % a 25ºC. 
O substrato natural da enzima fosfatase alcalina é desconhecido, por esse motivo se utiliza várias substâncias que substituem na avaliação da atividade desta enzima. As 4 formas de se determinar a atividade da enzima é através dessas substancias, ou seja, de 4 diferentes substratos:
B-glicerofosfato: método que acabou sendo abandonado pela pouca sensibilidade e prolongado período de incubação. Eles quantificavam a liberação do fosfato inorgânico do substrato b- glicerolfosfato após a ação da enzima presente na amostra. 
P–nitrofenilfosfato: mede a quantidade de fenol liberado após a incubação com o soro.
4-nitrofenilfosfato: avalia a fosfatase alcalina, medindo o produto liberado após a hidrolise. É o mais utilizado atualmente.
a-naftol monofosfato: mede a velocidade de formação de a-naftol a 340nm após incubação. 
Além desses métodos com substratos temos também o método de Roy lmod, com substrato de timolftaleína monofosfato, onde a absorbância é medida fotometricamente.
AMOSTRAGEM
São retiradas amostras biológicas, ou seja, sangue, soro ou plasma colhido com heparina [1]. 
CONDIÇÕES DE ANÁLISES E MÉTODOS DE ANÁLISES:
Existem inúmeros métodos de análises, os conhecidos kit para análise laboratorial, a seguir, citaremos dois desses métodos e seus procedimentos: 
Método cinético-colorimétrico, segundo laboratório Analisa [4]: 
- reagentes:
Tampão pH 10,4 acetato de magnésio 2,5 mmol/L, sulfato de zinco 1,2 mmol/L, HEDTA 2,5 mmol/L e azida sódica 8 mmol/L.
Substrato: Contém p-nitrofenilfosfato 60 mmol/L e fenol 50 mmol/L.
- materiais: espectrofotômetro com cubeta termostatizada (leitura em 405 nm), pipetas, tubos, e cronômetro. 
- amostra: soro ou plasma (heparina).
- condições de reação: leitura (comprimento de onda 405 nm), temperaturade 37º C e reação cinética contínua crescente. 
- preparo:
1. Misturar suavemente o R 1 (tampão) e R 2(substrato) na seguinte proporção: 4 volumes de tampão (1) mais 1 volume de substrato (2). Permanece estável por 30 dias entre 2 a 8ºC. 
2. Analisar com ou sem calibrador observando a linearidade do método. Calcular o aumento médio de absorbância por minuto do calibrador e do teste. 
- desempenho: 
Linearidade: é linear até 1500 U/L. 
- Cálculo para achar a linearidade:
At = absorbância do teste
Ap = absorbância do Padrão
Cp = Concent. do Padrão = 45 U/L
 FC = fator de calibração
FC = Cp ÷ Ap
Ct = FC x At
- Valor de referência:
Soro ou plasma
Adultos: 13 a 42 U/L
Crianças até 2 anos: 56 a 156 U/L 
Método teste cinético-UV DGKC, segundo laboratório vida biotecnologia [5].
O que muda nesse método é a preparação dos reagentes.
R 1 – tampão (dietanolamina 1,0 nml/l; cloreto de magnésio 0,5 nmol/l; azida sódica 0,09% p/v).
R2 – substrato (4-nitrofenilfosfato 10 mmol/L; azida sódica 0,09% p/v.
- Preparo dos reagentes:
 1. Misturar 4 partes do R 1 a uma parte do R2. 
2. Homogeneizar suavemente. Fica estável por até 04 semanas em temperatura de 2 a 8ºC.
- amostra: 
1. Pipetar na cubeta 20 U/L de amostra e 1000 U/L de Reagente. 
2. pipetar o reagente, homogeneizar e imediatamente incubar a 37º C. 
3. Acionar o cronômetro. Após 1 minuto ler a absorbância inicial (A0). Efetuar novas leituras a cada 60 segundos, por 03 minutos. (A1, A2, A3).
-cálculo das absorvâncias:
∆ A/min = [ (A0 – A1) + (A1-A2) + (A2 – A3)] ÷ 3
- cálculo das atividades da enzima F.A. (FALC)
FALC (U/L) = ∆a/MIN X 2750
- Valores de referência:
Mulheres – 64 a 306 U/L
Homens – 80 a 306 U/L
Crianças até 15 anos – até 644 U/L
Jovens até 17 anos – até 483 U/L [5].
2. Ɣ- GLUTAMIL TRANSFERASE
É uma glicoproteína heterodimérica que catalisa a transferência de grupos gama-glutamil entre moléculas doadoras e moléculas receptoras. Está localizada em quase todas as células e tecidos humanos, na membrana celular, e em maior quantidade no fígado, dutos biliares, rins epidídimo, leucócitos e plaquetas. Ela se divide em duas frações: a fração hidrofílica (é a que promove a catálise) e uma fração hidrofóbica (pesada que ancora a enzima á membrana, pois essa parte da enzima não irá passar pela membrana, por não ser permeável) [6].
Ela pode ser chamada de enzima Ɣ-glutamil transferase, gama glutamiltransfe-rase, como gama glutamil transpeptidase [1].
 
FUNÇÃO
A Ɣ-glutamil transferase, como já sugere o nome, transfere aminoácidos e peptídios através da membrana celular, além de auxiliar na síntese protéica. Ela transfere um grupo Ɣ-glutamil de um peptídio para outro peptídio ou para um aminoácido [2]. 
2.2 ATIVIDADES DA ENZIMA
Os níveis das atividades enzimáticas das Ɣ-glutamil transferase podem alcançar 5 a 30 vezes o valor normal na obstrução intrahapatobiliar ou pós-hepatobiliar. A Ɣ-GT é mais concentrada no epitélio do canalículo e ducto biliar da zona periportal de um humano normal. O aumento concomitante das Ɣ-GT e fosfatases alcalinas pode indicar lesão no sistema hepatobiliar, ou seja, se a Ɣ-GT estiver alterada e a F.A também, o paciente apresenta uma doença hepática. Se a Ɣ-GT estiver normal e a P.A estiver alta, indica que o paciente apresenta uma doença óssea [1].
O maior índice de atividade dessa enzima é no rim, porém quando retira-se o soro ou plasma, a enzima contida no mesmo é principalmente de origem hepatobiliar [2].
Os valores da atividade desta enzima podem aparecer alterados nos casos de tumor hepático, mononucleose infecciosa, ingestão de álcool, recém nascidos, obesos, doenças hepáticas ativas, obstrução do trato biliar [1].
INTERESSE CLÍNICO
Segundo o laboratório GAMA GT [6], a Ɣ-glutamil transferase é indicadora de doenças inflamatórias, hepatobiliares, obstrutivas das vias biliares. A determinação dessa enzima auxilia diferenciar colestases mecânica e viral das induzidas por drogas, e indica, com segurança, metástases hepáticas em pacientes anictéricos com câncer. 
A determinação da Ɣ-GT também é utilizada em centros de tratamento de alcoólatras, pois os níveis dessa enzima é alterado quando há falta de álcool ou exposição ao mesmo. Com isso, profissionais que acompanham esses pacientes, podem fazer um feedback através dos indicies de Ɣ-GT, verificando se o tratamento está sendo eficaz ou não ao paciente[6]. 
A Ɣ-GT apresenta associação com diversas morbidades da síndrome metabólica, condição esta que é caracterizada por resistência à insulina, diabetes mellitus ou glicemia de jejum alterada, hipertensão, obesidade abdominal, dislipidemia, estado pró-inflamatório e pró-trombótico, fatores que predispõem a doenças cardiovasculares e aterosclerose. É considerada marcadora de lesão hepatobiliar de alta sensibilidade, apresenta relação com aumento do índice de massa corpórea [2].
Tratando com um pouco mais de detalhes, essas atividades nas situações clínicas, o mesmo autor destaca que, a enzima Ɣ-GT possui atividade aumenta de 5 a 30 vezes o valor de referência quando o paciente está com uma obstrução intra-hepática ou extra-hepática, ou seja, nas colestases do trato biliar. Neoplasmas primárias ou secundárias também apresentam atividade da Ɣ-GT elevadas, acima do valor de referência. Na esteatose hepática ou fígado gorduroso, hepatites medicamentosa, gestação, nutrição parenteral, corticoterapia, diabetes e nas desnutrições protéicas o aumento é um pouco menor. 
AMOSTRAGEM
Amostra utilizada para fazer análise da Ɣ-GT é o sangue, soro ou plasma colhido com heparina. anticoagulantes contendo citrato, fluoreto ou oxalato inibem a atividade da Ɣ-GT, e sua atividade é estável por 7 dias entre 2 a 8ºC e por vários meses a -10ºC [1].
CONDIÇÕES DE ANÁLISES E MÉTODOS DE ANÁLISES
Segundo o laboratório GAMA GT LIQUIFORM as condições de análises e métodos de análises são os seguintes:
- Produto utilizado: p-nitroanilina 500 mol/L e azida sódica 0,095%.
- Reagentes: R1, R2 e solução padrão.
- Preparo do Reagente de Trabalho: 
1. Utiliza-se 4 partes de reagente 1 para 1 única parte do reagente 2.
- equipamentos utilizados manualmente: fotômetro a 37 ºC, pipetas para medir amostras e reagentes e cronômetro.
Procedimento manual:
Método cinético contínuo:
- Condições de reação: comprimento de onda: 405; cubeta termostatizada a 37ºC, com 10mm de espessura de solução, banda de passagem de 2 nm e luz espúria 0,1%.
- Calibração:
1. Medir a absorbância do Padrão em triplicata, observando que a diferença entre elas não devem ser maior que 2%.
2. Colocar 0,5 ml de agua destilada, mais 1,0 ml de ácido acético 5% no tubo branco. E em uma parte da solução padrão, colocar 0,5 ml de água destilada, 0,05 ml de solução padrão, e mais 1,0 ml de ácido acético 5%.
3. Homogeneizar e determinar as absorbâncias das replicatas do Padrão em 405 nm acertando o zero com o branco. A cor é estável por 60 minutos. 
- Procedimentos para determinação dos níveis da enzima. 
Transferir 1,0 mL do Reagente de Trabalho para um tubo 12x75.
Adicionar 0,05 mL de amostra ao tubo e misturar. 
Transferir para a cubeta termostatizada a 37 ºC e esperar 1 minuto.
Fazer a leitura inicial disparando simultaneamente o cronômetro. Repetir as leituras após 1, 2 e 3 minutos.
Calcular a média das diferenças de absorbância por minuto (A/minuto) e utilizar para calcular o resultado.
Método cinético de tempo fixo: 
- calibrar da mesma forma do método citado anteriormente
- procedimento para determinação dos níveis da enzima
Tomar 2 tubos de ensaio: um branco e o outro teste
Acrescentar 0,5 de reagente de trabalho em cada um dos tubos
Incubar a 37º C durante 2 minutos, e sem removê-los do banho, acrescentar 0,025 ml de ácido acético somente no tubo teste.
Misturar e adicionar 0,025 ml de amostra no tubo branco. 
Misturar e determinar a absorbância do teste em 405 m ou filtro azul acertando o zero com o branco. A cor é estável por 60 minutos.- Valores de referências:
	
	Homens
	Mulheres
	Até 3 meses
	21 a 74 U/l
	21 a 74 U/l
	4 a 6 meses
	14 a 29 U/l
	14 a 29 U/l
	7 a 24 meses
	11 a 17 U/l
	11 a 17 U/l
	3 a 40 anos
	15 a 85 U/l
	05 a 55 U/l
	< 40 anos
	15 a 74 U/l
	10 a 75 U/l
CONCLUSÃO
A determinação de enzimas no laboratório clínico é importante para diagnostico, prognóstico e acompanha-mento de patologias, como as relacionadas ao sistema hepático, cardíaco, ósseos, musculares e pancreatite. Fazendo análise em laboratório você tem um auxilio na hora de estabelecer a causa, localização e grau de extensão da lesão e auxiliar na cura. Essas enzimas tem vários métodos que auxiliam a análise e determinação de seus valores em laboratório, a maioria desses testes vem em kits onde se torna mais fácil o calculo e resultado. Atualmente tem programas e maquinas que auxiliam e fazem com que esses testes se tornem cada vez mais eficiente e proporciona rapidez nos resultados. 
REFERÊNCIAS 
[1] LOPES, H. J. J. Enzimas no laboratório clínico: aplicações diagnósticas. Belo Horizonte – MG, 1998. 
[2] MOTTA, V. T. Bioquímica Clínica: Princípios e Interpretações. 5ª Ed. Medbook, 2009. 
[3] SIMÃO, A. M, S. Estudos das características cinéticas da fosfatase alcalina reconstituída em sistemas vesiculares. [tese- doutorado em química]. Universidade de São Paulo, 148p. 2008.
[4] Kit para determinação da fosfatase alcalina por metodologia cinética-colorimétrica – laboratório Analisa. Disponível em: http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7B059CBFB8-1486-48A3-8B8A-394677DA7393%7D_FOSFATASE_ALCALINA.PDF >> acesso em: 23/03/2018.
[5] Kit para a determinação da atividade da Fosfatase Alcalina – lab. Vida biotecnologia. Disponível em: http://www.vidabiotecnologia.com.br/novo_site/content/uploads/2015/08/FOSFATASE-ALCALINA.pdf >> acesso em: 23/03/2018. 
[6] Bula laboratório GAMA GT disponível em: https://labtest.com.br/wp-content/uploads/2016/09/GAMA_GT_Liquiform_POP.doc >> acesso em: 23/03/2018. 
[7] BULA BIOLÍDER. Disponível em: http://www.biolider.com.br/media/images/394.pdf >> acesso em: 20/03/18.