Determinação de ferro por espectrofotometria

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DETERMINAÇÃO DE FERRO NO SANGUE POR ESPECTROFOTOMETRIA
INTRODUÇÃO
O ferro é o metal mais conhecido e utilizado pela humanidade desde os tempos mais longínquos e remotos, sendo também o quarto elemento mais abundante na crosta terrestre. O ferro possui dois números de oxidação mais comuns, o Fe2+, conhecido antigamente como íon ferroso, no estado bivalente e o Fe3+, antes chamado de íon férrico, com estado de oxidação trivalente. Já quando se cita ferro total em análises refere-se a todo ferro presente em um único número de oxidação, no presente caso deste relatório o Fe2+.
O ferro (Fe) não é encontrado na natureza de forma isolada, mas sim sob a forma de minerais, dentre os quais destacam-se a hematita, Fe2O3, a magnetita, Fe3O4 e a pirita, FeS. Nos organismos vivos o ferro possui uma grande importância, a qual é devida ao transporte de oxigênio pela hemoglobina, formação de mioglobulina, etc. Ele é absorvido pelos seres vivos na forma de sais contidos na água e por alimentos, sendo que a deficiência deste causa doenças, como a anemia. No homem existem taxas limites de absorção e excreção de ferro, logo o excesso de ferro no corpo pode causar até câncer no fígado. Dentro das doenças relacionadas à ausência de ferro esta a anemia ferropriva, que é um o tipo de anemia decorrente da privação, deficiência, de ferro dentro do organismo levando à uma diminuição da produção, tamanho e teor de hemoglobina dos glóbulos vermelhos, hemácias. O ferro é essencial para a produção dos glóbulos vermelhos e seus níveis baixos no sangue comprometem toda cascata de produção das hemácias. Dentro dos glóbulos vermelhos existe uma proteína chamada hemoglobina que tem na sua estrutura bioquímica a presença de moléculas de ferro e de cobalto (o cobalto está presente na vitamina B12). A hemoglobina é a responsável pelo transporte do oxigênio que respiramos até todas as células do corpo humano. Na diminuição desta (hemoglobina) o transporte de oxigênio fica comprometido e várias consequências danosas serão desencadeadas. Estima-se que 90% das anemias sejam causadas por deficiência de ferro.
Nas propriedades físico-químicas do ferro destacam-se dois tipos de sistemas ou duas séries principais: os compostos ferrosos com ferro bivalente, FeS, que está no mineral pirita citado anteriormente e os compostos férricos com ferro trivalente, F2O3, que é a hematita. O magnetismo é uma importante propriedade física deste, já quando exposto ao ar úmido ele se oxida, formando a ferrugem, ou seja, óxidos ferro. Pode-se destacar também, como uma das propriedades químicas de ferro, a facilidade que este tem de ser atacado por ácidos.
A determinação de ferro pode ser feita por espectrofotometria, que é um subconjunto da Espectroscopia Molecular, ou ainda mais detalhado, a espectrometria de absorção molecular no Ultravioleta/Visível (UV/Visível), sendo, portanto um importante método analítico e instrumental de grande aplicação. Neste método está envolvido um ligante ou complexante para o ferro (de seletividade para um de seus números de oxidação) formando um complexo de coloração com alta capacidade de absorver a radiação incidida (alta absortividade molar). Há ainda outros métodos e técnicas para a determinação de ferro em amostras diversas oriundas dos mais diferentes locais entre estas estão a Espectrometria de Absorção Atômica (AAS, do inglês), a Voltametria e a Espectrometria de quimioluminescência.
Qualquer técnica ou método que faça uso de luz (radiação eletromagnética) no intuito de medir concentrações de espécies químicas é considerado como espectrofotometria. A luz atualmente é descrita tanto como partícula como onda, logo estas ondas luminosas são campos magnéticos e elétricos oscilantes, orientada perpendicularmente, que explica sucintamente o termo radiação eletromagnética (luz). Parâmetros como comprimento de onda (em nm) e frequência ( em s-1 ou Hz) definem o comportamento da radiação e também a energia desta.
OBJETIVO
Determinar a concentração de ferro no sangue em amostras através da espectrofotometria.
Relembrar as fontes, funções e carência do sal mineral ferro.
MATERIAS E REAGENTES
2 pipetas automáticas
3 tubos de ensaio
Soro (normal ou patológico)
Banho-maria
3 cubetas
Espectrofotômetro
Papel absorvente
Kit de determinação de ferro sérico
1 Estante
PRODUTO UTILIZADO
FERRO - PP, Catálogo 438.
Gold Analisa
IDENTIFICAÇÃO DOS REAGENTES 
Conservar entre 2-8 ºC. 1. 
Calibrador- Preparação de soro bovino liofilizado com concentração de ferro indicada no rótulo do frasco. O valor da concentração de ferro do Calibrador é rastreável ao método de referência proposto pelo CLSI. 2. 
Tampão - Contém tiouréia 30 mmol/L e surfactantes em tampão pH 4,5 400 mmol/L. 3. 
Ferrozina - Contém ferrozina 10 mmol/L e ácido ascórbico 32,6 mmol/L em tampão 50 mmol/LpH 4. 
ESTABILIDADE 
Os reagentes são estáveis até o vencimento da data de validade impressa no rótulo do produto e na caixa quando conservados na temperatura recomendada, bem vedados e se evite a contaminação durante o uso.
MÉTODOS
Procedimento Identificar 3 tubos de ensaio como B (branco), T (teste) e C (calibrador) e pipetar:
	TUBOS
	Branco
	Teste
	Calibrador
	Tampão (2)
	1,6 ml
	1,6 ml
	1,6 ml
	Calibrador (1)
	----------------
	---------------
	0,2ml
	Soro 
	----------------
	0,2 ml
	---------------
	Água deionizada
	0,2 ml
	---------------
	---------------
Utilizamos três tubos de ensaio (branco, teste e calibrador), e com a pipeta automática, foram pipetados em cada tubo, 1,6 ml da solução tampão (2).
No tubo de ensaio calibrador, que continha a solução tampão (2), acrescentamos 0,02 ml da solução calibrador (1).
No tubo de ensaio teste, que continha a solução tampão (2), acrescentamos 0,02 ml da solução de soro. 
No tubo de ensaio branco, que continha a solução tampão (2), acrescentamos 0,02 ml de água deionizada.
Os tubos foram agitados para que ocorresse maior oxigenação das soluções finais, e posteriormente feito a leitura no espectrofotômetro que foi ajustado à 560nm.
As soluções são colocadas em cubetas. A primeira cubeta continha à chamada substância branca, havendo a solução tampão (2) e água deionizada apenas para calibração do espectrofotômetro. A segunda cubeta continha a solução de teste, e a terceira cubeta continha a solução calibrador.
Em seguida, depois de realizada a leitura das amostras (branco, teste e calibrador), as mesmas são devolvidas aos tubos e ensaio e realizada a segunda etapa da leitura. 
2º etapa:
Adicionar 0,2 ml de ferrozina nos 3 tubos:
	TUBOS
	Branco
	Teste
	Calibrador
	Ferrozina (3)
	0,2 ml
	0,2 ml
	0,2 ml
Após adicionar à solução de ferrozina (3) as amostras são homogeneizadas e colocadas em banho-maria à 37º por 5 minutos.
São realizadas novamente as leituras no espectrofotômetro ajustado à 560nm.
RESULTADOS E DISCUÇÕES
No espectrofotômetro foram regulados os valores de absorbância e de transmitância para a substância branca, os quais seriam zero de absorbância (não absorve nada de luz) e 100% de transmitância (deixa passar toda a luz).
Para a obtenção do valor final de ferro na amostra, são utilizados apenas os valores de absorbância da solução teste e calibrador, e o valor de transmitância da substância branca.
Para determinar o valor, é utilizado um cálculo. 
Sendo assim:
Proteínas totais (mg/dL) = x 4g/dL = x 4g/dL= 9,51g/dL
H
Valores desejáveis ou recomendados
Estes valores devem ser usados apenas como orientação. Eles substituem os valores de referência e são determinados a partir de dados epidemiológicos, calculados estatisticamente.
	IDADE
	mcg/dL
	RECÉM-NASCIDO
	100 A 250 
	CRIANÇA ATÉ 6 ANOS
	40 A 100 
	CRIANÇA MAIOR OU IGUAL A 7 ANOS
	50 A 120 
	HOMEM
	70 A 180 
	MULHER
	60 A 180 
SIGNIFICADO CLÍNICO
Os valores menores que 65 mcg/dL para homens e 50 mcg/dL para mulheres indicam ferro baixo. Isso pode ocorrer em doenças renais e em algunstipos de anemias como por falta de ferro e por doenças crônicas. Na pesquisa de anemias,  é importante avaliar todos os exames da atividade do ferro em conjunto. Resultados entre 65 mcg/dL e 175 mcg/dL para homens e entre 50 mcg/dL e 170 mcg/dL para mulheres estão dentro da faixa normal. Resultados acima de 175 mcg/dL para homens e de 170 mcg/dL para mulheres indicam ferro alto e também devem ser acompanhados por um médico.
Quando os níveis de ferro são superiores aos normais isso pode indicar: déficit de vitamina B12, intoxicação com ferro, morte do tecido hepático, anemias hemolíticas ou múltiplas transfusões de sangue.
Por outro lado, quando os níveis de ferro são inferiores pode ser um sinal de: sangramento, absorção insuficiente de ferro, gravidez ou dieta baixa em ferro.
CONCLUSÃO
Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação eletromagnética por muitas moléculas, quando os seus elétrons se movimentam entre níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho. A quantidade de Fe obtida n
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Inmetro – Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark eds, Rio de Janeiro, 1997.
Albuquerque, M. P. D. e M. P. D. Albuquerque. Processamento de Imagens: Métodos e 
Análises. Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas. Rio de Janeiro, p.12. 2003. (Relatório Técnico)
FERRO - PP. Catalogo 438. Instruções de Uso, GOLD ANALISA.
Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Fundamento de Química Clínica, 4a Ed - Editora Guanabara Koogan SA; 1998