Técnicas Genéticas e Sequenciamento

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Técnicas Genéticas e Sequenciamento
Aluno: Márcio Antônio Panato Filho
Eletroforese:
 Técnica baseada na separação de partículas, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada. Consiste na migração de moléculas ionizadas, em solução, de acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares em campo elétrico. Essa migração de partículas ionizadas que pode ser feita em gel (agarose ou poliacrilamida) ou capilar. As moléculas com carga (-) migram para o polo (+) (ânodo) e moléculas com carga (+) migram para o polo (-) (cátodo).
-3 TIPOS: Gel de agarose, Gel de poliacrilamida, Capilar.
Eletroforese Capilar: Possui o mesmo princípio da eletroforese em gel, mas realizada dentro de um capilar. Há a migração das amostras do polo negativo para o positivo de acordo com seu tamanho e seu peso molecular, porém é mais sensível que a eletroforese em gel, uma vez que a leitura é realizada por um software que identifica o tamanho dos fragmentos.
Aplicações: Análise de DNA e proteínas, Análise de vacinas, Medicina forense, Proteínas Séricas, Lipoproteínas, Diagnostico de hemoglobinopatias 
PCR:
 Reação que possibilita a determinada região do genoma de qualquer organismo ser multiplicada milhões de vezes, ou seja, permite a análise específica de uma região do DNA, alvo do estudo a ser realizado. A alta sensibilidade do método de PCR, bem como sua especificidade, nos permite amplificar uma sequência-alvo mesmo a partir de amostras com baixo grau de pureza e de quantidades mínimas de DNA.
-5 Tipos: PCR (normal), PCR Multiplex, PCR Reverse Transcriptase, PCR Real Time, Real Time PCR Multiplex
PCR normal:
Etapas:
Extração do DNA: 
Coleta da amostra biológica (sangue, urina, etc.)
Preparação da amostra (rompimento das membranas, separação do material genético)
Nano-drop (análise da qualidade do material)
PCR:
Desnaturação: rompimento das membranas celulares (M. celular e carioteca). E as duplas ligações fazendo ficar 1 fita só.
Anelamento: Adição de primers que se ligam as suas sequencias complementares.
Extensão: Taq-polimerase sintetiza as novas fitas de DNA
Aplicações: Diagnostico de doenças infecciosas e genéticas, amplificações de genes para clonagem e expressão, a determinação para a variabilidade genéticas a sexagem dos embriões.
PCR Multiplex:
 Há vários primers dentro da mesma reação. Desenhando-se vários primers para regiões diferentes do gene, aumenta a sensibilidade do teste PCR. Realiza a PCR já com os diferentes primers na reação e formam mais bandas na eletroforese. É ideal quando há pouca amostra de DNA disponível, pois economiza na quantidade de reagentes, em tempo e dinheiro. Utilizam-se vários primers para diferentes loci ao mesmo tempo. Essa tecnica é utilizada para a investigação de paternidade, diagnóstico de doenças e identificação de transgênicos. Também é aplicada na medicina forense
PCR Reverse Transcriptase
É utilizada para detecção qualitativa da expressão gênica, através da síntese de uma fita complementar de DNA (cDNA) transcrita do RNA. Utiliza-se uma enzima transcriptase reversa: transformar RNA em DNA. Fazer um cDNA (DNA complementar) a partir do RNA, muito mais estável que a molécula de RNA. Essa técnica pode ser feita para qualquer tipo de RNA (vírus e diferentes tipos de RNA). Mas atentar para o tecido de extração do RNA: nem todos os tecidos expressam todos os genes. A p53 é expressa em todos os tecidos, mas a dopamina por exemplo é mais expressa no cérebro.
Real Time PCR
Permite a quantificação da reação, identificando a quantidade de replicons. Utiliza-se fluoroforos (marcadores fluorescentes - enquanto a PCR tradicional utiliza brometo de etídio) que se ligam ao DNA produzido ou sondas específicas, assim quanto maior a quantidade de moléculas de DNA, maior a fluorescência. Baseia-se na detecção e quantificação da fluorescência aderida ao DNA.
 Metodologias para quantificar o DNA através da PCR: 
1. Marcador SYBER Green: o marcador fluorescente se liga no meio da nova fita de DNA formada (após desnaturação, anelamento e extensão). A quantidade de fluorescência é captada através de laser dentro do equipamento. Custo mais baixo para múltiplas reações. Problema: menos específico que o TaqMan. Emite fluorescência para toda anelamento realizado 
2. TaqMan: desenha-se primers fluorescentes. A emissão da fluorescência ocorre após o primer se ligar na sequência de DNA. Mais caro (necessidade de sintetizar cada primer desenhado com fluorescência) e maior a especificidade (liga-se apenas aos genes desejados).
Real Time PCR Multiplex 
 Análise de polimorfismos de nucleotídeos únicos – SNPs. Leitura das fluorescências para cada tipo de primer desenhado, de acordo com os genes estudados. Quando emitir uma fluorescência: homozigoto (azul e vermelho) e quando emitir duas fluorescências: heterozigoto (verde). Sonda complementar à sequência normal marcada com corante fluorescente FAM ou VIC
RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism)
 O princípio dessa técnica é a variação nos comprimentos dos fragmentos gerados pelo tratamento do DNA com determinada enzima de restrição em virtude de um polimorfismo/mutação.
 Análise na eletroforese: amplifica-se um fragmento com a técnica de PCR e trata este gene com enzimas de restrição. Alterações no corte vão evidenciar mutações no gene (podem cortar o gene mutado ou cortar o gene normal). Na eletroforese, o quanto o segmento “corre” vai evidenciar a mutação no gene estudado. 
• Em genes normais, o corte vai formar fragmentos menores (em posições diferentes na corrida eletroforética). 
• Em genes mutados, o corte não vai ser realizado, formando um fragmento maior (mais superior na eletroforese).
 Análise de genótipo (AA, Aa e aa): de acordo com o corte da enzima de restrição no cromossomo, pois cada alelo se comporta de uma forma, sendo dominante ou recessivo. O gel de eletroforese mostra o número e o tamanho (quanto mais superior, maior o tamanho) dos fragmentos obtidos pelo uso da enzima de restrição. A soma dos tamanhos dos fragmentos é igual ao tamanho da molécula de DNA. Exemplo: se o alelo dominante apresenta 3 cortes, formando dois fragmentos na eletroforese o alelo recessivo não é cortado, ficando maior (mais superior) na eletroforese, então: 
• AA: presença de dois fragmentos menores na eletroforese (AA) 
• AB: presença de dois fragmentos menores (A) na eletroforese e um fragmento maior (B) 
• BB: presença de um fragmento maior na eletroforese (BB)
 Aplicações: Mapeamento do genoma, genotipagem, ciência forense, teste de paternidade, detecção de doenças hereditárias.
Sequenciamento de DNA (Sequenciamento genômico)
Extração de DNA de pacientes afetados e de pacientes controle e comparar as diferenças de sequência de DNA associadas com doenças. Exemplo - pessoas com doenças cardíacas: pacientes com a doença possuem prevalência da base C (62%) em relação a T (38%), enquanto pacientes controle possuem igual proporção de bases C e T. SNP: troca de um nucleotídeo de DNA por outro que leva a determinada doença.
Sequenciamento manual: Sequenciamento de Sanger:
 Realiza-se uma PCR (desnaturação, anelamento, extensão e eletroforese): o gel apresenta a sequência obtida a partir do tamanho dos fragmentos. A eletroforese é realizada em gel especial, com maior capacidade de separação de moléculas, já que se realiza a análise de pares de bases (moléculas muito pequenas): como gel de poliacrilamida. A sequência obtida é de acordo com o tamanho dos fragmentos das bases: do menor fragmento (que mais corre na eletroforese) para o maior. O sequenciamento de Sanger baseia-se no princípio em que, num dado momento da extensão (semelhante à PCR), uma pequena porcentagem de moléculas irá incorporar um ddNTP e neste caso a reação de alongamento da cadeia será automaticamente interrompida naquele sítio. A ddNTP impede a ligação do grupo fosfato com o nucleotídeo anterior pela inexistência do radical OH, assim aram as cadeias de DNA com marcadores radioisótopos.Uma vez terminadas as reações de extensão, cada fragmento recém-sintetizado é separado em gel desnaturante de poliacrilamida-ureia e a seguir auto radiografado. Como este tipo de gel tem alto poder de resolução, é possível então visualizar na autorradiografia cada um dos fragmentos sintetizados como uma banda específica. O sequenciamento é separação dos fragmentos. O sequenciamento é separação dos fragmentos. Cada um dos produtos das 4 reações, contendo uma pequena quantidade de um dos quatro ddNTPS, são aplicados no gel e realizada a eletroforese em poliacrilamida. Como a polimerização ocorre apenas no sentido 5’3’ (por conta da leitura dos ddNTPs ser realizada apenas na fita contínua), os fragmentos menores estarão em 5’ e os maiores na direção 3’. A leitura do gel de poliacrilamida resulta na sequência do Primer (5’3’): para se saber a sequência do DNA deve-se realizar a complementariedade da sequência do Primer (3’5’).
Sequenciamento Automático: 
 É utilizado em larga escala, pois a leitura do gel e o processamento de sequencias são realizadas através de computadores. A reação de sequenciamento é realizada através do método de Sanger (1979), do mesmo modo que no sequenciamento manual. Entretanto, no sequenciamento automático os nucleotídeos estão marcados com fluoro cromos ao invés de isótopos radioativos. Quatro diferentes fluoro cromos são empregados e uma vez excitados por um feche de laser emitem luz em diferentes comprimentos de onda e o sequenciamento é feito de forma automática. Ao invés da eletroforese em gel, realiza-se a eletroforese capilar, de acordo com a fluorescência emitida por cada nucleotídeo. O tamanho do pico na leitura indica a quantidade de vezes que o fragmento foi amplificado. A leitura ocorre de acordo com as cores indicadas, pela marcação dos nucleotídeos com fluoro cromos.
Manual X Automático
Manual: usa radioisótopos, leitura manual a partir do gel de poliacrilamida Automático: usa fluoro cromos, leitura automática a partir de eletroforese capilar. Maior precisão. O equipamento é mais caro. Não mexe com radiação.
Pirosequenciamento 
 O princípio é a incorporação de pirofosfato no nucleotídeo e a luciferase para emissão da fluorescência. Não se utilizam nucleotídeos marcados com fluorescência ou ddNTPs, mas a energia emitida pela ligação dos nucleotídeos faz a luciferase emitir fluorescência, que é lida automaticamente (picos no gráfico). Possui menor precisão que o sequenciamento de Sanger. O Pirofosfato é liberado no momento de ligação entre os nucleotídeos e é transformado em ATP pela enzima sulfurilase. O ATP é incorporado na luciferase, emitindo a fluorescência. A leitura do equipamento ocorre de acordo com a emissão de fluorescência pela luciferase.
FISH (Fluorescent in situ hybridization)
 A hibridização in situ fluorescência é a técnica utilizada para detectar a presença ou “ausência” de uma sequência de DNA específica em cromossomos através do uso de sondas. Essas sondas, acopladas diretamente a fluoroforos, a ativos de anticorpos ou biotinas, se ligam apenas nas regiões dos cromossomos que apresentam alto grau de complementariedade.
Etapas 
A partir de células fixadas em uma lâmina de microscopia 
Desnaturação: ação do calor ou álcalis 
Hibridização: formação de duplex (anelamento)à sonda + região alvo 
Inspeção ao microscópio
Aplicações: mapeamento genético, genômica comparativa, biologia evolutiva, análise de danos cromossômicos (para verificar translocações, alterações numéricas – aneuploidias, como trissomias e monossomias -, deleções e inserções), diagnóstico de doenças (diferentes tipos de câncer: tumores cerebrais e neurais, câncer de mama, câncer de pulmão, carcinoma de células renais, leucemias, mieloma, síndrome mielodisplásica, linfomas), pré-natal e pós-natal e pré-implantação genética.
Array-CGH
O arranjo genômico por hibridização comparativa é uma técnica de hibridização genômica comparativa de alto custo. Sua metodologia molecular écapaz de identificar alterações cromossômicas desbalanceadas (com perda ou ganho de material genético), por meio da análise geral (comparação com um material de controle sem alterações) de todo o genoma num único experimento. Suas vantagens são a distinção de regiões clinicamente significativas de todo o genoma; a detecção de deleções, microdeleções e amplificações gênicas, que podem não ser detectadas através do cariótipo com banda G; e a análise de todo o genoma num único experimento, sem a necessidade de cultura de células (apenas coleta de sangue).
Etapas:
A técnica A-CGH consiste da marcação de DNA genômico teste (paciente) por um fluoro cromo e a marcação do DNA genômico normal (controle) com outro fluoro cromo. 
Os DNAs são hibridizados em uma plataforma sólida de DNA sonda – “chip de DNA” 
O resultado desta marcação é analisado através de um software que identifica as regiões alteradas no genoma.
Aplicações: Detecção de deleções, microdeleções e amplificações gênicas que podem ser causa de: autismo, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor, convulsões (defeitos cardíacos), atraso de crescimento e de linguagem, malformações congênitas, genitália ambígua e síndromes genéticas.
Processo de Array-CGH 
DNA controle e DNA do paciente são marcados com corantes fluorescentes diferentes e aplicados ao microarray 
DNA controle e DNA do paciente são hibridizados com o microarray 
Os sinais fluorescentes são medidos pelo scanner microarray 
Os dados são analisados pelo software específico, gerando os resultados. O gráfico sobe quando há ganhos de material genético (verde) e o gráfico desce quando há perda de material genético (vermelho). Quando não há alteração, fica amarelo. Verificação de alterações cromossômicas não balanceadas (ganho ou perda) Ex: Síndrome de Wolf-Hirschhorn: deleção terminal de parte do braço curto do cromossomo 4: del(4p16.3), que pode ser verificada através de Array-CGH.