Relatório biomol 2

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI 
ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA
DOCENTE: RAIMUNDO WAGNER..
PCR
Brenda Rodrigues Fernandes
Estefânia Andrade
Laryssa Marinho
Layanne Amanda
Rafael Batista
Thaís Rosa
GURUPI – TO
SETEMBRO - 2014
Brenda Rodrigues Fernandes; Estefânia Andrade; Laryssa Marinho; Layanne Amanda; Rafael Batista; Thaís Rosa
RELATÓRIO PRÁTICO DE BIOLOGIA MOLECULAR
 PCR
Trabalho apresentado à disciplina de Biologia Molecular na graduação de Engenharia dee Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Federal do Tocantins, como parte das exigências avaliativas da disciplina sob orientação do Profº Raimndo Wagner de Souza Aguiar.
	
GURUPI – TO
SETEMBRO DE 2014
INTRODUÇÃO
A molécula de DNA é o elemento base para a Biologia Molecular. Nela, estão contidas todas as informações sobre um ser vivo. Existem na literatura vários protocolos para extração de DNA genômico o qual é importante para realização de experimentos em biologia molecular, dentre eles a PCR (MESQUITA, 2001). 
Na técnica de Extração de DNA, principalmente DNA bacteriano, os processos utilizados visam, em um primeiro passo, a quebra da parede celular. As etapas seguintes a desnaturação da molécula de DNA, a separando de outros componentes celulares, como proteína e organelas, de forma a purificar essa molécula.
A reação em cadeia da polimerase é uma técnica in vitro que permite a amplificação de sequências específicas de DNA (MESQUITA, 2001). SANTOS (2011) afirmou que “o PCR utiliza-se de desoxinucleotideos como manômeros ate um ponto em que sua concentração em dada solução seja tão alta que possa ser facilmente detectável por métodos simples e clássicos de separação e identificação de substancias”. 
O pré-requisito essencial é a determinação da região do gene que será amplificada. Em seguida, são desenhados e sintetizados um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers) complementares às regiões flanqueadoras da sequência a ser amplificada em cada fita do DNA. Geralmente, primers específicos possuem tamanho entre 17 a 30 nucleotídeos, teor de GC entre 40 a 60% e não são auto-complementares ou complementares entre si.
Basicamente, a reação em cadeia da polimerase ocorre em 3 etapas, sendo a desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado, anelamento ou hibridização que consiste na ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado e extensão ou seja a polimerização propriamente dita.
A Eletroforese em gel de Agarose é uma técnica que permite a visualização de moléculas de acordo com seu tamanho e carga elétrica (SANDOVAL, 2009). Por ser uma técnica simples, rápida e de grande precisão, está atualmente muito infundida dentre as técnicas de análise molecular.
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria como a gelatina. Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel. Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de agarose. 
Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA maiores. A velocidade de migração de fragmentos de DNA lineares através da agarose é inversamente proporcional a log10 de seus pesos moleculares.
Figura 1 – Trechos de DNA observados após o processo de Eletroforese.
OBJETIVO
Realizar a extração do DNA da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), replicá-lo pela técnica do PCR e análisá-lo por meio da Eletroforese em gel de Agarose.
MATERIAIS
PCR
	-x µl de H2O de PCR estéril;
	-2,5 µl 10 x tampão de enzimático (10x);
	-2,0 µl dNTPs (2,5mM);
	-0,2 µl Primer 1 (10 µM);
	-0,2 µl Primer 2 (10 µM);
	-0,2 µl Taq (5U/µl);
	-1,0 µl de DNA.
Eletroforese em Gel de Agarose
	-1% gel de agarose;
	-2,0 µl do produto do PCR;
	-1,0 µl de tampão de corrida;
	-5 µl de 1 Kb ladder com corante;
	-1 x TBE.
PROCEDIMENTOS
A princípio, à prática procedeu-se com o DNA extraído da prática anterior no qual o DNA foi conservado no freezer. 
Para a reação de PCR
-Preparou-se um eppendorf para PCR com todos os reagentes descritos anteriormente, sendo último adicionados o DNA da bactéria Bt.
-O eppendorf foi levado para o termociclador previamente programado;
-A temperatura utilizada rotineiramente para esse tipo de solução é
Step 1:	80 C	1 min	Hot-Stat Manual
Step 2:	94 C	2 min	Desnaturação inicial
Step 3:	94 C	15 seg	Desnaturação do ciclo
Step 4:	55 C	1 min	Anelamento do primer
Step 5:	72 C	1 min/kbp	Extensão
Step 6:	 Go to step 2 x	35 cycles	Ciclos repetidos
Step 7:	72 C	20 min	Extensão final
Step 8:	12 C	Até parar a reação	
O gel de Agarose foi prepara de acordo com o seguinte protocolo:
-Pesou-se 0,8g de águar, a qual foi dissolvida em 20 ml de água destilada;
-A solução foi aquecida por 30 segundos no forno micro-ondas, sendo, em seguida, resfriada e colocada na cuba para solidificação.
Nos sulcos formados no gel de agarose, foram adicionados o DNA (2,0 µl do produto do PCR), 1,0 µl do tampão de corrida e 5,0 µl do corante, sendo, em seguida, ligado em voltagem 110 V por cerca de 30 minutos.
O gel, após a corrida do DNA, foi imerso em Brometo de Etídeo por 20 minutos e, após este tempo, colocado dentro da cuba para visualização fotográfica dos resultados.
Todo o procedimento foi feito em duplicata, ou seja, com duas amostras do mesmo DNA da bactéria Bt.