PCR Reação em Cadeia da Polimerase

Prévia do material em texto

PCR – REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 
Trata-se de uma técnica que permite criar milhares ou até mesmo bilhões de cópias de uma região específica do DNA in vitro, para que assim se possa analisar e utilizar de alguma maneira, seja na detecção de doenças, clonagem de DNA e analises forenses. Para realizar a PCR é necessário uma DNA polimerase termoestável (taq polimerase), uma substância tampão (MgCl2), dNTPs (nucleotídeos), cofatores e primers de DNA projetados especificamente para a região de interesse. Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações de temperatura, o que possibilita a produção de muitas cópias da região de interesse. Por exemplo, o DNA amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento, visualizado por eletroforese em gel ou clonado em plasmídeos para futuros experimentos.
TAQ POLIMERASE
A PCR precisa de uma enzima DNA polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes como molde. A DNA polimerase tipicamente utilizada é a Taq polimerase, originária de uma bactéria resistente ao calor chamada Thermus aquaticus. Essa DNA polimerase é bastante estável e mais ativa a 70 °C, temperatura em que a polimerase humana ou de Escherichia coli seriam disfuncionais, se tornando portanto ideais para a PCR. 
PRIMERS DE PCR
Como outras DNA polimerase, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando há um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA. Na técnica do PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada ou ampliada pelos primers que ele escolher. Os primers são pedaços curtos de DNA fita simples , geralmente por volta de 20 aminoácidos. Dois primers são usados para cada reação de PCR, sendo projetados de modo que englobem a região de interesse, ou seja, sequencias que o farão se ligar as fitas opostas do DNA molde, na extremidade das região a ser copiada. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases complementares. A Taq polimerase estendem o molde, copiando a região onde os primers estão. 
ETAPAS DO PCR 
A Taq polimerase, primers, amostra de DNA, dNTPs (nucleotídeos), tampão e cofatores de enzimas são reunidos em um tubo e levados a um aparelho chamado termociclador, para que possam passar por repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento, permitindo a síntese do DNA.
1° DESNATURAÇÃO DO DNA (96 °C) - Caracterizada pelo aumento da temperatura para que as pontes de hidrogênio se rompam, provocando abertura da dupla fita, formando duas fitas simples.
2° ANELAMENTO (55 °C – 65 °C) – A reação é resfriada para que os primers se liguem as sequencias complementares do DNA molde de fita simples.
3° EXTENSÃO (72 °C) – Eleva-se a temperatura novamente para que as Taq polimerase estendam os primers, sintetizando novas fitas de DNA.
Esse ciclo se repete 25 -35 vezes em uma reação típica de PCR, o que demora cerce de 2 – 4 horas, dependendo do comprimento da região a ser copiada. Se a reação funcionar, pode se gerar bilhões de cópias. Isso porque não apenas o DNA original é utilizado como molde a cada ciclo. As novas fitas que estão sendo criados também podem ser usados. Existem muitas cópias de primers e Taq polimerase flutuando pela reação, portanto dobrando o número de moléculas de DNA a cada rodada.
Por exemplo: 1 amostra de DNA formará 2 cópias no primeiro ciclo, 4 cópias no segundo ciclo, 8 cópias no terceiro ciclo e sucessivamente.
ELETROFORESE EM GEL 
Os resultados de uma reação de PCR são geralmente visualizados com o uso de eletroforese em gel, uma técnica onde os fragmentos de DNA localizados em uma matriz de gel são puxados por uma corrente elétrica, que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho. Um padrão ou escada de DNA é tipicamente usado nos fragmentos das amostras para que seu tamanho possa ser determinado.
Quando os fragmentos de DNA são do mesmo tamanho, eles formam uma banda no gel, que pode ser visto a olho nu se o gel for pigmentado com corante (azul de Bromofenol) que se liga ao DNA. Uma banda de DNA contem muitas copias da região de interesse, uma vez que o DNA é microscópio e não seria possível sua visualização a olho nu. O PCR funciona justamente na produção dessas milhares de cópias, para que se possa ver e manipular. O gel é feito com Agarose (polissacarídeo extraído de uma alga marinha) e TBE (Tris-borato-EDTA) levados ao micro-ondas por 5 minutos.
O USO DA PCR
A PCR é muito usada em laboratórios de pesquisa e também tem aplicações em ciências forenses, testes genéticos e diagnósticos. Por exemplo, na amplificação de genes associados a desordens genéticas a partir de DNA de pacientes (ou DNA fetal no caso de teste pré-natal). A PCR pode ser utilizada para detectar presença de DNA bacteriano ou viral no corpo do paciente, sendo possível amplificar regiões do DNA a partir de amostra de sangue.
FORENSE
A ciência forense consiste na aplicação de procedimentos científicos para ajudar a resolver assuntos de cunho legal. Na cena de qualquer crime, uma série de provas físicas pode ser deixada, vinculando um criminoso a um crime ou ajudando a reconstruir a sequência de eventos que ocorreram. Em investigações criminais, alguns fios de cabelo, células da pele, sangue ou outros fluidos corporais podem ser deixados no local e o DNA recolhido a partir dessas amostras tem a capacidade de indicar uma solução ao crime.
IMPRESSÃO DIGITAL GENÉTICA
Assim como os indivíduos tem características únicas que o difere dos demais como estatura, cor dos olhos e cabelo, o DNA também possui uma característica única e permite distinguir um indivíduo de outros com muito mais precisão e menores chances de erro. Cada indivíduo é geneticamente diferente de todos os outros, constituindo uma verdadeira “impressão digital genética”, por isso a análise do perfil de DNA é tão importante para os cientistas forenses, uma vez que a possibilidade de se encontrar duas pessoas iguais por esse método é de uma em 10 trilhões.
AS VANTAGENS DA TÉCNICA DE PCR
Muitas vezes a quantidade de DNA disponível para análise é limitado, com a técnica de PCR, o menor vestígio de DNA encontrado pode ser amplificado, aumentando a quantidade de material e proporcionando o suficiente traçar o perfil genético e assim garantir a análise.
A PCR ou Reação em Cadeia da Polimerase é uma técnica utilizada diariamente nos laboratórios e possibilita a amplificação de um dado fragmento da amostra de DNA inicial de forma exponencial. Graças ela, um teste genético pode ser iniciado a partir de uma única célula, pois o DNA será́ multiplicado in vitro em quantidade suficiente para ser detectado no teste. Assim, pequenas quantidades de amostras recolhidas a partir de uma cena de crime podem ser comparadas com o DNA de outras pessoas, identificando ou descartando suspeitos durante uma investigação.   A PCR também pode ser usada no teste de paternidade, em que existe uma comparação entre os indivíduos, confirmando ou descartando seu parentesco, identificando os pais biológicos da criança.
PRÁTICA FORENSE
Antes de se identificar o perfil genético é realizada a extração do DNA da amostra e só então empregada a técnica de PCR para amplificar o material.
MATERIAL GENÉTICO PARA A ANÁLISE DE DNA
O DNA pode ser encontrado em todas as células vivas do nosso corpo.
Sangue – embora a maioria das células vermelhas não contenha, também é formado por células brancas que contém DNA e pode ser obtido mesmo de pequenas amostras.
Cabelo – principalmente na raiz, pois o comprimento pode até ser utilizado para alguns processos de tipagem, mas não outros.
Saliva – a saliva tem células da boca, então qualquer traço de saliva permite a identificação do DNA.
Pele – tocar um objeto pode deixar células suficientes para a tipagem de DNA.
Osso – normalmente utilizados para identificação de corpos, que podem ter até décadas.
Existem também outras amostras de onde é possível extrair o DNA como urina, fezes, dentes, sêmen e outros fluidos corporais.
A EXTRAÇÃO DO DNA
A impressão digitalgenética do DNA (ácido desoxirribonucleico), representada pelo material genético básico de cada indivíduo é composta de uma substância existente nos cromossomas, constituída de uma extensa fita dupla de nucleotídeos com as bases de adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C).
A extração do DNA, em termos simples, é a remoção de ácido desoxirribonucleico a partir das células da amostra, usado muitas vezes como um passo inicial em diversos processos.
Como acontece a extração:
Quebra da célula (lise) para expor o seu DNA, conseguido geralmente através da mistura ou trituração da célula.
O próximo passo envolve quebrar e emulsionar a gordura e as proteínas que formam a membrana da célula, processo realizado através da adição de soluções de sais e detergentes.
O DNA é separado a partir da solução líquida por meio da adição de um álcool e da centrifugação
Após todo esse processo o DNA está pronto para ser utilizado na próxima etapa, a PCR.
PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) NA ANÁLISE FORENSE
A quantidade de provas de DNA obtidas durante a investigação de um crime é frequentemente muito pequena. A PCR é uma técnica que permite à amplificação exponencial de DNA para cerca de 10.000 pares de bases, ou seja, uma única cópia de um fragmento de DNA pode ser amplificada para milhões de cópias em apenas algumas horas. A PCR é especialmente benéfica na amplificação de quantidades pequenas ou amostras degradadas.
O ciclo de PCR consiste em três etapas principais: desnaturação (separação da dupla fita de DNA), emparelhamento (iniciadores determinam a região a ser copiada) e extensão (conhecida como alongamento, a enzima Taq polimerase complementa a fita, formando novamente uma dupla fita).
ELETROFORESE Os fragmentos de DNA resultantes são então processados ​​usando eletroforese. A separação e detecção destes fragmentos resulta em um padrão único de bandas, a impressão digital genética. Este padrão é usado em investigações criminais para comparar o DNA do suspeito com DNA encontrado no local do crime.
COMO SE FAZ O TESTE DE DNA?
Você sabe que o DNA é composto de uma sequência de quatro nucleotídeos diferentes, certo? Estes nucleotídeos se diferenciam uns dos outros pelas suas bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina e guanina).
A sequência de bases nitrogenadas do DNA de um ser humano e de outro qualquer em uma população é muito semelhante – há apenas 0,1% de diferença. E, entre pais e filhos, essa diferença é ainda menor.  Mas, existem alguns trechos específicos que podem variar bastante de pessoa para pessoa.
Assim, para analisar o parentesco de duas pessoas ou à similaridade entre duas amostras, a técnica utilizada será a DNA fingerprint ou impressão digital do DNA, que fornece um alto grau de confiabilidade (99,99% de certeza). Para realizar este procedimento, primeiramente o DNA deverá ser extraído das células da amostra.
Em seguida, o DNA será tratado com enzimas de restrição. Estas enzimas de restrição se ligam a determinadas sequências específicas de DNA e quebram o DNA em pedacinhos. Logo após, a amostra de DNA é colocada na extremidade de um gel e submetida a uma corrente elétrica (eletroforese).  Figura 3: Cientista colocando amostras de DNA em um aparelho de eletroforese. A corrente elétrica e o gel separam os pedaços de DNA formando bandas.
Os pedacinhos de DNA são então atraídos para a outra extremidade do gel. Porém, as moléculas do próprio gel dificultam a passagem dos pedaços de DNA. Sendo assim, os fragmentos maiores migram mais lentamente que os menores. No fim do processo há a formação de um conjunto de “bandas” semelhante a um código de barras.
Este processo é chamado de separação em gel por eletroforese. Pense no seguinte: você é produto da união de um espermatozoide de seu pai com o óvulo da sua mãe.
Portanto, 50% do seu DNA é semelhante ao da sua mãe e 50% ao do seu pai. Assim, quando o seu DNA e dos seus pais forem submetidos às mesmas enzimas de restrição, elas agirão em pontos semelhantes no seu DNA e de seus pais.
Assim, após colocar as três amostras em um gel e fazer a eletroforese, o seu DNA terá algumas bandas coincidentes com o DNA do seu pai e outras semelhantes ao DNA de sua mãe. Caso não haja coincidência entre as bandas, não se comprova a paternidade. Para que você possa entender melhor, observe a imagem a seguir:
 
EXERCÍCIOS
01 – (UFES/2013)   A impressão digital do DNA é rotineiramente usada na determinação de paternidade. A técnica consiste em extrair o DNA dos glóbulos brancos do sangue coletado da mãe, da criança e do(s) suposto(s) pai(s). O DNA de cada indivíduo é tratado com a mesma enzima de restrição, e os fragmentos obtidos são separados, formando-se, assim, o padrão de banda de cada indivíduo. 
Legenda: M – mãe; F – filho; SP1 – suposto pai 1; SP2 – suposto pai 2
a) No esquema de um gel mostrado ao lado, indique o pai biológico da criança. Justifique a sua indicação.
b) Cite uma aplicação da investigação do DNA na análise forense e uma na prática clínica.
c) A maioria das células eucarióticas é diploide; seus dois conjuntos de cromossomos podem ser dispostos em pares de homólogos. Por outro lado, as células eucarióticas haploides contêm um único conjunto de cromossomos. Na espécie humana, é possível encontrar tanto células diploides, como células haploides. Indique os tipos celulares que exemplificam o genoma haploide e diploide, respectivamente, na espécie humana.
02 – (FMTM MG/2004)     Dois homens, P-I e P-II, disputam a paternidade de uma criança C, filha da mulher M. Diante disso, foi pedido o exame de DNA dos envolvidos.
O resultado do teste revelou os seguintes padrões:
Acerca dos resultados obtidos foram feitas as seguintes afirmações:
I. P-II pode ser o pai da criança, pois há maior quantidade de faixas coincidentes com o padrão da criança;
II. as faixas de números 3, 9, 10, 14, e 17 correspondem ao DNA que a criança recebeu da mãe;
III. não é possível excluir a possibilidade de P-I ser o pai da criança.
Está correto o contido apenas em
a) I.
b) II.
c) I e II.
d) I e III.
e) II e III.
03 – (UFT/2013)   O exame de paternidade, esquematizado abaixo, é muito utilizado na medicina forense e baseia-se na identificação de trechos de DNA humano, que variam muito entre pessoas de uma população e são conhecidos como VNTR (número variável de repetições em sequência). Com base no resultado da figura abaixo, assinale a alternativa correta.
a) O marido é pai do filho 1.
b) O outro homem é pai do filho 2.
c) O marido é pai do filho 3.
d) O marido é pai do filhos 2 e 3.
e) O outro homem é pai dos filhos 1 e 3.
04 – (UFU MG/2010)   Dentre as aplicações atuais da genética molecular, temos os testes de identificação de pessoas por meio do DNA.Essa técnica, que pode ser usada para identificar suspeitos em investigações policiais, consiste em detectar e comparar sequências repetitivas ao longo de trechos da molécula de DNA, regiões conhecidas como VNTR (número variável de repetições em sequência).
A figura abaixo ilustra os padrões de VNTRs de quatro pessoas envolvidas (uma vítima (V) e 3 suspeitos (S1, S2 e S3) em uma investigação policial e de uma prova (P) coletada no local do crime:
Considerando as afirmações e a figura acima apresentada, responda:
a) A qual dos suspeitos (S1, S2 ou S3) pertence a prova (P)? Justifique a sua resposta.
b) Que tipo de material pode ser coletado e servir de prova em um caso como esse?
c) Por que os resultados desse tipo de análise têm alto grau de confiabilidade?
05 – (EFOA MG/2000)  Dessas regiões recebe o nome de marcador, uma vez que pode ser associada com algum fenótipo em particular. A presença do marcador no genoma de um indivíduo pode ser visualizada como uma banda. Dessa forma, podemos descobrir se um embrião poderá apresentar uma determinada característica ou doença genética pela análise de seus  marcadores. O esquema abaixo representa a análise de marcadores de DNA de quatro embriõeshumanos (I, II, III, e IV). Apenas a presença de duas bandas (A e B) é indicativo positivo para o indivíduo apresentar uma certa  disfunção muscular quando adulto. Detectou-se ainda que esses marcadores ocupam o mesmo loco.
Observe o padrão de bandas do DNA de cada embrião e responda:
a) Dentre os embriões analisados, quais NÃO deverão apresentar a disfunção muscular quando adultos?
b) Supondo que os quatro embriões sejam irmãos, qual é o padrão de bandas (I, II, III ou IV) mais provável para cada um de seus pais?
c) Qual é a probabilidade de um certo casal, formado por indivíduos tipo I e III, ter um descendente com essa disfunção muscular?
REPOSTAS
Gab 1:
a) O pai biológico da criança é o suposto pai 1 porque a criança herda cromossomos tanto da mãe quanto do pai, de forma tal que ela possa apresentar fragmentos de restrição derivados de cada parental.
b) Identificação de criminosos (análise forense); diagnóstico genético de doenças hereditárias (prática clínica).
c) Células diploides – todas as células somáticas, com exceção das hemácias; células haploides – gametas masculino e feminino.
 Gab 2: C
 Gab 3: E
 Gab 4: a) Suspeito = S3
Gab 5:
a) II, III e IV
b) um dos pais marcador para as duas bandas e o outro apresenta só para uma;
c) não há possibilidade visto que o indivíduo 3 não apresentou nenhum marcador