Transformação Bacteriana: Processo e Procedimento

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Transformação Bacteriana
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I. Introdução
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A transformação bacteriana é um processo pelo qual o DNA na forma livre, é incorporado por uma célula receptora, que pode passar a apresentar alterações genéticas. A descoberta da transformação genética em bactérias corresponde a um dos eventos marcantes na biologia, visto que levou aos experimentos que demonstraram ser o DNA o material genético.
	Na natureza, vários micro-organismos procariotos são naturalmente transformáveis, incluindo espécies de eubactérias, tanto Gram-positivas quanto Gram-negativas, e algumas espécies de Archaea. 
Quando uma célula bacteriana é capaz de captar uma molécula de DNA e ser transformada, esta é referida como competente. Este estado fisiológico especial é chamado de competência. A competência pode ocorrer naturalmente ou pode ser produzida através de diferentes técnicas, como tratamento químico e eletroporação. As técnicas que envolvem o tratamento químico das células bacterianas utilizam soluções como a de cloreto de cálcio e alterações da temperatura de incubação. Estes fatores combinados alteram a permeabilidade da parede celular, permitindo desta forma a entrada do DNA exógeno. 
�A quantidade de células transformadas 
por 1 micrograma de DNA é chamada eficiência de transformação. Normalmente em procedimentos de laboratório pouco DNA é utilizado (5 a 100 nanogramas), uma vez que quantidades superiores podem afetar negativamente o processo de transformação. Neste contexto, muitos plasmídeos servem como DNA livre para se transformar células de Escherichia coli, principalmente.
	Um exemplo é o plasmídeo pBluescript®, normalmente presente em várias cópias no citoplasma de E. coli específicas para o uso em biologia molecular. Este plasmídeo apresenta um tamanho de 3000 pares de bases, possui sítio de policlonagem, origem de replicação e um gene que confere à célula hospedeira (receptora) resistência a ampicilina.
A presença de genes que conferem resistência a antibióticos no plasmídeo torna possível o isolamento de bactérias transformantes ou recombinantes, utilizando meio seletivo com o antibiótico cujo plasmídeo apresente resistência. 
Nesta aula você terá oportunidade de realizar um procedimento de transformação rápida de colônias de E. coli com DNA plasmidial e avaliar a eficiência de trans formação.
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II. Objetivos
1. Demonstrar a ocorrência do processo de transformação em bactérias.
III. Material
Culturas bacterianas e plasmídeos: a bactéria Escherichia coli DH5( e o plasmídeo pBluescript®.
Meios e soluções: Meio LB sólido contendo Ampicilina 60 mg/mL (Amp) e caldo LB. Solução de cloreto de cálcio 50 mM estéril.
Equipamentos e Utensílios: Microtubos de 1,5 mL. Pipetas (0,1, 1 e 10 mL); alça de Drigalski; placas de Petri; alça de repicagem; Banho-Maria a 42oC e estufa a 37oC.
IV. Procedimento
1. Identifique os tubos estéreis de 1,5 mL. Um tubo será adicionado plasmídeo e outro não (+plasmídeo e – plasmídeo).
2. Use uma micropipeta com ponteiras estéreis para adicionar 0,25 mL de uma solução de cloreto de cálcio (50 mM), a cada tubo.
3. Coloque os tubos no gelo.
4. Use uma alça de inoculação previamente esterilizada para transferir uma ou no máximo duas grandes colônias da placa de Petri contendo E. coli DH5( para os tubos identificados como + plasmídeo e -plasmídeo. Cuidado para não remover ágar junto com a colônia, pois este pode inibir o processo de transformação.
5. Imediatamente ressuspenda as células nos tubos pipetando repetidamente com uma micropipeta. Não deve haver grupamentos de células visíveis.
6. Coloque os tubos no gelo.
7. Adicione 0,005 (g/(L do plasmídeo no tubo identificado como + plasmídeo, retorne o tubo para o gelo.
8. Os tubos devem permanecer incubados por 15 minutos.
9. Após 15 minutos de incubação no gelo, transfira os tubos para um banho Maria a 42oC e deixe por 90 segundos, e retorne-os para o gelo.
10. Adicione 0,25 mL de meio LB aos tubos e agite gentilmente. Deixe incubado a 37oC por 30 minutos.
11. Após o período de incubação faça o plaqueamento pelo método de Spread Plate (espalhamento), da seguinte forma:
	Meio
	Células transformadas
+ plasmídeo
	Células transformadas
- plasmídeo
	LB + ampicilina
	0,1 mL
	0,1 mL
	LB sem ampicilina
	0,1 mL
	0,1 mL
12. Incube por 24 horas a 37oC.
V. Referências Bibliográficas
MICKLOS, D. A., FREYER, G.A. A ciência do DNA. Porto Alegre. Artmed Editora, 2ª Ed. 2005, 575 p.
PELCZAR, M., CHAN, E.C.S., KRIEG, N.R. Microbiologia, Conceitos e Aplicações. São Paulo. Makron Books do Brasil, 1996, v.1. 524p.
TORTORA, G.J., FUNKE, B.R., CASE, C.L. Microbiologia. Porto Alegre. Artmed Editora, 6ª. Ed. 2005, 894p.
VI. Resultados
Nome:..............................................................................Nº matrícula.......................Turma........
1. Complete o quadro abaixo:
	Meio
	UFC/mL de células transformadas
(+ ) plasmídeo
	UFC/mL de células não transformadas
( - ) plasmídeo
	LB + ampicilina
	
	
	LB sem ampicilina
	
	
VII. Questões
1. Qual é a função do cloreto de cálcio no procedimento da transformação?
2. No experimento realizado, identifique quais foram os controles utilizados e a importância destes.
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