PCR e Seq DNA- aula 3

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Universidade Federal de Goiás 
Instituto de Ciências Biológicas 
Departamento de Bioquímica 
e Biologia Molecular 
PCR e SEQUENCIMENTO DO DNA 
Prof. Dr. Clayton Luiz Borges 
Polymerase Chain Reaction 
(PCR) 
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DNA 
Adenine 
 
Thymine 
 
Guanine 
 
Cytosine 
DNA 
- Fitas antiparalelas complementares 
(hibridização) 
- Nucleotídeos com 3’ OH 
- DNA polimerase 
 
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DNA 
Exemplo de padrão de hibridização 
 Fita primária 
 CCGAATGGGATGC 
 GGCTTACCCTACG 
 Fita complementar 
PCR 
Técnica que utiliza uma sequência 
específica de DNA, em pequenas 
quantidades, e a amplifica para utilizá-la 
em futuros testes. 
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Início 
 Kary Mullis 
◦ 1983 
◦ Cetus Corporation 
 
 Scientific Community 
◦ 1993 
◦ 7,000 publications 
 
PCR – Sequência alvo 
É uma pequena região de interesse, ou um 
gene inteiro, ou uma sequência de DNA 
maior que pode ser amplificada. 
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PCR Targets 
 
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA 
 
Os (. . . ) representam a porção da 
sequência que não precisa ser conhecida 
para o processo. 
Etapas e ingredientes 
1. DNA 
2. PCR 
◦ Alvo 
◦ Denaturação 
◦ Primers (iniciadores) 
◦ Annealing (Anelamento – hibridização) 
◦ Cycles (repetição da amplificação) 
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Quantidades de cada reagente a usar numa reação de amplificação de DNA 
para um volume final de 50 µL 
Reagente Volume Concentração final 
Água Variável 
Mistura de dNTPs 10 
mM 
1 µl cada dNTP 200 µM 
Par de iniciadores 2µl 0,2 µM cada 
DNA alvo Variável 0,1-0,25 m g 
Tampão da enzima 
10x 
5 µl 1x 
MgCl 2 1,5 µl 1,5 mM 
Polimerase (U/ µl) 0,5 µl 2,5 unidades 
PCR - Desnaturação 
 CCGAATGGGATGC 
 GGCTTACCCTACG 
 CCGAATGGGATGC 
 
 
 GGCTTACCCTACG 
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PCR Primers 
 Primers variam entre 15 e 30 nucleotídeos 
 Fita simples 
 Excesso no sistema 
 Anelam e bloqueiam a sequência de se 
renaturar; 
 Um oligonucleotídeo em cada extremidade 
 Tm: temperatura em que 50% do 
oligonucleotídeo está em perfeito 
pareamento com o DNA alvo. 
PCR Taq DNA Polimerase 
DNA Taq polimerase: Thermus aquaticus, 
(80 °C). 
 
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PCR Cycles 
PCR Cycles 
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PCR Cycles 
PCR Cycles 
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PCR Cycles 
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PCR - Revisão 
 Denaturalization: 94°- 95°C 
 
 Primer Annealing: 55°- 65°C 
 
 Extension of DNA: 72°C 
 
 Number of Cycles: 25-40 
PCR - Revisão 
 Magnesium chloride: 0.5-2.5mM 
 
 Buffer: pH 8.3-8.8 
 
 dNTPs: 20-200µM 
 
 Primers: 0.1-0.5µM 
 
 DNA Polymerase: 1-2.5 units 
 
 Target DNA:  1 µg 
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Aplicações do PCR 
- Forense 
- Diagnóstico 
- Clonagem 
- Estudo de mutações 
- Filogenia 
 
 
 
Aplicações do PCR 
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Amostras 
- Saliva 
- Sangue 
- Restos de pele 
- DNA no solo 
- Fósseis 
- Et coetera 
 
 
 
Sequenciamento de DNA 
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Sequenciamento de DNA 
Histórico 
 Os primeiros métodos foram desenvolvidos em meados de 
1970; 
 
 Inicialmente, não se conseguia sequenciar nem um gene por 
ano; 
 
 Automatização: mais rápido e menor custo; 
 
 Alguns laboratórios conseguem sequenciar 100 milhões de 
bases por ano. 
Definição 
 É o processo que determina a ordem dos nucleotídeos de 
um dado fragmento de DNA. 
 
1977: 
- Maxam e Gilbert: método de degradação química. 
Tratamento com substâncias químicas que cortam a molécula 
de DNA em nucleotídeos específicos, seguido de 
eletroforese. 
 
- Sanger et al.: método enzimático, dideoxi ou término de 
cadeia. 
Síntese enzimática de uma fita complementar, cujo crescimento 
é interrompido pela adição de um dideoxinucleotídeo. 
◦ Sem amplificação do material: quantidade de amostra... 
 
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Método de Sanger 
2´,3´didesoxirribonucleotídeo 
trifosfato (ddNTP) 
Diferença entre dNTP e ddNTP 
ddNTP interrompe a reação de polimerização 
da cadeia de DNA 
Ação da DNA polimerase 
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Sequenciamento manual 
 DNA a sequenciar + polimerase + dNTPs + primer + 1 tipo de 
ddNTP 
Primer marcado 
radioativamente 
Os fragmentos perto da base do gel 
(curtos, migram mais rápido) 
representam as posições dos 
nucleotídeos mais próximas ao primer 
(extremidade 5’) e a seqüência é lida 
na direção 5’  3’, a partir da base 
até o topo. 
Vídeo 
Autorradiograma de um gel de 
sequenciamento de DNA 
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 Anos 80: sequenciador semi-automático; 
 
 Substituição das técnicas de detecção por 
radioatividade pelo uso de marcadores fluorescentes: 
 - radioisótopos: danos à saúde, dificuldade de automação 
 - fluoróforos: sistema de detecção que permite a leitura 
automática das sequências 
 
 Anos 90: sequenciadores de capilares: 
 - eletroforese capilar 
 - reação com todos os ddNTPs (ddCTP, ddATP, ddTTP, 
ddGTP) em um tubo 
 
 
 
Sequenciamento automático 
Sequenciamento de Sanger 
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Eletroforese em Gel de Poliacrilamida 
C 
G 
T 
A 
C 
G 
C A T G 
__ 
 __ 
 __ 
 __ 
__ 
 __ 
3’ 
 
 
 
 
5’ 
Os fragmentos perto da base do gel (curtos, migram mais rápido) 
representam as posições dos nucleotídeos mais próximas ao 
primer (extremidade 5’) e a seqüência é lida na direção 5’  3’, 
a partir da base até o topo. 
Sequenciamento Automático: Eletroforese Capilar 
G 
C 
T 
A 
+ 
_ 
C 
G 
T 
A 
C 
G 
3’ 
 
 
 
 
5’ 
Lase
r 
Detector 
Feixe 
de 
Laser 
Sequência da fita 
complementar 
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Eletroferograma 
5’ 3’ 
Cromatograma – Resultado gerado pelo computador depois que as 
bandas (segmentos de DNA) migraram pelo detector. 
G C A T G C 
Sequenciador Automático 
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Capillary array 
• 1 array = 16 capilares 
Placa de 96 poços (amostra), à esquerda, na qual entram 96 tubos 
capilares de vidro cobertos com plástico marrom. A eletroforese do DNA 
ocorre nesses tubos, preenchidos com matrix, da esquerda para a 
direita. 
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Fonte de Laser, ao centro, que emite raios laser através de uma 
pequena seção dos tubos capilares, onde não há a cobertura de 
plástico. O laser excita os fluoróforos e a luz emitida por cada base (4 
cores distintas) é detectada por um fotomultiplicador. 
Tela do computador conectado ao sequenciador, mostrando a imagem 
da “corrida”. Eletroferograma mostrado na parte inferior da foto. 
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VÍDEO: Cycle Seq 
AATGCCGGCTGTCCATTGAGCGAGTGTA 
37 37 37 37 37 40 40 45 50 42 42 42 42 42 42 42 50 
Phred software 
Seq 
Qual 
PHRED – lê o cromatograma e nomeia as bases. Cada base nomeada 
recebe uma pontuação correspondente à qualidade, de acordo com a 
fórmula: Q = -10 log p. Um valor de PHRED igual a 20 significa que a base 
apresenta 1 chance em 100 de estar errada. 
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Montagem das Sequências 
CAP3 – forma contigs (agrupamentos com mais de uma sequência) e 
singlets (sequências únicas). 
CAGGTATATCGATGCGTAGCATGCAA 
CAGGTATATCGATGCGTAGCATGCAA 
GGTACAGGTATATCGATGCGTAGCATGCAAGAAAAAAAAAAAGTTCC 
Fluoresceína absorve energia do laser 
incidente e transfere para o aceptoremite luz que é detectada por um 
fotomultiplicador 
 
 converte os fótons em corrente elétrica; a 
informação é passada para o computador 
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MegaBACE Run Image 
Tela do computador conectado ao sequenciador, mostrando a 
imagem da “corrida”. Eletroferograma mostrado na parte inferior da 
foto. 
Cromatograma 
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Benefícios do sequenciamento 
automático 
 Eliminação da montagem da placa e preparação do 
gel; 
 
 Aplicação das amostras por eletroinjeção; 
 
 Alta velocidade e resolução na preparação das 
amostras. 
 
 
Radioatividade X Fluorescência 
Aplicações 
Análise genômica 
Ciência forense Análise filogenética 
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Histórico: Década de 90 
 Fatores decisivos na década de 90: 
 - O aprimoramento de técnicas de mapeamento 
 - Automação de sequenciamento de DNA 
 - Formação de consórcios multinacionais 
 
 Projetos viabilizados: 
 - Projeto Genoma Humano (1990) 
 - Drosophila melanogaster (1991) 
 - Haemophilus influenzae (publicado em 1995) 
 - Saccharomyces cerevisiae (publicado em 1996) 
 - Escherichia coli (publicado em 1996) 
 - Caenorhabditis elegans (publicado em 1998) 
 
 
Explosão de Projetos Genoma 
 Camundongo 
 Rato 
 Chimpanzé 
 Arabidopsis 
thaliana 
 Abelha 
 Arroz 
 Diversas bactérias 
 
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Projetos Genoma Nacionais 
 Café 
 Xylella fastidiosa 
 Chromobacterium violaceum 
 Eucalipto 
 Camarão-branco 
 Soja 
 Schistossoma mansoni (Esquistossomose) 
 Leishmania sp (Leishmaniose) 
 Paracoccidioides brasiliensis - Centro-Oeste 
 Trypanosoma cruzi (Doença de Chagas) 
 Crinipellis perniciosa (Vassoura de Bruxa) 
 Cana-de-açúcar 
 
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GenBank 
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30 
Mutações Humanas 
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31 
Hemofilia 
Banco de dados: Esclerose amiotrófica 
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