1 Relatório de Biologia Molecular Extraçao genomicoe e eletroforese (1).docx

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI 
CAMPUS ALTO PARAOPEBA 
 Engenharia de Bioprocessos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO E ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 
 
 RELATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório apresentado como parte 
das exigências da disciplina Biologia 
Molecular Experimental sob 
responsabilidade da Profª Mariana Dias Moreira. 
 
Ana Cristina Conti Neves- 154200006 
Carolina Reciate - 154200018 
Laíse Nascimento Britto - 154200040 
Sérgio Júnior Goularth Alves - 154200055 
 
 
 
 
OURO BRANCO - MG 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
Na maioria dos processos utilizados em biologia molecular é necessária a extração de ácidos 
nucléicos DNA e RNA. Em processos como a caracterização genética por exemplo, são necessárias 
técnicas de extração de DNA genômico, que é o DNA de alto peso molecular cujos procedimentos e 
etapas devem ser feitas cuidadosamente, pois qualquer alteração no objeto de estudo poderá 
comprometer todo o processo, e causar alguns danos à molécula durante sua extração. Há na literatura 
vários protocolos para todos os tipos de extrações, é necessário um conhecimento prévio do objeto a 
ser estudado e também dos materiais e reagentes disponíveis para escolher o melhor método de 
extração da molécula. O sucesso na etapa de obtenção do material a ser analisado é importante, devido 
os cuidados que devem ser tomados durante seu manuseio evitando assim possíveis contaminações. 
Então deve-se considerar a escolha correta do protocolo, a qualidade dos reagentes e materiais 
utilizados e a qualidade da amostra que pode ter sido coletada e/ou armazenada de forma incorreta. 
Devido ao fato da molécula de DNA genômico ser extensa, podem ocorrer complicações na extração 
da molécula íntegra, ou seja, não conseguir obter fragmentações da mesma. Lembrando que qualquer 
impureza, como proteínas e outros reagentes utilizados na extração, causa interferências na qualidade 
do DNA e nos resultados finais da pesquisa. A maioria das bactérias possuem, além do DNA 
genômico, múltiplas cópias de um pequeno DNA circular chamado DNA plasmidial, ou simplesmente 
plasmídeo. Em pouquíssimas bactérias este plasmídeo é linear. Estes são responsáveis por 
desempenhar diversas funções, que podem, por exemplo, permitir a sobrevivência da bactéria em 
condições extremas, possuem genes que codificam substâncias que irão causar a morte de outros 
micro-organismos, inclusive bactérias, impedindo o crescimento destes no meio, isso é observado na 
natureza quando ocorre a competição por nutrientes. 
O processo de extração do DNA genômico difere do processo de extração do plasmídeo, onde 
na técnica de extração do DNA genômico todo o material genético da célula é extraído, tendo como 
produto final o DNA genômico e o DNA plasmidial. Existem inúmeros métodos para a extração de 
DNA, os quais geralmente envolvem a ruptura e lise da célula. Após a liberação do DNA no meio, as 
proteínas devem ser removidas deste, e o método mais utilizado para este procedimento é a extração 
com fenol e clorofórmio, que provoca a desnaturação das proteínas presentes na amostra de maneira 
eficiente, diminuindo a interação destas com a água. 
 A extração do DNA genômico pode ser dividida em quatro estágios: 1) ruptura da 
célula, 2) lise da célula, 3) remoção de proteínas e contaminantes, e 4) recuperação do DNA. 
Para extração de DNA plasmidial, podem ser utilizados dois procedimentos diferentes: lise 
alcalina e método de “boiling”. O método mais utilizado para o isolamento e purificação do DNA 
plasmidial é o da lise alcalina. Esse método é muito robusto e apresenta bons resultados qualitativos 
e quantitativos sob diversas condições. O método de isolamento por lise alcalina baseia-se na 
diferença em desnaturação, em condições alcalinas (pH~12), entre o DNA plasmidial circular e o 
cromossômico de alto peso molecular. 
Utilizando o Método CTAB/NaCl (Adaptado de RODRIGUES, 2012) para extração de DNA 
genômico almeja-se a obtenção da molécula purificada, já que no protocolo há a atuação da proteinse 
K um agente específico para retirar proteínas do DNA em estudo e várias etapas levando à 
precipitação da molécula utilizando álcool e sal como reagentes. Para análise da integridade da 
molécula, pode-se usar a técnica de eletroforese em gel de agarose tanto para o DNA extraído como 
para moléculas amplificadas na PCR podem ser separadas para uma melhor qualificação dos 
fragmentos obtidos (AZEVEDO et al., 2003; MIESFELD, 1999), a agarose é um polímero 
proveniente de algas marinhas (DE-SOUZA, 2003). Para conseguir visualizar os fragmentos do DNA 
no gel usa-se um reagente intercalante muito toxico o brometo de etídio que libera uma fluorescência 
sob a luz ultravioleta, permitindo a visualização dos ácidos nucleicos presentes no gel (WHITE et al., 
1998). 
Já o Esta técnica é utilizada para a visualização dos fragmentos de DNA, após este ser 
extraído. A eletroforese em géis de agarose (mais utilizado) ou poliacrilamida é utilizada para separar, 
identificar e isolar os fragmentos de DNA a partir da influência de um campo elétrico aplicado. Como 
os fragmentos de DNA possuem aproximadamente a mesma carga é necessária a utilização de um 
meio viscoso para que este seja separado por tamanho, por isso utiliza-se o estes géis, os quais formam 
uma malha, que possibilita a separação de fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho. 
Por possuir carga negativa, o DNA é sempre aplicado do lado do pólo negativo no gel. Isso 
possibilita a corrida para o pólo positivo (figura 3). A migração da molécula de DNA depende de 
diversos fatores: 1) tamanho da molécula – quanto maior a molécula, maior o coeficiente de atrito 
desta, sendo assim a sua migração no gel será mais lenta. 2) conformação do DNA – o DNA em 
forma de super-hélice circular ou na forma circular possui a velocidade de migração mais elevada; por 
isso as moléculas de DNA são clivadas, para que todas estejam na forma linear, a fim de se obter um 
padrão. 3) concentração da agarose – a concentração do gel (0,8% - 1,0%) deixará o gel mais ou 
menos viscoso, isso possibilitará que um mesmo fragmento de DNA tenha uma maior velocidade de 
migração (gel menos viscoso, possui um menor coeficiente de atrito) ou uma menor velocidade de 
migração (gel mais viscoso, possui um maior coeficiente de atrito e facilita a separação de fragmentos 
menores). 
 
Figura 1 (I) Aplicação da amostra de DNA aos slots no gel de agarose (necessitam estar no pólo negativo, como pode ser 
observado). (II) Aspecto do gel no final da eletroforese. (III) visualização das bandas de DNA no transiluminador, 
visualização a qual é possível devido à adição de brometo de etídeo, um agente intercalante que possui afinidade pelo DNA 
e é visível quando exposto a luz UV.(IV) fotografia do gel de agarose. (legenda) M - marcador de pesos moleculares; A e 
B – amostras de DNA. 
 
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma reação ​in vitro​ processo de síntese do ácido 
desoxirribonucleico (DNA), que pode amplificar até um bilhão de cópias de um dado alvo de ácido 
nucléico. Tem sido extensivamente aplicado para a identificação, detecção e diagnóstico de doenças 
genéticas e infecciosas. No artigo, fornecemos uma visão geral do processo de PCR. (Accessed April 
2, 2013. doi: 10.1002/599247) 
 
Um método rápido e sensível para a detecção de mudanças de base em determinadas sequências 
de DNA genômico. Esta técnica é baseada no fato de que regiões específicas de seqüências genômicas 
podem ser eficientemente rotuladas e amplificadas simultaneamente usando substratos marcados na 
reação em cadeia da polimerase e que em não-desnaturantes géis de poliacrilamida, a mobilidade 
eletroforética de ácido nucléico de fita única depende não apenas de sua tamanho, mas também na sua 
sequência.​(MASATO et al., 1989) 
A reação em cadeia da polimerase é um método de amplificação ​in vitro amplamente utilizado 
em biologia molecular. A contaminação por PCR pode ocorrer a partir de uma única molécula de 
DNA exógeno ou exógeno, que, se não for controlada, pode confundir a interpretação dos resultados. 
A clonagem por PCR de genes de comprimento total pode ser problemática porque as mutações 
podem resultar em substituições de aminoácidos em seqüências do tipo selvagem. A PCR pode 
amplificar de forma confiável tamanhos-alvo de até 3-4 kb a partir de uma variedade de materiais de 
origem. Os produtos de PCR recombinantes podem ser criados por sequências com erros de 
emparelhamento entre o iniciador e o ADN molde ou pela adição de sequências exógenas 5 'aos 
iniciadores. 
A PCR pode detectar variações genéticas humanas associadas a doenças hereditárias e câncer. O PCR 
degenerado é uma ferramenta poderosa para identificar novos membros da família de genes que são 
importantes no desenvolvimento de drogas. A PCR quantitativa tem sido amplamente utilizada para 
estudar a expressão gênica e estimar o número de cópias virais. O Emulsion PCR é usado para preparar 
modelos em um sistema livre de células para plataformas de sequenciamento de próxima geração. A 
amplificação completa do genoma usa a DNA polimerase process29 altamente processadora para 
amplificar as quantidades de nanogramas de amostras preciosas em quantidades de 
microgramas.​(MATZEKER et al., 2009). 
 
 
2. METODOLOGIA 
 
 Extração de DNA genômico 
 
 
Utilizou-se ​Escherichia coli como a fonte de DNA para a realização da aula prática. A bactéria 
foi crescida em meio LB sob vigorosa agitação (250 rpm) durante 16 horas, a temperatura de 37°C. 
Verteu-se 1 mL da cultura bacteriana em 2 diferentes tubos de microcentrífuga do tipo eppendorf e 
então os tubos foram centrifugados durante 3 minutos, a 14000 rpm. Ao retirar os tubos da centrífuga, 
verteu-se mais 1 mL da mesma cultura bacteriana em ambos os tubos, os quais foram novamente 
centrifugados sob as mesmas condições. O sobrenadante dos tubos foi descartado em hipoclorito 1% e 
as células presentes no “pellet” foram ressuspendidas, com auxílio de micropipeta, em 564 μL de 
tampão TE (10mM Tris; 1mM EDTA). Adicionou-se aos dois tubos 6 μL de proteinase K (10mg/mL) 
e posteriormente 30 μL de detergente SDS (dodecil sulfato de sódio) 10%. As misturas foram 
incubadas durante 1 hora, a temperatura de 37°C e então se adicionou 1V de clorofórmio, pH 8,0, na 
capela. As fases foram misturadas e então os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a 14000 
rpm. 
As fases aquosas dos dois tubos foram transferidas para novos tubos de microcentrífuga do 
tipo eppendorf, para que se repetisse a adição de 1V de clorofórmio, também na capela. 
Centrifugou-se novamente os tubos, também durante 5 minutos a 14000 rpm, e as novas fases aquosas 
foram outra vez transferidas para novos tubos. Acrescentou-se à mistura 0,1V de NaCl 3M e 1V de 
isopropanol. Os tubos foram invertidos repetitivamente e então centrifugados, durante 5 minutos a 
14000 rpm. Os sobrenadantes foram descartados em hipoclorito 1% e os “pellets” de ambos os tubos 
foram ressuspendidos em etanol 70%. 
 
 
2.1 Preparo do gel de agarose 0,8% e amostras 
 
Seguiu-se o seguinte procedimento para a preparação do gel de agarose, pesou-se 0,8g de 
agarose no estado sólido que foi vertida em um erlenmeyer, em seguida foi adicionado ao 
erlenmeyer 100 mL de tampão TBE 0.5X, e sem agitação, a solução foi levada para o micro- ondas 
para ser aquecida de 1 em 1 min, sendo agitada nos intervalos até a completa dissolução da 
agarose. Após a solubilização, aguardou-se até que a solução estivesse a temperatura suportável ao 
toque, aproximadamente 40ºC, então a solução foi vertida na forma até aproximadamente 5mm de 
altura e depois colocado o pente. Aguardou-se então a completa gelificação do gel, que durou 
aproximadamente 1h. Retirou-se cuidadosamente o pente e transferiu-se o gel para a cuba com os 
poços formados pelo pente direcionados para o polo negativo indicado na cuba. Depois 
adicionou-se solução tampão TBE 0.5X, o mesmo utilizado para fazer o gel. Assim conclui-se o 
preparo do gel de corrida. 
Para o preparo das amostras, pipetou-se 5 microlitros de amostra de DNA extraído 
previamente que foi colocado em um microtudo, depois foi adicionado ao mesmo recipiente 3 
microlitros de solução tampão contendo glicerol e Azul de bromofenol, o primeiro relacionado a 
melhorar a densidade da amostra quando aplicado no gel e o segundo a visualização prévia da 
corrida do DNA no gel. Depois de preparada e homogeneizada a solução foi aplicada em um dos 
poços no gel, que também continha uma aplicação de um padrão molecular que fora preparado do 
mesmo jeito. Com as amostras preparadas montou-se o equipamento seguindo as instruções, 
iniciou-se então o procedimento de corrida. 
2.2 Extração do DNA plasmidial 
A partir do meio de cultivo de Escherichia coli, o qual foi inoculado com 5mL de meio 
LB contendo 100µg de ampicilina e incubado em um shaker com agitação de 200 rpm a 37ºC 
durante 16 horas, retirou-se 1,5mL e centrifugou-se a 12.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC, 
descartou-se o sobrenadante e centrifugou novamente sob as mesmas condições. Suspendeu-se o 
pellet com 100µL de solução A ou tampão GTE (glicose 50mM, Tris HCl 25mM, pH 8 e EDTA 
10mM, pH 8,0) e agitou-se vigorosamente em um vórtex para posteriormente incubar a amostra por 
5 minutos no gelo. Em seguida, adicionou-se 200µL de solução B (NaOH 5M e SDS 1%), agitou-se 
o microtubo por inversão cinco vezes e incubou-se no gelo por cinco minutos. Adicionou-se ao 
microtubo 150µL da solução C contendo acetato de potássio 3M e pH ajustado com ácido acéticopara 4,8, agitou-se o microtubo por inversão três vezes e incubou novamente no gelo durante 5 
minutos. Centrifugou-se a amostra a 12.000 rpm por 5 minutos a 4°C e logo após, com o auxilio de 
uma micropipeta transferiu-se o sobrenadante para outro microtubo e nele adicionou-se 500µL de 
isopropanol. Incubou-se a -20°C por 15 minutos, centrifugou-se a 12.000 rpm por 5 minutos a 4°C e 
descartou-se o sobrenadante. Ressuspendeu-se o pellet com 1mL de etanol 70% gelado e 
centrifugou-se novamente sob as mesmas condições. Descartou-se o sobrenadante, adicionou-se 
50µL de água Milli-Q-estéril e armazenou-se o DNA a -20°C. 
 
2.3 Procedimento de quantificação e determinação de grau de pureza 
 
O DNA foi diluído 100 vezes, utilizou-se 10 microlitros da preparação de DNA e diluiu- se 
em 990 microlitros de água ultrapura esterilizada. Realizou-se a leitura em espectrofotômetro dos 
comprimentos de onde de 260nm, 280nm e 230nm, depois foram realizados os cálculos para 
determinar a concentração, contaminação por proteínas e/ou RNA. 
 
 
2.4 Executando a reação em cadeia da polimerase 
 
Identificou-se os tubos referentes aos procedimentos e componentes do experimento. Logo 
após preparou-se a solução em que ocorre a reação contendo 2𝝁g de DNA, 6𝝁L do ​Foward Primer 
e do ​Reverse Primer, que tem a função de conduzir o ponto de início da síntese do DNA; 3𝝁L da 
Taq DNA polimerase, retirada de um banho de gelo, e 3𝝁L de dDNTP uma mistura com os quatro 
desoxirribonucleotídeos precursores. além disso, foi acrescido na mistura 15𝝁L de tampão ​taq 
Buffe​ r e 108𝝁L de água ultrapura ( ​Nuclease-free​ ). Para um volume total de solução de 50𝝁L. 
Destribuiu-se 48𝝁L da mistura de PCR em cada tubo sem o DNA. Subsequentemente adicionou-se 
2𝝁L de DNA em cada tubo, deixando o controle livre e homogeneizando suavemente as respectivas 
amálgamas. 
Levou-se ao termociclador o Mix que foi preparado e posteriormente este foi aquecido a 94°C por 
três minutos e depois diminuída novamente, para 50°C, por um minuto, a fim de permitir o 
anelamento dos primers às sequências complementares. em seguida a temperatura é elevada à 72°C 
por um minuto e trinta segundos. Depois de quinze minutos é levado ao resfriamento a 4°C. 
Após o ciclo da PCR analisou-se 5𝝁L dos amplicons obtidos em gel de agarose 1,2%. este gel foi 
corado com brometo de etílico e observado, subsequentemente, em um transluminador sob luz UV. 
Obteve-se, então amplicons da órdem de xxxpb. 
 
 
 
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES 
 
A extração do DNA genômico de células de ​E. coli​ usando o método adaptado de RODRIGUES, 
2012, foi realizado com sucesso obtendo uma concentração alta de DNA, mas ocorreu também uma 
razoável degradação do mesmo. Alguns fatores como o estado vegetativo do material, manuseio de 
utensílios de maneira inadequada e adaptação ao protocolo podem ter causado esse arraste 
visualizado no gel abaixo. As soluções já estavam preparadas devido à demora desta etapa, o 
protocolo foi seguido a partir da extração da ​E. coli​ usando uma solução de NaCL que auxilia na 
precipitação do DNA. A solução de CTAB/NaCL lisa a membrana removendo os polissacarídeos 
presentes liberando componentes celulares. O clorofórmio coagula as proteínas durante a extração. 
O isopropanol auxilia na precipitação dos ácidos nucleicos. Para retirar as impurezas do DNA como 
a remoção de resíduos de clorofórmio usou- se álcool 70%. Após todos os passos completados o 
tubo contendo o DNA ressuspendido em 50µL de água ultrapura foi armazenado em geladeira a 
4°C. 
Realizou-se uma eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etideo para separar 
os fragmentos do DNA e analisar sua integridade. 
 
 
 
Analisando a figura e observando a intensidade das bandas, não houve uma boa separação 
entre as bandas do padrão de peso molecular (ppm) que continha 50 pb, o resultado ruim pode ser 
atribuído a erros técnicos no processo, defeito no aparelho de espectrofotômetro e possivelmente 
problemas por reagentes com datas de validade vencida. Este padrão de peso molecular é usado 
com a finalidade de comparar o resultado dos fragmentos obtidos das amostras de DNA extraído 
aplicados no gel de agarose. A migração do DNA no gel de agarose foi obtida através de uma 
corrida a 110V e 0,09 A, até conseguir uma boa separação durando cerca de uma hora. 
Observou-se na amostra 5 em que foi realizado a extração pelo método de CTAB/NaCL- Adaptado 
de RODRIGUES, 2012, uma concentração maior de DNA devido uma banda formada próximo a 
canaleta indicando fragmentos de alto peso molecular. O DNA está degradado devido ao manuseio 
ou outros fatores. 
A extração do DNA genômico de Escherichia coli seguiu o protocolo de precipitação com 
etanol. Cada solução tem papel fundamental para garantir um ácido nucleico purificado, ou seja, 
sem contaminantes que são proteínas e demais reagentes utilizados durante o experimento. Para 
permeabilizar a célula utiliza-se o SDS e solução salina-EDTA que além de permeabilizar a célula 
complexa cofatores de ribonucleases, protegendo a amostra que deseja purificar (Marmur 1961). 
Para a precipitação de proteínas liberadas pelas células utiliza-se uma solução de 
fenol-clorofórmio e etanol que diminuem a constante dielétrica do meio favorecendo interações 
hidrostáticas entre os contaminantes que agregam e precipitam com a força centrifuga. É possível 
observar no tubo três fases, a primeira é a fase aquosa que contém o DNA e fica no topo por ser 
menos densa, a fase intermediária contém proteínas e RNA e apresenta um aspecto leito, a terceira 
fase e a mais densa é a fase orgânica que contém lipídios, polissacarídeos e proteínas (Marmur 
1961). Desta apenas a fase aquosa foi retirada, obteve-se então a mostra G1, de DNA genômico. 
 
O DNA plasmidial para ser extraído deve passar por tratamentos diferentes do DNA 
genômico, o método utilizado foi de lise alcalina por ser mais simples e de fácil reprodutibilidade. 
Para a replicação de células bacterianas contendo plasmídeos a cepa foi cultivada em meio LB, que 
contém ampicilina. A solução A é uma solução de glicose importante para impedir o rompimento 
celular que pode gerar inúmeros contaminantes, incluindo o DNA genômico. A lise deve ser 
controlada para evitar esta contaminação, para isso adiciona-se uma solução de SDS e NaOH 
(solução B), o detergente solubiliza a membrana celular enquanto a NaOH mantém o meio alcalino 
para desnaturação do DNA genômico e do RNA. É importante separar então os contaminantes, 
para isso utilizou-se uma solução de acetato de potássio que torna RNA e proteínas insolúveis 
permitindo sua separação por centrifugação ou filtração (dos SANTOS, da SILVA et al. 2008). 
Outra análise da extração realizada foi por um método de quantificação e determinação de 
pureza dos ácidos nucleicos obtidos, onde a leitura dos ácidos nucleicos por meiode 
espectrofotometria a 230,260 e 280nm. As leituras realizadas estão na tabela abaixo: 
 
 
Amostra A260 A280 A230 [DNA] A280
A260 A230
A260 
Grupo 1 0,083 0,054 1,067 4,12 1,54 0,071 
Grupo 2 -0,901 -0,369 0,050 18,9 0816 0,02 
Grupo 3 -0,511 -0,256 0,281 25,29 2,0 1,82 
Grupo 4 -0,563 -0,020 0,500 28,10 28,95 0,94 
Tabela 1​: Absorbância medida nas amostras de DNA genômico em 1mL de solução de DNA, 
preparada por diluição de 100 vezes. 
 
 
Para calcular a concentração de DNA e comparar com os valores obtidos no espectrofotômetro, 
utilizou-se a equação I e também as razões e , ​obtendo-se assim os seguintes valores para A280
A260
 A230
A260
 
o Grupo 1: 
 
 
 
, 77A280
A260 = 1 5 
 
, 77A230
A260 = 0 0 
 
Esses valores foram comparados com os que constam na Tabela 1, e pode-se perceber uma grande 
proximidade com o que foi lido no espectrofotômetro. Segundo ​a literatura, os valores das razões 
A​260​/A​280 ​e ​A​260​/A​230 ​devem encontrar-se entre 1,8 e 2 para que uma amostra de DNA seja 
considerada com pureza adequada para uma posterior análise, contudo, obteve-se 1,577 e 0,077, 
podendo-se perceber uma alta contaminação por proteínas e compostos orgânicos respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 CONCLUSÃO 
 
Na análise dos resultados obtidos nos experimentos verificou-se a obtenção do DNA 
genômico tanto pelo método de gel na eletroforese, quanto na quantificação por 
espectrofotômetros. Os valores diferentes entre os grupos se devem a fatores no manuseio como 
erros de pipetação, etc. Ao analisar a figura 1 do gel foi identificado um rastro com coloração mais 
brilhante ao final do gel indicando que houve uma degradação obtida talvez pelo mal manuseio ou 
devido à má condição da amostra anterior a extração. Através da relação A​260​/ A​280 ​para DNA 
genômico obteve-se valores entre 0,0000419 indicando péssimo grau de pureza. Através da relação 
A​260​/ A​230 ​obteve-se 1,577 pode-se verificar uma possível contaminação da amostra. 
O experimento demonstrou que o grau de pureza e análise da integridade, são fatores 
essenciais para garantir se a extração teve sucesso ou não, uma vez que, sabendo-se que o resultado 
da extração não foi satisfatório, evita-se tempo e gastos com reagentes nas etapas futuras que 
necessitariam de DNA íntegro. 
 
 
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 
 
AZEVEDO, M.O. et al. (Org.). Técnicas básicas em biologia molecular. Brasília: UNB, 2003. 
211p. 
DE-SOUZA, M.T. Análise de DNA por eletroforese em gel de agarose. In: Azevedo, M.O. et al. 
(Org.). Técnicas básicas em biologia molecular. Brasília: UNB, 2003. p.11-128. 
WHITE, P.S. et al. Mitochondrial DNA isolation, separation, and detection of fragments. In: 
Hoelzel, A.R. Molecular genetic analysis of populations – a practical approach. Oxford: IRL, 1998. 
p.65-101. 
Watson, J. D.; Levine, M.; Gann, A.; Losick, R.; Baker, T. A.; Bell, S.P. Biologia molecular do 
gene. 5ª ed. Porto Alegre: Artmed. 2006. 
Separação de fragmentos de DNA: eletroforese em gel. Disponível em< 
http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php​>. Acessado em 10/04/16. 
Sambrook J, EF, and Maniaytis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2​nd ​edition. 
Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Disponível em: 
<​https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/9780470015902.a0000998.pub2​> 
Detecção rápida e sensível de mutações pontuais e polimorfismos de DNA usando a reação em 
cadeia da polimerase Disponível em: 
<​https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0888754389901298​>