Transformação via Agrobacterium

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Desenvolvimento de construções 
gênicas utilizadas para 
transformação 
Clayton Borges 
Transformação via Agrobacterium 
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Agrobacterium 
tumefaciens 
Um cromossomo linear 
de 2 Mb e um circular 
de 2.8 Mb 
Plasmídeo Ti (tumor-
inducing) de 200 Kb 
Transformação via Agrobacterium 
Transformação via Agrobacterium 
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Infecção de plantas por 
Agrobacterium 
Transformação de plantas 
através de Agrobacterium 
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Gene Gun - Biobalística 
Desenvolvido por John Sanford da Cornell 
University, em 1987 
Particularmente útil para aquelas espécies que 
se mostraram previamente difíceis de 
transformação por Agrobacterium 
(monocotiledôneas) 
Única forma de introduzir genes em 
cloroplastos 
Como funciona? 
Cobertura de partículas de 
ouro ou tungstênio com o 
DNA de interesse 
Complexo partícula-DNA 
acelerado sob vácuo, 
atingindo tecido alvo 
As células recebem o DNA 
diretamente 
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Trabalhando com o Gene Gun 
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Comparação Agrobacterium x 
Biobalística 
Agrobacterium: DNA é integrado preferencialmente em 
algumas regiões do cromossomo denominadas “hot 
spots”; baixo número de cópias; 
 
Biobalística: integração do DNA é aleatória; elevado 
número de cópias; aplicável a um amplo espectro de 
plantas 
Vetores para transformação 
via Agrobacterium 
 série pCAMBIA 
 pBIN19, pBINPLUS 
 pBI121 
 etc, etc, etc 
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Estrutura de um vetor 
Genes de seleção 
 npt II – resistência a canamicina 
 bar – resistência a herbicida PPT 
(phosphinothricin) 
 hpt II – resistência a hygromicina 
 man A – utilização de manose (seleção 
positiva) 
 xyl A – utilização de xilose 
 Revisão sobre marcadores: Aragão e 
Brasileiro, Braz. J. Plant Physiol., 14(1):1-10, 
2002 
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Modelo de vetor para obtenção de 
plantas transgênicas sem marca de 
resistência 
Genes reporter 
 GFP (green fluorescent protein) 
 luciferase 
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GFP direcionada ao núcleo 
celular 
Luciferase em plântula de 
Arabidopsis 
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Estrutura de um gene eucariótico 
e seu promotor 
Exercício: clonagem do gene, em sentido 
anti-senso, da capa protéica de um vírus em 
vetor para transformação de plantas 
CaMV 35S - P CaMV 35S-T 
HindIII - BamHI - EcoRI - PstI - XhoI 
Região para inserção do transgene 
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Amplificação do gene 
 Desenho de primers para amplificação do 
gene por RT-PCR (o vírus é de RNA) 
 Introdução de sítios de restrição nos primers 
para clonagem no vetor 
 Verificar se as enzimas escolhidas não clivam 
o gene amplificado 
 Verificar se as enzimas podem ser utilizadas 
concomitantemente 
 Equilibrar as temperaturas de anelamento 
dos primers 
Compatibilidade das enzimas 
React 1 React 2 React 3 
Hind III 55 100 20 
Bam HI 100 40 100 
Eco RI 100 100 100 
Pst I 100 100 30 
Xho I 55 100 40 
Nível de atividade nos diferentes tampões (%) 
Em negrito = tampão recomendado 
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Região codificadora da capa 
protéica do PFWV 
 1 agctgtacac agacaagaac gccagtttgg atgagctaca agaatatttg cgtgtcctag 
 61 attttgagca tacggaaggt tgctgtgaat ccgtgtctct ccaatcatcc actggaaaag 
 121 ataaagagga ggagagcaaa gatactatcg atgccggagg cgatggagga agaaaagaca 
 181 aagaaaaaga gaaaagaaca ggaactctgg caacccttga aaatccaaat cccattaatc 
 241 caaatggtgg tgacggctcg tctctaggta gagacaagga tgttaatgct ggctcgaaag 
 301 gcagagtagt gcctcgactg caaaagatta ccaagaaaat gaatctgcca acagtgaaag 
 361 gaagagtgat actcaacttg gatcatttga tcgagtacgc tccaaaccag gtagatttat 
 421 acaacactag agcgaccaaa tcacagttcg agtcctggta ttctgcagtc caaaaagaat 
 481 atgagctaga tgacaatcaa atgagcgtca tcatgaatgg tttcatggtt tggtgcattg 
 541 ataatggcac ctcaccaaat attaatggca tgtgggtgat gatggacgga gatgagcaga 
 601 ttgaataccc actaaagcca ttagttgaaa atgctcagcc cactctgaga cagataatgc 
 661 accatttttc tgatgcggct gaggcatata tagagatgag aaattccaaa gagccgtaca 
 721 tgcctaggta tggtactctg cggaatttga gggacttgag tttggctcgc tatgcttttg 
 781 acttttatga ggtcacatcc aaaacgccaa acagagcaag agaagcggta gctcagatga 
 841 aggccgctgc cctcgcgaac gtttccacta ggttgtttgg ccttgatgga aacgtttcaa 
 901 caaacagcga gaatactgaa aggcacactg caagggacgt taatcaaaac atgcacaccc 
 961 ttttgggaat gggtcctccg cagtaaaggt taggtaaact gaccacagtt agcatctcgc 
1021 attgccttta aatatctata gtagtatagc tttcactctc tttaagttta gtgtggttat 
1081 accaccttcc gtcgtgctta ttgtgatagt gtggctttgc caccagtgtc tgtgatatct 
1141 atagaataga gtcggggcag ggagaaccat tgcaacgccg gagctttcag agtgggtcac 
1201 ccacgcgcac tgaccgaggt ttggcaatgt ttgttgtcct 
Desenho dos primers 
 1 agctgtacac agacaagaac gccagtttgg atgagctaca agaatatttg cgtgtcctag 
 
 tcatcc actggaaaag 
 61 attttgagca tacggaaggt tgctgtgaat ccgtgtctct ccaatcatcc actggaaaag 
 121 ataaagagga ggagagcaaa gatactatcg atgccggagg cgatggagga agaaaagaca 
 181 aagaaaaaga gaaaagaaca ggaactctgg caacccttga aaatccaaat cccattaatc 
 241 caaatggtgg tgacggctcg tctctaggta gagacaagga tgttaatgct ggctcgaaag 
 301 gcagagtagt gcctcgactg caaaagatta ccaagaaaat gaatctgcca acagtgaaag 
 361 gaagagtgat actcaacttg gatcatttga tcgagtacgc tccaaaccag gtagatttat 
 421 acaacactag agcgaccaaa tcacagttcg agtcctggta ttctgcagtc caaaaagaat 
 481 atgagctaga tgacaatcaa atgagcgtca tcatgaatgg tttcatggtt tggtgcattg 
 541 ataatggcac ctcaccaaat attaatggca tgtgggtgat gatggacgga gatgagcaga 
 601 ttgaataccc actaaagcca ttagttgaaa atgctcagcc cactctgaga cagataatgc 
 661 accatttttc tgatgcggct gaggcatata tagagatgag aaattccaaa gagccgtaca 
 721 tgcctaggta tggtactctg cggaatttga gggacttgag tttggctcgc tatgcttttg 
 781 acttttatga ggtcacatcc aaaacgccaa acagagcaag agaagcggta gctcagatga 
 841 aggccgctgc cctcgcgaac gtttccacta ggttgtttgg ccttgatgga aacgtttcaa 
 901 caaacagcga gaatactgaa aggcacactg caagggacgt taatcaaaac atgcacaccc 
 961 ttttgggaat gggtcctccg cagtaaaggt taggtaaact gaccacagtt agcatctcgc 
 cccaggaggc gtcatt 
 
1021 attgccttta aatatctata gtagtatagc tttcactctc tttaagttta gtgtggttat 
1081 accaccttcc gtcgtgctta ttgtgatagt gtggctttgc caccagtgtc tgtgatatct 
1141 atagaataga gtcggggcag ggagaaccat tgcaacgccg gagctttcag agtgggtcac 
1201 ccacgcgcac tgaccgaggt ttggcaatgt ttgttgtcct 
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Desenho dos primers 
 F: 5’ – GAATTCTCATCCACTGGAAAAG – 3’ 
 (sítio para Eco RI) 
 Tm = 43.89 oC 
 R: 5’ – AAGCTTTTACTGCGGAGGACCC – 3’ 
 (sítio para Hind III) 
 Tm = 51.70 oC 
Hind III Eco RI 
Acrescentar alguns nucleotídeos para 
digestão direta (sem pré-clonagem) 
 F: 5’ – AAAGAATTCTCATCCACTGGAAAAG – 3’ 
 (sítio para Eco RI) 
 
 R: 5’ – AAAAAGCTTTTACTGCGGAGGACCC – 3’ 
 (sítio para Hind III) 
 
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Pré-clonagem em vetor pGEM-T 
 
A 
A 
Produto amplificado por RT-PCR 
Transferência do gene do vetor de 
clonagem para o vetor de tranformação 
CP
CP/pGEM-T
Eco RI 
Hind III 
35S-P
35S-T
Eco RI 
Hind III 
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Síntese de um gene 
 Genes podem ser sintetizados artificialmente 
acoplando-se diversos oligonucleotídeos 
 Proteína pode ser modificada para maior 
atividade ou estabilidade (resistência a 
proteases da planta) 
 Adição de peptídeos sinalizadores permitem 
direcionamento da proteína para diferentes 
compartimentos celulares 
 Códons podem ser escolhidos para 
otimização da expressão na planta alvo 
Exemplo: síntese de uma 
cecropina modificada 
 Cecropina: peptídeo bactericida 
produzido por insetosEficaz em baixas concentrações 
 Não há relatos de desenvolvimento de 
resistência por parte da bactéria 
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Sintese de gene por PCR 
Sintese do gene de cecropina modificada 
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Promotores específicos 
 Controle da expressão do transgene 
para uma otimização de seu efeito ou 
redução de efeitos não desejáveis 
 Exemplos: tecido-específico, órgão-
específico, induzível por estresse 
hídrico, infecção por patógeno, injúria 
mecânica, estágio de desenvolvimento 
Promotor específico ao xilema 
Cortes transversais de pecíolo de folha de tabaco 
transgênico contendo gene GUS sob controle do 
promotor do gene da PAL de Arabidopsis 
 
Objetivo: expressão de transgene para controle da 
bactéria Xylella fastidiosa 
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Passos para obter um promotor 
“algo”-específico 
Identificar um gene que seja expresso 
especificamente na situação desejada 
(literatura: estudos de genes diferencialmente 
expressos, microarrays, ESTs) 
Verificar se sequências do gene e seu 
promotor já estão disponíveis no GenBank 
(genomas completos de Arabidopsis e arroz 
estão disponíveis, cuidado com famílias 
multigênicas) 
Se o promotor não estiver disponível, utilizar 
uma das metodologias a seguir... 
Clonagem de promotores 
 Screening de biblioteca genômica 
 Busca no GenBank 
 Gene-walking (PCR inverso ou com uso 
de adaptadores) 
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PCR inverso 
Ochman et al., 1988 
PCR inverso 
H
in
d
 I
II
 
E
co
 R
I 
B
a
m
 H
I 
Região do promotor Gene com sequência 
conhecida 
H
in
d
 I
II
 
ATG 
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20 
PCR inverso 
H
in
d
 I
II
 
Digestão com Hind III 
H
in
d
 I
II
 
ATG 
PCR inverso 
Circularização 
Hind III 
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21 
PCR inverso 
H
in
d
 I
II
 
Amplificação por PCR 
Região do promotor 
ATG 
Genome walker 
kit 
Digestão com diferentes enzimas de 
restrição, em tubos separados 
 
Ligação de adaptadores 
 
1º PCR com primer específico ao 
gene (GSP1) e primer específico ao 
adaptador (AP1) - externos 
 
2º PCR com primer específico ao 
gene (GSP2) e primer específico ao 
adaptador (AP2) - internos 
 
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Interferência de RNA 
Presença de RNA dupla fita (dsRNA) na célula 
dispara mecanismo de degradação específica 
Descrito em Caenorhabditis elegans (1998) 
Ocorre também em plantas, mamíferos, 
insetos e fungos 
Forma de proteção do genoma do organismo 
contra transposons e vírus 
 
RNA-induced 
silencing 
complex 
Novina & Sharp, 
Nature 430:161, 2004 
short interfering RNA 
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siRNA 
21-23 nt 
3’ overhang de 2 nt 
Produto da ação de RNase tipo III (Dicer) 
RNAi também atua em 
processos normais da célula 
Foram encontradas moléculas pequenas de 
RNA em diferentes organismos 
Denominadas microRNAs (miRNAs) 
19-25 nt 
Codificados pelo próprio genoma do 
organismo, derivados de RNAs em forma de 
grampo (hairpin) 
Função: regulação da expressão de mRNA 
(particularmente em processos de 
diferenciação e desenvolvimento) 
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Em animais, miRNAs são parcialmente 
complementares ao mRNA alvo 
Um tipo de miRNA pode ter diferentes mRNAs 
alvos 
Regra geral, miRNAs ligam-se em vários 
trechos próximos a extremidade 3’ não 
traduzida do mRNA 
Essa ligação não leva à degradação do 
mRNA, mas inibide a sua tradução 
miRNAs em animais 
miRNAs em plantas 
Em plantas, miRNAs são 100% (ou 
quase) complementares ao mRNA alvo 
Um tipo de miRNA tem somente um ou 
poucos mRNAs alvos 
A ligação do miRNA ao mRNA alvo leva 
à degradação do mRNA, da mesma 
forma que o siRNA 
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Exemplos de miRNA em 
Arabidopsis 
Llave et al., Plant Cell 14:1605, 2002 
Detecção do miRNA-5 em 
Arabidopsis 
Llave et al., Plant Cell 14:1605, 2002 
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Comparação de construções para 
desencadeamento de silenciamento 
gênico 
Vetor para expressão de 
mRNA em hairpin 
Varsha Wesley et al., 2001