Apostila Criopreservação de Gametas e Micromanipulação

Prévia do material em texto

Curso Prático de Criopreservação de Gametas e Pré-embriões
Curso Prático de Micromanipulação de Gametas (ICSI)
Registro Latinoamericano(RLA)
Unidade de Reprodução Humana do Hospital Albert Einstein
e
Fertility
São Paulo – Brasil
Curso Prático de Criopreservação de Gametas e Pré-embriões
Curso Prático de Micromanipulação de Gametas (ICSI)
Registro Latinoamericano(RLA)
Local:
	Cidade de São Paulo
Centros:
Unidade de Reprodução Humana do Hospital Albert Einstein
	Fertility
Responsáveis
Dr Jonathas Borges Soares(Assessor de Embriologia da RED-Brasil)
Dr Edson Borges(Dir. Médico da Clínica de Reprodução Humana – Fertility)
Período
Dias 07 e 08 de dezembro de 1999
 
Convidados
		Tanit Sant’Anna (Miami-USA)
		Catalina Zuluaga (Bogotá-Colômbia)
		Marco Roberto de Mello (São Paulo-Brasil)
MANHÃ - 07/12/99
08:00-08:40 - Princípios Básicos da Criopreservação
08:40-09:20 – Técnica e Protocolos de Criopreservação de Espermatozóides
09:20-09:40 – Discussão
09:40-10:00 - Intervalo
10:00-10:40 – Princípios Básicos da ICSI
10:40-11:20 – Aparelhagem, materiais e meios para ICSI
11:20-11:40 – Discussão
11:40 - almoço
14:00-18:00 – Hands-on (grupo A – HIAE) (grupo B – Fertility)
MANHÃ - 08/12/99
08:00-08:40 - Técnica e Protocolos de Criopreservação de Pré-Embriões
08:40-09:20 – Técnica e Protocolos de Criopreservação Óvulos e Tecido Ovariano
09:20-09:40 – Discussão
09:40-10:00 - Intervalo
10:00-10:40 – Protocolos Pré-ICSI: Preparo dos Gametas
10:40-11:20 – Técnicas de Injeção, Fertilização e Assisted Hatching
11:20-11:40 – Discussão
11:40 - almoço
14:00-18:00 – Hands-on (grupo A – Fertility) (grupo B – HIAE)
PROFESSORES, AULAS E ENDEREÇOS
 07/12/99
08:00-08:40 - Princípios Básicos da Criopreservação
Professor: Dr. Marco Roberto de Mello
End: E-mail: mrbmello@usp.br
08:40-09:20 – Técnica e Protocolos de Criopreservação de Espermatozóides
Professor: Dra. Catalina Zuluaga
End: E-mail: catalina_zuluaga@hotmail.com
10:00-10:40 – Princípios Básicos da ICSI
Professor: Dra. Ana Renata Cordeiro de Medeiros
End: Av. Brigadeiro Luís Antônio 4251- São Paulo – Tel:887-0562
10:40-11:20 – Aparelhagem, materiais e meios para ICSI
Professor: Dra. Ana Renata Cordeiro de Medeiros
End: Av. Brigadeiro Luís Antônio 4251- São Paulo - Tel:887-0562
08/12/99
08:00-08:40 - Técnica e Protocolos de Criopreservação de Pré-Embriões
Professor: Dra. Tanit Sant’Anna
End: E-mail: RIOTANIT@aol.com
08:40-09:20 – Técnica e Protocolos de Criopreservação Óvulos e Tecido Ovariano
Professor: Dra. Roberta Wonchockier
End: Av. Albert Einstein 627, Sala 371 – Morumbi – São Paulo – Tel: 3747-1364
10:00-10:40 – Protocolos Pré-ICSI: Preparo dos Gametas
Professor: Dra. Françoise Elia Mizrahi
End: Av. Albert Einstein 627, Sala 371 – Morumbi – São Paulo - Tel: 3747-1364
10:40-11:20 – Técnicas de Injeção, Fertilização e Assisted Hatching
Professor: Dra. Claudia Chagas Rocha
End: Av. Brigadeiro Luís Antônio 4251- São Paulo- Tel:887-0562
ÍNDICE
Pág. 6 - PREPARO DE MEIOS DE CULTURA PARA OS PROCESSOS DE FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA							
Pág. 8 - RECUPERAÇÃO, CLASSIFICAÇÃO E PRÉ-INCUBAÇÃO DE OOCITOS NOS PROCESSOS DE REPRODUÇÃO/FERTILIZAÇÃO IN VITRO
Pág. 13 - PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE ESPERMATOZÓIDES PARA PROCEDIMENTOS DE REPRODUÇÃO/FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA
Pág. 19 - INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDES 
(ICSI)
Pág. 24 - CHECAGEM DE FERTILIZAÇÃO E CLIVAGEM, CULTURA E TRANFERÊNCIA DE EMBRIÕES
Pág. 33 - ASSISTED HATCHING (A.H.) QUÍMICO E A LASER
Pág. 37 - RETIRADA DE FRAGMENTOS
Pág. 44 - CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES ANIMAIS
(Aula: Dr. Marco Roberto Mello)
Pág. 50 - Criopreservação de Pré-embriões Humanos - HIAE
Pág. 52 - TÉCNICA DE CONGELAMENTO DE PRÉ – EMBRIÕES HUMANOS – HIAE
Pág. 56 - TÉCNICA DE DESCONGELAMENTO DE PRÉ – EMBRIÕES HUMANOS – HIAE
Pág. 63 - Técnicas e Protocolos de Criopreservação de Pré-Embriões
Pág. 60 - Congelamento de sêmen HUMANO - HIAE
PREPARO DE MEIOS DE CULTURA PARA OS PROCESSOS DE
FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA
OBJETIVOS:
Preparar os meios de cultura que serão utilizados nos processos de Fertilização Assistida.
AMOSTRA:
Todos os meios de cultura deverão ser preparados no dia anterior aos procedimentos ou com um período de no mínimo 8 horas de antecedência, em fluxo laminar, filtrados, e incubados a 37 º C e 5% CO2. 
MATERIAL:
 Human Tubal Fluid Media (HTF) - Irvine Scientific # 9962
 Modified HTF with HEPES Buffer (HTF/Hepes) - Irvine Scientific # 9963
 Liquemine 5.000 UI/ml (Heparina) - Roche
 Mineral Oil - Light White Oil (Óleo) - Sigma # 3516
 Hyaluronidase - Type VIII (Hialuronidase) - Sigma # H - 3757
 Polyvinylpyrrolidone (PVP) - Irvine Scientific # 99219
 Filtros 0,22 µ - Millipore # SVGS 01015, Millipore # SLGV 025 LS; Costar # 8110
 Synthetic Serum Substitute (SSS) - Irvine Scientific # 99193
 Pipetas 1ml, 2 ml, 5 ml e 10 ml - Stripette Costar # 4011, 4021, 4051 e 4101
 Tubos de centrífuga 15 ml e 50 ml - Costar # 3252 e 3217 
 Micropipeta 2 a 10 µl e 10 a 100 µl - Oxford
 Ponteiras para micropipeta 1 a 200 µl - Costar # 4864
 Pipetador automático - Drummond # Pipetaid
 Profasi 1.000 - Serono
 Metrodin 75 HP - Serono
 Incubadora, 37º C, 5% CO2, umidificada
 Estantes para tubos
 Fluxo Laminar
 Canetas marcadoras com tinta permanente de várias cores - Sharpie
 Seringas de 10 ml e 20 ml - BD
PROCEDIMENTOS:
Os meios de cultura deverão ser preparados em campânula com fluxo laminar, utilizando-se apenas materiais descartáveis e estéreis.
Os meios de cultura devem ser filtrados e identificados.
Verificar o período mínimo necessário para a estabilização de cada meio de cultura: 
meios “buffer “ (como HEPES), não devem ser gaseificados, apenas aquecidos, portanto ao serem guardados na incubadora, manter os tubos fechados.
os tubos de meios de cultura contendo HTF, deverão ser mantidos em incubadora pelo menos 8 horas antes da utilização, com a tampa solta.
MEIOS DE CULTURA:
Meio de incubação: HTF a 7,5% de SSS.
Meio de crescimento: HTF a 15% de SSS.
Hepes: HTF / HEPES a 10% de SSS.
Meio de aspiração (HTF/HEPES - 50 UI/ml de heparina): HTF/HEPES com 0,01 ml de heparina/ml de meio.
Meio de transferência: HTF a 50% de SSS.
Hialuronidase (80 U/ml): diluir 1 mg de hialuronidase em 4 ml de Hepes (preparar no dia do procedimento)
PVP (10%): adicionar 1 ml de HTF/Hepes ao frasco de PVP (não é necessário filtrar), pode ser utilizado durante 21 dias (armazenar entre 2º e 8º C).
Óleo mineral: colocar em um frasco ou tubo, sobre meio de cultura (aproximadamente 1/10 do volume de óleo).
Meio de maturação: meio de crescimento acrescido de 0,075 UI/ml de FSH (Metrodin) e 0,5 UI/ml de HCG (Profasi).
RECUPERAÇÃO, CLASSIFICAÇÃO E PRÉ-INCUBAÇÃO DE OOCITOS NOS PROCESSOS DE REPRODUÇÃO/FERTILIZAÇÃO IN VITRO
OBJETIVOS:
Localizar e avaliar os oocitos recuperados via aspiração folicular utilizados em FIV e outros procedimento.
Sendo o líquido folicular considerado como componente biológico contaminado, este deve ser manuseado com muito cuidado, com o uso de luvas, devendo todo o material deve ser descartado assim que possível.
AMOSTRAS:
Todo o material utilizado (placas, pipetas, etc.), deverá ser descartável e estéril, não devendo permanecer no laboratório após ser desprezado, a fim de evitar contaminação.
Material plástico como tubos e placas devem ser de poliestireno.
Os locais onde haverá manipulação de produtos e materiais, como bancada, fluxo laminar, isolete, microscópio e lupa, deverão ser limpos com água, antes de qualquer procedimento.
MATERIAL:
 Human Tubal Fluid Media (HTF) - Irvine Scientific # 9962
 Modified HTF with HEPES Buffer (HTF/Hepes) - Irvine Scientific # 9963
 Mineral Oil - Light White Oil (Óleo)- Sigma # 3516
 Hyaluronidase - Type VIII (Hialuronidase) - Sigma # H - 3757
 Filtros 0,22 µ - Millipore # SVGS 01015, Millipore # SLGV 025 LS; Costar # 8110
 Synthetic Serum Substitute (SSS) - Irvine Scientific # 99193
 Tissue culture dish - 60 x 15 mm (Costar # 3060) - dish simples
 IVF Culture Dish - 60 x 15 mm (Costar # 3260) - dish duplo fosso
 Pasteur Capillary Pipettes - 5 ¾ (Costar # 5005) - pipetas Pasteur
 Centrifuge tube - 15 ml - (Costar # 3217) - tubos de 15 ml
 Pipetas 1ml, 2 ml, 5 ml e 10 ml - Stripette Costar # 4011, 4021, 4051 e 4101
 Pipetador automático - Drummond # Pipetaid
 Coletor universal descartável, estéril, 80 ml (STLU II)
 Estereomicroscópio ( lupa)
 Isolete 37º C, 5% CO2 adaptada (com lupa em seu interior)
 Incubadoras 37º C, umidificada, 5% CO2
 Fluxo laminar
 Aquecedor de tubos
 Tubos de centrífuga 15 ml e 50 ml - Costar # 3252 e 3217 
 Micropipeta 2 a 10 µl e 10 a 100 µl - Oxford
 Ponteiras para micropipeta 5 a 10 µl e 1 a 200 µl - Costar # 4830 e 4864
 Estantes para tubos
 Fluxo Laminar
 Canetas marcadoras com tinta permanente de várias cores - Sharpie
 Seringas de 10 ml e 20 ml - BD
 Profasi 1.000 - Serono
 Metrodin 50 HP - Serono
MEIOS DE CULTURA:
Meio de incubação: HTF a 7,5% (de SSS).
Meio de crescimento: HTF a 15% (de SSS).
Meio de aspiração (HTF/HEPES - 50 UI/ml de heparina): HTF/HEPES com 0,01 ml de heparina/ml de meio.
Hepes: HTF / HEPES a 10% (de SSS).
Óleo mineral: colocar em um frasco ou tubo, sobre meio de cultura (aproximadamente 1/10 do volume de óleo).
Meio de maturação: meio de crescimento acrescido de 0,075 UI/mL de FSH (Metrodin) e 0,5 UI/mL de HCG (Profasi).
PREPARO DO MATERIAL:
Os “dishes” duplo fosso são preparados colocando-se 1 ml de meio de cultura no fosso interno e 2 ml no fosso externo.
Os meios de cultura são preparados no dia anterior ao procedimento (ou no mínimo com oito horas de antecedência), a fim de serem aquecidos e gaseificados adequadamente.
Hepes (meio “buffer”) não deve ser gaseificados, portanto os tubos devem permanecer fechados enquanto mantidos em incubadora.
Os tubos e “dishes” devem ser preparados no mínimo 30 minutos antes de cada procedimento.
Preparar tubos (aproximadamente 1 tubo a cada 2 folículos, previamente visualizado por Ultra-sonografia), contendo 0,5 ml de meio de aspiração. São estes tubos que serão acoplados ao sistema de punção, para coleta do líquido folicular que deverá conter os Complexos-Cumulus-Corona (COCs).
Preparar 1 “dish” duplo fosso contendo Hepes.
2 tubos com Hepes, aproximadamente 4 ml cada (1 deles, utilizados na separação dos COCs e outro para preparo do sêmen).
Serão necessário 1 “dish” contendo meio de incubação (sob óleo), onde serão mantidos os COCs após serem retirados do Hepes e mais 1 “dish” para cada conjunto de oocitos a serem inseminados (em geral grupos de 3 oocito/ “dish”).
Nos casos de ICSI, estes oocitos serão postos todos juntos após passarem por hialuronidase, neste caso, apenas 1 “dish” será utilizado.
Quando faz-se uso de microgotas (de 20 µl, 25 µl ou 50 µl, sob óleo), elas são dispostas em círculo, em um “dish” simples.
PROCEDIMENTO:
Os tubos com o líquido aspirado, deverão ser manipulados e seu conteúdo examinado em lupa (acoplada no interior de uma isolete) pelo pessoal de laboratório.
Agitar os tubos levemente (por inversão)
Colocar, aos poucos o líquido em um “dish” simples, observando a presença de estruturas semelhantes à clara de ovo, onde poderão estar contidos os oocitos.
Com uma pipeta Pasteur (preenchida com um pouco do Hepes já separado em um tubo), recolher esta estrutura e colocá-la em outro “dish” seco, para verificação mais precisa da presença do COC.
Classificar a morfologia do COC:
	GRAU I :
	uma a três camadas de células fortemente aderidas
	GRAU II : 
	células do cumulus, densas, fortemente aderidas
	GRAU III : 
	células expandidas, frouxamente aderidas
	GRAU IV :
	células muito expandidas e frouxas, parcialmente “perdidas” da corona
	ROTO(ZF) :
	zona pelúcida “ fraturada ”, com restos citoplasmáticos, em geral disformes
	ATRÉSICO (A):
	oocitos pequenos, escuros ou com bordas escuras e aspecto irregular
À medida que vão sendo identificados, colocar os COCs em um dish contendo Hepes.
Terminado o processo, transferir os COCs para um dish com meio de incubação (identificado com o nome da paciente) e incubar.
REGISTRO DE DADOS:
Os dados de cada procedimento são cuidadosamente anotados em formulário próprio como o que segue em anexo:
PACIENTE: ( ) - ANOS 
DATA: INDICAÇAO: PROCEDIMENTO: 
 
HORÁRIO DA PUNÇÃO: MÉTODO: 
	OVÁRIO D.
	OVÁRIO D.
	OVÁRIO D.
	OVÁRIO E.
	OVÁRIO E.
	OVÁRIO E.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
	FOL.
MORFOLOGIA DO COMPLEXO CUMULUS CORONA - OOCITO:
( ) CLASSE I ( ) CLASSE II
( ) CLASSE III ( ) CLASSE IV
( ) ROTO ( ) ___________ 
Nº DE FOLÍCULOS - OVÁRIO DIREITO: OVÁRIO ESQUERDO:
TOTAL DE FOLÍCULOS: TOTAL DE OOCITOS:
Nº DE CÉLULAS/CLASSE - COMENTÁRIOS:
	
	
	
	
PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE ESPERMATOZÓIDES PARA PROCEDIMENTOS DE REPRODUÇÃO/FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA
OBJETIVOS:
Preparo dos espermatozóides retirando-se o plasma seminal para inseminação dos oocitos em FIV ou ICSI.
AMOSTRAS:
Como todo material biológico, as amostras seminais devem ser consideradas componentes biológicos contaminados, devendo portanto ser manuseadas cuidadosamente, utilizando-se luvas descartáveis. Ao final dos procedimentos, todo o material utilizado deverá ser descartado.
A coleta da amostra deverá ser realizada em frasco de plástico estéril, obtida por masturbação ou material proveniente de punção ou extração testicular ou epididimária. Proceder a análise do ejaculado após período de liquefação de aproximadamente 30 minutos.
MATERIAL: 
 
 Percoll - Pharmacia # 17-0891-01
 Ham F-10 (1x) - Gibco BRL # 11550-035
 Ham F10 (10 x) - Irvine Scientific # 99141
 Modified HTF with HEPES Buffer (HTF/Hepes) - Irvine Scientific # 9963
 Synthetic Serum Substitute (SSS) - Irvine Scientific # 99193
 Coletor universal de plástico atóxico (poliestireno ou polipropileno), boca larga, 
 descartável e estéril 80 ml (STLU II)
 Pipetas 1ml, 2 ml, 5 ml e 10 ml - Stripette Costar # 4011, 4021, 4051 e 4101
 Tubos de centrífuga 15 ml e 50 ml - Costar # 3252 e 3217 
 Micropipeta 2 a 10 µl e 10 a 100 µl - Eppendorf
 Ponteiras para micropipeta 1 a 200 µl - Costar # 4864
 Pipetador automático - Drummond # Pipetaid
 Pipetas Pasteur (Pasteur Capillary Pipettes 5 ¾) - Costar # 5005
 Seringas de 10 ml e 20 ml - BD 
 Filtros 0,22 µ - Millipore # SVGS 01015, Millipore # SLGV 025 LS; Costar # 8110
 Adaptador para pipeta Pasteur ( The pipette pump E-37898 )
 Câmara de Makler - Sefi Medical Instruments, ou Micro Cell - ConceptionTechnologies
 Contador de células
 Lâmpada para aquecer a platina do microscópio, ou platina aquecedora
 Microscópio com contraste de fase - Nikon Optiphot
 Objetiva de 20 x, Ph 2 DL - Nikon
 Banho-maria com temperatura de 37º C
 Centrífuga
 Estufa à 37º C
 Estante para tubos
 Vórtex (agitador de tubos)
COLETA :
O paciente é orientado a permanecer em abstinência sexual de 2 à 5 dias antes da coleta. 
Deverá ser fornecido um coletor plástico, de boca larga, identificado com nome do paciente, data e hora da coleta.
Como regra, a coleta deverá ser realizada por masturbação em local apropriado e a amostra obtida deverá ser encaminhada ao laboratório imediatamente.
Em casos onde a coleta for realizada fora das dependências do laboratório, o paciente deverá receber a orientação devida, e trazer a amostra ao laboratório no máximo 45 minutos após.
O laboratório deverá ser informado em casos de perda do material e qual porção foi perdida.
Esta ocorrência deverá ser devidamente relatada e após a análise, se houver necessidade, será solicitada uma segunda coleta.
No laboratório, esta amostra deverá ser mantida à 37º C até sua liquefação a fim de evitar redução da motilidade.
Na ficha do paciente deverá constar os seguintes dados: 
tempo de abstinência
se houve ou não perda de material coletado
horário da coleta e do início do procedimento. 
PREPARO DOS MEIOS:
Hepes: HTF / HEPES à 10 % de SSS.
O meio deverá ser filtrado e armazenado à 37º C.
Solução mãe: 86,5 ml de Percoll + de 10 ml de Ham F-10 (10x).
Após o preparo, a solução deverá ser mantida sob refrigeração.
Gradientes descontínuos de densidade (70% e 95%): 
70 %: 7,0 ml de solução mãe + 3,0 ml de Ham F-10 (1x).
95 %: 9,5 ml de solução mãe + 0,5 ml de Ham F-10 (1x).
Os meios deverão ser armazenados em geladeira, porém para os procedimentos deverá estar à temperatura ambiente.
PROCEDIMENTO :
 ANÁLISE DA AMOSTRA: 
 
Homogeneizar a amostra após a liquefação em banho-maria 37º C (por um período de até 30 minutos).
Com o uso de uma pipeta graduada, medir o volume do material (que deverá ser anotado na folha de exames do paciente) e transferir para um tubo de 15 ml.
Com 5 µl da amostra, fazer a contagem em câmara de Makler ou Micro Cell, determinando a concentração à partir da contagem de 20 quadrículas.
Esta contagem deverá ser dividida por 2 (concentração direta em milhões/mL), a concentração total será obtida multiplicando-se o resultado pelo volume total da amostra.
Determinar a motilidade em toda a área da câmara, contando 100 espermatozóides, segundo a classificação:
	GRAU A: Motilidade rápida e progressiva.
GRAU B: Motilidade lenta e progressiva.
GRAU C: Motilidade não progressiva.
GRAU D: Imóvel.
Este resultado será registrado em porcentagem
Registrar todas as informações na folha contendo o nome e todos os dados do paciente.
MÉTODOS UTILIZADOS:
Em amostras seminais com concentração superior a 10 milhões de espermatozóides/amostra deverá ser realizado o “swim-up”.
Amostras seminais com concentração inferior a 10 milhões de espermatozóides/amostra serão preparadas por “sperm- wash” ou gradientes descontínuos de densidade.
Material proveniente de punção ou extração testicular preparado por “sperm-wash” ou mini-gradientes descontínuos de densidade (quando a concentração e motilidade forem altas), após maceração.
TÉCNICAS DE PREPARO:
 
“SWIM-UP”: 
Em um tubo de 15 ml colocar 1ml de Hepes.
Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, colocar no fundo do tubo, 1 ml de sêmen.
O tubo deverá ser apoiado em uma estante, formando um ângulo de 45º.
Incubar à 37º C por 1 hora.
Com o auxílio de uma Pasteur transferir o sobrenadante para outro tubo.
Incubar por 10 minutos.
Determinar a concentração e a motilidade final. 
SPERM WASH:
Em um tubo de 15 ml colocar 1ml de Hepes e sobre este, 1 ml de sêmen.
Agitar em vórtex.
Centrifugar à 1.000 r.p.m. por 8 minutos.
Com o auxílio de uma pipeta, desprezar o sobrenadante.
Adicionar 1 ml de Hepes e repetir os passos anteriores.
Após esta etapa, desprezar o sobrenadante.
Incubar por 10 minutos.
Determinar a concentração e a motilidade final.
 GRADIENTES DESCONTÍNUOS DE DENSIDADE (Percoll, ISolate, Pure Sperm, etc):
Pipetar cuidadosamente o gradiente 95 %.
Por cima deste, pela parede do tubo, pipetar o gradiente 70%.
Sobre estes, com uma pipeta Pasteur, colocar 1,0 ml do sêmen.
Centrifugar por 30 minutos a 1.000 r.p.m.
Cuidadosamente retirar o “pellet” (precipitado contendo os espermatozóides após centrifugação) e transferir para outro tubo.
Acrescentar 1,0 ml de Hepes.
Ressuspender o “pellet” e colocar para centrifugar 8 minutos a 2.000 r.p.m.
Repetir esse mesmo processo por duas vezes, retirando todo o sobrenadante. 
Determinar a concentraçao e a motilidade final.
Registrar na folha do paciente.
Deixar o material em incubadora até a hora da inseminação ou ICSI.
 PREPARO DE ESPERMATOZÓIDES TESTICULAR OU EPIDIDIMÁRIO:
Estes espermatozóides poderão ser provenientes de:
Epidídimo: 
MESA: microsurgical epididymal sperm aspiration (aspiração espermática epididimária microcirúrgica).
PESA: percutaneous epididymal sperm aspiration (aspiração espermática epididimária percutânea).
Testículo:
TESA: testicular sperm aspiration (aspiração testicular de espermatozóides).
TESE: testicular sperm extration (extração testicular de espermatozóides).
Deferente:
DESA: deferential sperm aspiration (aspiração espermática de deferentes).
Além de espermatozóides, também são obtidas espermátides, que em determinadas circunstâncias poderão ser utilizadas. São elas:
maduras (alongadas)
redondas
alongando-se
alongadas
Após a coleta, a amostra é transferida para um “dish” simples contendo entre 3 e 5 ml de Hepes.
Este material deverá ser examinado em microscópio quanto à presença de espermatozóides.
Em seguida, com o auxílio de seringas de 1,0 ml o material macerar o material.
Transferir o conteúdo do “dish” para um tubo de 15 ml.
Adicionar 1ml de Hepes.
Proceder como nas etapas 3 a 9 de “SPERM-WASH” (descrito acima)
Desprezar o sobrenadante.
Nos casos onde a concentração espermática é grande, poderão ser utilizados os gradientes descontínuos de densidade (já descritos).
Vide protocolos de MATURAÇÃO DE ESPERMÁTIDE e COLAGENASE.
INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDES 
(ICSI)
OBJETIVOS:
Fertilizar os oocitos mecanicamente, mediante a injeção de um único espermatozóide no interior do ooplasma.
AMOSTRAS:
Oocitos puncionados através de ultra-sonografia via transvaginal (vide: RECUPERAÇÃO, CLASSIFICAÇÃO ... IN VITRO).
Amostra de sêmen coletados e capacitados para ICSI (vide: PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE SÊMEN PARA FERTILIZAÇÃO DE OOCITOS)
MATERIAIS:
 Human Tubal Fluid Media (HTF) - Irvine Scientific # 9962
 Modified HTF with HEPES Buffer (HTF/HEPES) - Irvine Scientific # 9963
 Óleo (Mineral Oil - Light White Oil) - Sigma # 3516
 Sêmen processado
 Filtros 0,22 µ - Millipore # SVGS 01015, Millipore # SLGV 025 LS; Costar # 8110
 SSS (Synthetic Serum Substitute) - Irvine Scientific # 99193
 Micropipeta 2 a 10 µl e 10 a 100 µl
 Ponteiras para micropipeta 1 a 200 µl - Costar # 4864
 Multidish 4 Wells Nunclon (placa Nunc) - Delta S I # 031754
 Tools of Discovery (placa de ICSI) - Falcon # 1006
 Pipetas 1 ml, 2 ml, 5 ml e 10 ml - Stripette Costar # 4011, 4021, 4051 e 4101
 Pipetas Pasteur (Pasteur Capillary Pipettes 5 ¾) - Costar # 5005
 Tubos de centrífuga 15 ml e 50 ml - Costar # 3252 e 3217 
 Pipetador automático - Drummond # Pipetaid
 Cateter de transferência (Set O.P.S.) - C.C.D. # 1308000
 Incubadora, 37º C, 5% CO2, umidificada
 Estantes para tubos
 Fluxo laminar horizontal
 Canetas marcadoras com tinta permanente de várias cores - Sharpie
 Seringas de 10 ml e 20 ml - BD
 Hialuronidase (Hyaluronidase - Type VIII) - Sigma # H - 3757
 PVP (Polyvinylpyrrolidone) - Irvine Scientific # 99219
 Micropipeta de ICSI(D.I. 4 -5 µm, D.E. 6-7 µm) - Cook # K-MPIP - 1035
 Holding (D.I. 20-25 µm, D.E. 100-120 µm) - Cook # K-HPIP - 1035
 Isolete 37º C, 5% CO2 adaptada com lupa (estereomicroscópio), em seu interior 
 Microscópio invertido - Nikon # Eclipse TE 300
 Platina e Sistema de Aquecimento: Fryer A 50
 Contraste de Fase: Hoffman (BF, HMC - 10, HMC - 20, HMC - 40)
 Ocular: CFW 10x
 Objetivas: 4x, 10x, 20x, 40x 
 Sistema Micromanipulador: Nikon / Narishige- Série NT 88
 Microinjetor: IM - 188
 Controles Hidráulicos: 2 A 4
 Microinjetor: IM - 6
 Joystick: MO - 189
 Motor: MM - 188
MEIOS DE CULTURA:
Meio de incubação: HTF a 7,5% de SSS.
Meio de crescimento: HTF a 15% de SSS.
Hepes: HTF/Hepes a 10% de SSS.
Meio de transferência: HTF a 50% de SSS.
Hialuronidase (80 U/ml): diluir 1 mg de hialuronidase em 4 ml de Hepes (preparar no dia do procedimento)
PVP (10%): adicionar 1 ml de HTF/HEPES ao frasco de PVP (não é necessário filtrar), pode ser utilizado durante 21 dias (armazenar entre 2º e 8º C).
Óleo mineral: colocar em um frasco ou tubo, sobre meio de cultura (aproximadamente 1/10 do volume de óleo).
Meio de maturação: meio de crescimento acrescido de 0,075 UI/ml de FSH (Metrodin) e 0,5 UI/ml de HCG (Profasi).
PREPARO DO MATERIAL:
Placa de hialuronidase: 0,5 ml de hialuronidase (preparada previamente) no fosso nº 1 e nos demais (2, 3 e 4), 0,5 ml de Hepes (todos sob óleo).
“Dish” duplo: 1,0 ml de meio no fosso central e 2,0 ml nos fossos externos. 
São utilizados ao todo três “dishes”: 1 contendo Hepes, 1 com meio de incubação (neste caso, sob óleo) e 1 com meio de transferência
“Dish” simples (placas para cultivo em microgota): gotas de 25 µl de meio de incubação ou crescimento, sob 15 ml de óleo.
“Dish” de micromanipulação: são feitas gotas contendo 4 µl de Hepes para manipulação dos oocitos, dispostos ao redor de outra gota contendo 4 µl de PVP e 2 µl de sêmen preparado (vide: PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE ESPERMATOZÓIDES PARA PROCEDIMENTOS DE REPRODUÇÃO /FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA).
PROCEDIMENTO:
 A) LIMPEZA E CLASSIFICAÇÃO DOS OOCITOS:
Os complexos cumulus-corona (COCs) recuperados, devem permanecer em meio de incubação entre 3 e 5 horas após a punção.
Preparar as pipetas Pasteur, afilando-as em chama, de maneira que seu diâmetro seja ligeiramente maior que o oocito, para que através de movimentos de “entra e sai”, as células sejam completamente removidas, sem que com isto, haja lesão no oocito.
O tamanho desta abertura deverá diminuir à medida que os oocitos vão sendo passados de um fosso a outro.
Após o período de incubação, os COCs são transferidos para a placa contendo hialuronidase, passando pelo fosso Nº 1 (entre 30 e 60 segundos), e em seguida pelos demais, até que haja completa remoção das células que envolvem a zona pelúcida.
Limpar mecanicamente com pipeta Pasteur afilada, passando de fosso em fosso, para completa remoção de células e da enzima.
Após a limpeza, classificar os oocitos quanto ao grau de maturação:
	M II (Metáfase II)
M I (Metáfase I )
P I (Prófase ) 
	: Presença de um corpúsculo polar extruso (maduros).
: Ausência de corpúsculo polar e vesícula germinativa.
: Presença de vesícula germinativa. 
Após esta etapa, transferir os oocitos para o “dish” contendo os meio de crescimento e maturação até a hora da injeção.
Injetar apenas os oocitos MII.
Obs: Procedimentos para oocitos imaturos estão especificados (vide: MATURAÇÃO DE OOCITOS IN VITRO).
 
B) PREPARO DO MICROMANIPULADOR:
Preparar previamente o micromanipulador, certificando-se que o contraste de Hoffman esteja corretamente ajustado e que as seringas das canetas injetoras estão preenchidas com óleo.
Acoplar as micropipetas Holding e ICSI, posicionando-as de forma que a parte mais afilada esteja paralela à platina do microscópio.
Ajustar a partir da objetiva de menor aumento (4x) até o maior (40x).
C) PREPARO DAS PLACAS DE ICSI:
Preparar a placa antes da realização do ICSI.
No centro do dish de ICSI, colocar uma gota de 4 µl de Hepes, a qual deverá ser levemente espalhada.
Ao redor da gota central, colocar uma gota de 4 µl de Hepes/oocito a ser micromanipulado.
Retirar a gota central e em seu lugar, colocar 4 µl de PVP e no centro deste, 2 µl de sêmen preparado (com concentração de aproximadamente 5 milhões/ml).
Numerar as gotas (para os oocitos) com caneta escrita fina.
Cobrir com óleo.
Colocar 1 oocito (MII) em cada gota.
Em caso de ICSI com pequena quantidade de células (TESA ROSI, etc.), preparar algumas gotas do material (sem PVP) para aumentar a área de busca, após encontradas, estas células deverão ser “limpas” em uma gota de Hepes, e transferidos para a gota de PVP na hora da injeção.
D) REALIZAÇÃO DO ICSI:
Realizar o ICSI entre 3 e 6 horas após punção.
No microscópio, focar a gota central.
Abaixar as micropipetas de ICSI e Holding.
Preencher a micropipeta de ICSI com um pouco PVP (aproximadamente 300 µ a partir do bisel).
Em aumento de 400x, localizar o espermatozóide, quebrando a cauda , aspirando-o 
Levantar a micropipeta de ICSI.
Focar o oocito, abaixar a holding e micropipeta de injeção, observando se estas estão no mesmo foco do oocito.
Prender o oocito com a holding, localizando o corpúsculo polar em 6 ou 12 horas.
Aproximar a micropipeta de ICSI, encostando-a no oocito.
Soltar levemente o espermatozóide até que ele esteja na ponta da agulha.
Com movimentos firmes porém delicados, perfurar o oocito, fazendo leve aspiração do citoplasma a fim de verificar se houve a ruptura do oolema.
Liberar rapidamente o espermatozóide no interior da célula, retirando em seguida a micropipeta de ICSI.
E) INCUBAÇÃO DOS OOCITOS E CHECAGEM DE FERTILIZAÇÃO:
Após o ICSI, retirar os oocitos das microgotas e transferí-los para a placa contendo meio de crescimento.
Checar os oocitos entre 14 e 20 horas após injeção.
24 horas após a fertilização, checar clivagem (vide: CHECAGEM DE FERTILIZAÇÃO DE OOCITOS E CULTURA DE EMBRIÕES).
CHECAGEM DE FERTILIZAÇÃO E CLIVAGEM, CULTURA E TRANFERÊNCIA DE EMBRIÕES
OBJETIVOS:
Acessar a fertilização dos oocitos, assim como a clivagem dos embriões.
AMOSTRA:
Serão observados os oocitos inseminados ou microinjetados entre 12 e 20 horas, quando os pronúcleos estão visíveis, os pré-embriões nos D+2 e D+3 pós punção.
MATERIAIS:
 Human Tubal Fluid Media (HTF) - Irvine Scientific # 9962
 Mineral Oil - Light White Oil (Óleo) - Sigma # 3516
 Filtros 0,22 µ - Millipore # SVGS 01015, Millipore # SLGV 025 LS; Costar # 8110
 SSS (Synthetic Serum Substitute) - Irvine Scientific # 99193
 Pipetas 1ml, 2 ml, 5 ml e 10 ml - Stripette Costar # 4011, 4021, 4051 e 4101
 Tubos de centrífuga 15 ml e 50 ml - Costar # 3252 e 3217 
 Tissue culture dish 60 x 15 mm (“dish” simples) - Costar # 3060 
 IVF Culture Dish 60 x 15 mm (“dish” duplo fosso) - Costar # 3260
 Ponteiras para micropipeta 1 a 200 µl - Costar # 4864
 Micropipeta 10 a 100 µl - Oxford
 Pasteur Capillary Pipettes 5 ¾ (Pipetas Pasteur) - Costar # 5005
 Pipetador automático - Drummond # Pipetaid
 Incubadora, 37º C, 5% CO2, umidificada
 Estantes para tubos
 Fluxo Laminar
 Canetas marcadoras com tinta permanente de várias cores - Sharpie
Seringas de 10 mL e 20 mL - BD
Estereomicroscópio ( lupa)
Isolete 37º C, 5% CO2 adaptada (com lupa em seu interior)
Incubadoras 37º C, umidificada, 5% CO2
Microscópio invertido com ocular: CFW 10x - Nikon # Eclipse TE 300
Contraste de Fase: Hoffman (BF, HMC - 10, HMC - 20, HMC - 40)
Platina e Sistema de Aquecimento: Fryer A 50
Set T.D.T.(cateter de transferência) - C.C.D. # 1308000
MEIOS DE CULTURA:
Meio de crescimento: HTF a 15% de SSS.
Meio de transferência: HTF a 50% de SSS.
Óleo: colocar em um frasco ou tubo, sobre meio de cultura (aproximadamente1/10 do volume de óleo).
PREPARO DE PLACAS:
Preparar placas de cultivo como a seguir: 
FIV - preparar “dishes” com microgotas de 25 µl de meio de crescimento (sob óleo), onde serão cultivados os oocitos de D+1 à transferência. 
ICSI - a checagem é feita no mesmo “dish” onde foram postos os oocitos após ICSI.
TRANFERÊNCIA – em um “dish” duplo fosso
PROCEDIMENTO:
 CHECAGEM DE FERTILIZAÇÃO PARA FIV CONVENCIONAL:
Este procedimento é realizado em 2 etapas, e ocorre entre 16 e 20 horas após inseminação (D+1).
Primeiramente devemos retirar as células do complexo oocito cumulus-corona (COCs) aderidas no oocito.
Utilizando-se uma pipeta Pasteur com ponta afilada, aspirar e soltar os oocitos em movimentos contínuos até que haja a remoção completa das células.
Os oocitos são limpos um a um, e ao final, são levados ao microscópio para checagem da fertilização.
Após sua identificação deverão ser separados em grupos: não fertilizados, 1PN, 2PN, etc.
Com o auxílio da lupa, remover as células do COC, passando várias vezes os oocitos por uma pipeta Pasteur com abertura afilada.
Após a identificação, os oocitos fertilizados devem ser transferidos para dishes duplo fosso, e recolocados em incubadora.
CHECAGEM DE FERTILIZAÇÃO PARA ICSI:
A checagem dos oocitos de ICSI deve ser realizada rapidamente.
O oocitos são observados em microscópio invertido, com aumento de 400 x.
Analisar atentamente a presença, forma e número de pronúcleos, corpúsculos polares, etc.
Cada característica (vide ítem D) deverá ser anotada no formulário da paciente.
CLIVAGEM:
A observação da evolução embrionária é muito importante, pois é ela que indicará como este está se desenvolvendo.
Estas observações são realizadas no segundo e terceiro dia após injeção.
Os embriões com velocidade de clivagem adequada, devem ter entre 2 e 4 células no dia + 2 e entre 6 e 8 células no dia + 3.
Deve-se anotar também os casos onde não houve clivagem (NC).
D) CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES A SEREM OBSERVADAS: 
Tanto para FIV quanto para ICSI, é muito importante que sejam anotadas todas as características observadas:
QUANTO AOS CORPÚSCULOS POLARES: presença de 1 ou 2 corpúsculos polares.
QUANTO AOS PRONÚCLEOS:
Não fertilizado: ausência de pronúcleos
2PN (fertilizado normalmente): presença de 2 pronúcleos regulares e 2 corpúsculos polares.
Fertilizados anormalmente: 
1PN (haplóide): presença de apenas 1 pronúcleo
3PN (triplóide): 3 pronúcleos
Poliplóide: mais que 3 pronúcleos
2
 PN (1c.p.)
 
..
..
2
 PN (2c.p.)
 
..
..
 
..
3
 PN (2c.p.)
..
..
..
Um outro tipo de classificação que vem sendo atualmente utilizada, está relacionada com detalhes da formação dos pronúcleos e citoplasma propondo um “score” para os pré-embriões normalmente fertilizados:
 juntos/alinhados 5 pontos 
Pronúcleos: 
 separados/irregulares 1 ponto 
 
 
 alinhados: 5 pontos 
Nucléolos: alinhando-se 4 pontos 
 
 espalhados 3 pontos 
 
 
 heterogêneo (halo claro periférico, e/ou ao redor dos PNs): 5 pontos Citoplasma: 
 homogêneo: (citoplasma escuro ou com “cicatrizes”): 3 pontos
A característica de cada oocito inseminado ou micromanipulado deverá ser anotada.
A checagem deve ser realizada o mais rápido possível, evitando eu os oocitos fiquem fora de seu ambiente de cultivo por um período prolongado, pois poderá ter seu desenvolvimento comprometido.
Retornar os “dishes” para a incubadora.
As características anotadas durante as fases de desenvolvimento, associadas à informações sobre suas características genéticas, são de grande importância para a seleção dos pré-embirões e algumas delas estão relacionadas abaixo:
Em um mesmo relatório, deverão ser anotadas as característica e desenvolvimento dos pré-embriões (diariamente), para que se possa ter uma idéia global de sua evolução, como no formulário a seguir:
 
PACIENTE: ( ) - ANOS 
 MARIDO: DATA:
 HORA DA PUNÇÃO: HORA DA ICSI: INTERVALO:
 T = Transf. C = Cong. N.T. = Não Transf. D = Desp. A.H. = Assiste Hatching C.C. = Cocult.
	PL. 
	Nº
	CLASSIFICAÇAO (OBS.)
	DIA + 1
	DIA + 2
	DIA + 3
	DIA+ :LEITURA ADICIONAL
	OBS.
	
	
1
	
MII
	2PN 
(1 + 4 + 3)
	
2cels CL I BI
	
8cels CL IBI
	______
	A.H. T
	 
	
2
	
MII
	
1PN (2c.p.)
	
NC
	______
	______
	
D
	 
	
3
	
MII
	
NF
	______
	______
	______
	
D
	
	
4
	
MII
	2PN
(5 + 3 + 5)
	
4cels CL I A
	
6cels CL I A
	______
	A.H.
T
	
	
5
	
MII
	
3PN (1c.p.)
	______
	______
	______
	
D
QUANTO À MORFOLOGIA:
Classe I A: Blastômeros regulares sem fragmentação. 
Classe I B: Blastômeros regulares com < 10 % de fragmentação.
Classe II B: Blastômeros regulares com < 20 % de fragmentação. 
Classe II C: Blastômeros regulares com fragmentação entre 20% e 50%. 
Classe II D: Blastômeros regulares com > 50% de fragmentação. 
Classe III A: Blastômeros irregulares sem fragmentação.
Classe III B: Blastômeros irregulares com < 10 % de fragmentação. 
Classe IV B: Blastômeros irregulares com < 20 % de fragmentação. 
Classe IV C: Blastômeros irregulares com fragmentação entre 20% e 50%. 
Classe IV D: Blastômeros irregulares com > 50% de fragmentação.
QUANTO AO TIPO DE FRAGMENTAÇÃO:
TIPO I:
Característica: volume mínimo de fragmentação.
Origem: está relacionada à uma única célula ou fragmentação do 1º ou 2º corpúsculo polares.
Importância: INSIGNIFICANTE.
TIPO II:
Característica: localiza-se na cavidade de clivagem, associada a blastômeros de tamanho e forma regulares.
Origem: fragmentação completa de uma ou mais células.
Importância: NÃO PERTURBA A ORGANIZAÇÃO DOS DEMAIS BLASTÔMEROS.
TIPO III:
Característica: pequenas e dispersas por toda a cavidade de clivagem, não variando muito seu tamanho e forma.
Origem: inicia-se durante a citocinese, a partir de pequenas vesículas citoplasmática e aumentam de acordo com as sucessivas divisões.
Importância: NÃO AFETA O POTENCIAL EMBRIONÁRIO, ESPECIALMENTE APÓS REMOÇÃO DE FRAGMENTOS.
TIPO IV:
Característica: possuem tamanho igual ou próximo ao dos blastômeros, sendo assim, é difícil sua diferenciação.
Origem: à partir da divisão celular desigual ou perda durante a intérfase. 
Importância: COMPROMETE O DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO, MESMO COM A RETIRADA DE FRAGMENTOS.
TIPO V:
Característica: associado à blastômeros com citoplasma muito granuloso ou contraído, ou com o limite entre as células não muito claro ou definido.
Origem: devido a processos de necrose celular.
Importância: NÃO POSSUI POTENCIAL DE DESENVOLVIMENTO, MESMO COM < 20% DE FRAGMENTAÇÃO. 
ANOMALIAS:
ANOMALIAS CROMOSSÔMICAS EM EMBRIÕES HUMANOS:
	
	FIV:
	A MAIORIA MOSAICOS
	3PN:
	
	
	
	ICSI:
	GERALMENTE TRIPLOIDIA
	
	FIV:
	A MAIORIA NORMAIS, QUANDO CLIVAM
	1PN:
	
	
	
	ICSI:
	HAPLÓIDE
	 
PNs irregulares:
	
	
87 % ANORMAIS
	
0 PN:
	
	
43 % ANORMAIS
	
	FIV:
	13 % NORMAISICSI:
	21 % NORMAIS
	
	3PN:
	
	
	
	
	QUANTO AO
	1 C.P.
	16 % NORMAIS
	
	CORPÚSCULO 
	2 C.P.
	25 % NORMAIS
	
	POLAR (C.P.)
	C.P. FRAGMENTADO
	10 % NORMAIS
	
	FIV:
	50 % NORMAIS
	
	1PN:
	
	
	
	
	ICSI:
	30 % NORMAIS
	
ANOMALIAS EM EMBRIÕES CLIVADOS:
	FRAGMENTAÇÃO:
	60 % ANORMAIS, SE > 20 % DE FRAGMENTAÇÃO
	CÉLULAS BINUCLEADAS:
	A MAIORIA NORMAIS
	CÉLULAS MULTINUCLEADAS:
	74 % ANORMAIS
	EMBRIÕES GIGANTES:
	TAMANHO > 220 µm, SEMPRE TRIPLÓIDE
	UM ÚNICO BLASTÔMERO DOMINANTE:
	SEMPRE POLIPLÓIDE
TAXAS DE CLIVAGEM:
	DO TOTAL DE EMBRIÕES PARAM A CLIVAGEM:
	> 70 % ANORMAIS
	COM DESENVOLVIMENTO LENTO:
	 50 % ANORMAIS
	COM DESENVOLVIMENTO NORMAL:
	 30 % ANORMAIS
 E) TRANSFERÊNCIA:
A transferência poderá ser realizada nos estágios de pronúcleo ou clivagem.
Somente devem ser transferidos os embriões com características normais.
Transferir os embriões para dish duplo fosso com meio de transferência (não deve estar sob óleo).
Aspirar em uma seringa de insulina um pouco de meio de transferência ( 0,5 ml).
Retirar o ar de seu interior.
Acoplar o cateter de transferência.
Lavar o cateter (interiormente) com o meio já aspirado na seringa, deixando no interior desta, aproximadamente 0,1 ml de meio de transferência, aspirar um pouco de ar, meio com os embriões, ar, meio (totalizando um volume final de 0,2 ml).
ASSISTED HATCHING (A.H.) QUÍMICO E A LASER
OBJETIVOS:
Criar uma abertura artificial na zona pelúcida, nos seguintes casos:
Mulheres com idade maior ou igual a 37 anos.
Mulheres com idade inferior a 37 anos, porém com falha de implantação.
FSH elevado (> 17 mUI/ml).
Embriões com zona pelúcida espessa (espessura = 16 µm ou superior).
Para retirada de fragmentos.
Em casos onde será realizado o diagnóstico genético pré-implantacional.
AMOSTRA:
Embriões no dia 3 (em embriões com 6 células ou mais). 
MATERIAL:
 Modified HTF with HEPES Buffer (HTF/Hepes) - Irvine Scientific # 9963
 Óleo (Mineral Oil - Light White Oil) - Sigma # 3516
 Filtros 0,22 µ - Millipore # SVGS 01015, Millipore # SLGV 025 LS; Costar # 8110
 SSS (Synthetic Serum Substitute) - Irvine Scientific # 99193
 Tyrode’s Solution Acidified, pH 2.1-2.5(Tyrode’s) - Irvine Scientific # 99252
 Micropipeta 2 a 10 µl e 10 a 100 µl
 Ponteiras para micropipeta 1 a 200 µl - Costar # 4864
 Tools of Discovery (placa de ICSI) - Falcon # 1006
 Pipetas 1 ml, 2 ml, 5 ml e 10 ml - Stripette Costar # 4011, 4021, 4051 e 4101
 Pipetas Pasteur (Pasteur Capillary Pipettes 5 ¾) - Costar # 5005
 Tubos de centrífuga 15 ml e 50 ml - Costar # 3252 e 3217 
 Pipetador automático - Drummond # Pipetaid
 Incubadora, 37º C, 5% CO2, umidificada
 Estantes para tubos
 Fluxo Laminar
 Canetas marcadoras com tinta permanente de várias cores - Sharpie
 Seringas de 10 mL e 20 mL - BD
 Micropipeta de A.H. (D.I. 10 µm, D.E. 14 µm) - Cook # K-AHP - 2035
 Holding (D.I. 20-25 µm, D.E. 100-120 µm) - Cook # K-HPIP - 1035
 Isolete 37º C, 5% CO2 adaptada com lupa (estereomicroscópio), em seu interior 
 Microscópio invertido - Nikon Eclipse # TE 300
 Platina e Sistema de Aquecimento: Fryer A 50
 Contraste de Fase: Hoffman (BF, HMC - 10, HMC - 20, HMC - 40)
 Ocular: CFW 10x
 Objetivas: 4x, 10x, 20x, 40x 
 Sistema Micromanipulador: Nikon / Narishige - Série NT 88
 Microinjetor: IM - 188
 Controles Hidráulicos: 2 A 4
 Microinjetor: IM - 6
 Joystick: MO - 189
 Motor: MM - 188
 Fertilase (“1,48 µm diode laser” - InGaAsP), Medical Technologies
 Monitor de TV calibrado
 Câmera acoplada ao microscópio
 Caneta de micromanipulação
MEIOS DE CULTURA:
Hepes: HTF / HEPES a 10% de SSS.
Óleo mineral: colocar em um frasco ou tubo, sobre meio de cultura (aproximadamente 1/10 do volume de óleo).
A) A.H. QUÍMICO:
PREPARO DA PLACA:
O “dish” de A.H. consiste de uma placa de micromanipulação, onde são dispostas gotas contendo 5 µl de Hepes para manipulação dos embriões, dispostos ao redor de outra gota contendo 5 µl de Tyrode’s.
CANETA DE MICROMANIPULAÇÃO:
A caneta utilizada para acoplar a micropipeta de biópsia é uma caneta comum de micromanipulação, da qual retira-se a mangueira plástica, e em seu lugar coloca-se a de borracha. Nesta pode-se utilizar filtros, e na extremidade oposta, um bocal rígido, como ponteiras de micropipetas, etc., pois a retirada dos blastômeros não é feita com o auxílio do sistema hidráulico de seringa como para o ICSI, mas sim com a boca.
AJUSTE DO MICROMANIPULADOR:
O ajuste do microscópio deverá ser igual ao realizado para os procedimentos de ICSI.
A micropipeta de A.H. deverá ser posta na caneta já acoplada à mangueira de borracha.
Verificar se a temperatura do Fryer está em 37º C.
Ao fazer o ajuste das micropipetas, certificar-se de que estas estejam paralelas à platina do microscópio, para que suas extremidade localizem-se no mesmo plano que a célula a ser manipulada. 
PROCEDIMENTO:
Esta operação é realizada com a boca (de forma semelhante à biópsia de blastômeros), utilizando-se uma pipeta de A.H., a qual deverá ser preenchida com Tyrode’s. 
Com o embrião preso pela Holding, aproximar a pipeta de A.H., fazendo movimentos de vai-e-vem ao longo da zona pelúcida, realizando uma abertura de aproximadamente  20µm, através da liberação de pequena quantidade da solução (1 a 2 µl no máximo).
	
	
Após a abertura, fazer leve aspiração no local para retirar qualquer vestígio de solução no interior do embrião, e com o auxílio da Holding, transportar o embrião para outro lugar da gota.
Lavar o embrião 3 a 4 vezes no meio onde estava sendo cultivado, incubando-o novamente.
A.H. LASER:
PREPARO DA PLACA:
A placa a ser utilizada, quando for realizado apenas para transferência, poderá ser a mesma onde os embriões estão sendo cultivados.
Nos casos onde será realizada a retirada de fragmentos ou biópsia, deve ser preparada da mesma maneira que para o A.H. químico.
PROCEDIMENTO:
Verifica se a demarcação no monitor coincide com o local de incidência da luz piloto.
Verificar se o tempo de exposição está correto (entre 8 e 10 milisegundos).
Posicionar o alvo desejado no ponto indicado na tela
Através do pedal ou controle manual, faz-se o disparo, que ocasionalmente pode ser repetido, dependendo da resistência e espessura da zona pelúcida.
RETIRADA DE FRAGMENTOS
OBJETIVOS:
Retirar os fragmentos formados no espaço perivitelínico os quais poderão comprometer o desenvolvimento embrionário.
AMOSTRA:
Embriões no 3º dia pós punção previamente selecionados para transferência ou embriões pós descongelamento e que possuam:
fragmentação >10%.
nº de blastômeros >6. 
quando a fragmentação localiza-se entre os blastômeros, de forma que possa impedir sua adesão e compactação.
blastômeros degenerados após descongelamento. 
blastômero
 degenerado
MATERIAL:
 Modified HTF with HEPES Buffer (HTF/HEPES) - Irvine Scientific # 9963
 Óleo (Mineral Oil - Light White Oil) - Sigma # 3516
 Filtros 0,22 µ - Millipore # SVGS 01015, Millipore # SLGV 025 LS; Costar # 8110
 SSS (Synthetic Serum Substitute) - Irvine Scientific # 99193
 Tyrode’s Solution Acidified, pH 2.1-2.5(Tyrode’s) - Irvine Scientific # 99252
 Micropipeta 2 a 10 µl e 10 a 100 µl
 Ponteiras para micropipeta 1 a 200 µl - Costar # 4864
 Tools of Discovery (placa de ICSI) - Falcon # 1006
 Pipetas 1 ml, 2 ml, 5 ml e 10 ml - Stripette Costar # 4011, 4021, 4051 e 4101
 Pipetas Pasteur (Pasteur Capillary Pipettes 5 ¾) - Costar # 5005
 Tubos de centrífuga 15 ml e 50 ml - Costar # 3252 e 3217 
 Pipetador automático - Drummond # Pipetaid
 Incubadora, 37º C, 5% CO2, umidificada
 Estantes para tubos
 Fluxo Laminar
 Canetas marcadoras com tinta permanente de várias cores - Sharpie
 Seringas de 10 ml e 20 ml - BD
 Micropipeta de A.H. (D.I. 10 µm, D.E. 14 µm) -Cook # K-AHP - 2035Holding (D.I. 20-25 µm, D.E. 100-120 µm) - Cook # K-HPIP - 1035
 Isolete 37º C, 5% CO2 adaptada com lupa (estereomicroscópio), em seu interior 
 Microscópio invertido - Nikon Eclipse # TE 300
 Platina e Sistema de Aquecimento: Fryer A 50
 Contraste de Fase: Hoffman (BF, HMC - 10, HMC - 20, HMC - 40)
 Ocular: CFW 10x
 Objetivas: 4x, 10x, 20x, 40x 
 Sistema Micromanipulador: Nikon / Narishige - Série NT 88
 Microinjetor: IM - 188
 Controles Hidráulicos: 2 A 4
 Microinjetor: IM - 6
 Joystick: MO - 189
 Motor: MM - 188
 Fertilase (“1,48 µm diode laser” - InGaAsP), Medical Technologies
 Monitor de TV calibrado
 Câmera acoplada ao microscópio
 Caneta de micromanipulação
MEIOS DE CULTURA:
Hepes: HTF / HEPES a 10% de SSS.
Óleo mineral: colocar em um frasco ou tubo, sobre meio de cultura (aproximadamente 1/10 do volume de óleo).
PREPARO DA PLACA:
O “dish” de A.H. consiste de uma placa de micromanipulação, onde são dispostas gotas contendo 5 µl de Hepes para manipulação dos embriões.
Ao realizarmos o A.H. químico, estas gotas deverão ser colocadas ao redor de outra gota contendo 5 µl de Tyrode’s.
CANETA DE MICROMANIPULAÇÃO:
A caneta utilizada para acoplar a micropipeta de biópsia é uma caneta comum de micromanipulação, da qual retira-se a mangueira plástica, e em seu lugar coloca-se a de borracha. Nesta pode-se utilizar filtros, e na extremidade oposta, um bocal rígido, como ponteiras de micropipetas, etc., pois a retirada dos blastômeros não é feita com o auxílio do sistema hidráulico de seringa como para o ICSI, mas sim com a boca.
AJUSTE DO MICROMANIPULADOR:
O ajuste do microscópio deverá ser igual ao realizado para os procedimentos de ICSI.
A micropipeta de A.H. deverá ser posta na caneta já acoplada à mangueira de borracha.
Verificar se a temperatura do Fryer está em 37º C.
Ao fazer o ajuste das micropipetas, certificar-se de que estas estejam paralelas à platina do microscópio, para que suas extremidade localizem-se no mesmo plano que a célula a ser manipulada. 
A.H. A LASER:
PREPARO DA PLACA:
A placa deve ser preparada da mesma maneira que para o A.H. químico, porém, sem o uso do Tyrode’s.
AJUSTE E OPERAÇÃO DO APARELHO:
Verifica se a demarcação no monitor coincide com o local de incidência da luz piloto.
Verificar se o tempo de exposição está correto (entre 8 e 10 milisegundos).
Posicionar o alvo desejado no ponto indicado na tela
Através do pedal ou controle manual, faz-se o disparo, que ocasionalmente pode ser repetido, dependendo da resistência e espessura da zona pelúcida, a fim de obter uma abertura de  20µm.
A.H. QUÍMICO:
PROCEDIMENTO:
Esta operação é realizada com a boca (de forma semelhante à biópsia de blastômeros), utilizando-se uma pipeta de A.H., a qual deverá ser preenchida com Tyrode’s. 
Com o embrião preso pela Holding, aproximar a pipeta de A.H., fazendo movimentos de vai-e-vem ao longo da zona pelúcida, realizando uma abertura de aproximadamente  20µm, através da liberação de pequena quantidade da solução (1 a 2 µl no máximo).
Holding
Pipeta de 
A.H.
Movimento da micropipeta	 
RETIRADA DE FRAGMENTOS:
Após a abertura, fazer leve aspiração no local para retirar qualquer vestígio de solução no interior do embrião, e com o auxílio da Holding, transportar o embrião para outro lugar da gota.
Após o “hatching”, introduzir a micropipeta na abertura realizada na zona pelúcida.
Lenta e delicadamente, retirar um a um os fragmento existentes no espaço perivitelínico e entre os blastômeros, ou blastômeros degenerados (após descongelamento), evitando danificar as células intactas.
micropipeta
 de 
A.H.
blastômero
Lavar o embrião 3 a 4 vezes em Hepes a fim de retirar vestígios do Tyrode’s, incubando-o novamente em meio de cultura.
Nos casos de diagnóstico pré-implantacional, a biópsia será realizada na mesma placa onde foi realizado o A.
CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES ANIMAIS
(Aula: Dr. Marco Roberto Mello)
1. VANTAGENS DA CONGELAÇÃO DE EMBRIÕES 
Facilidade de comércio: o transporte de embriões congelados é mais fácil e mais econômico.
Possibilidade de aproveitamento do cio natural das receptoras não havendo necessidade de sincronização do ciclo estral. A taxa de prenhez nas receptoras não sincronizadas seria maior.
Aproveitamento dos embriões excedentes ao número de receptoras. Não é preciso manter grandes rebanhos de receptoras. Os embriões excedentes são congelados.
Escolha da data do parto adequada ao manejo da fazenda. Nascimentos concentrados em período propício, semelhante à Inseminação Artificial.
Bancos de germoplasma. Preservação de material genético de espécies ou raças ameaçadas de extinção.
2. INJÚRIAS PROVOCADAS DURANTE A CONGELAÇÃO
A morte celular durante o processo de congelação seria, basicamente, conseqüência de 2 acontecimentos:
Formação de grandes cristais de gelo no interior das células embrionárias. Estes cristais destroem o citoesqueleto e as organelas citoplasmáticas de maneira irreversível.
A alta concentração de solutos no inteiror das células devido a intensa desidratação provocada pelos crioprotetores na congelação. Este aumento da concentração de solutos é denominado Efeito Solução.
Toxicidade química do próprio agente crioprotetor. Dentre eles, o Etileno glicol e o Propanodiol são os menos tóxicos.
3 CRIOPROTETORES
3.1 Definição: 
Os crioprotetores são substâncias necessárias para a criopreservação de embriões pois protegem as células embrionárias contra os danos causados durante a congelação e descongelação.
3.2 Classificação: 
Permeáveis ou Intracelulares: Glicerol, Etileno-glicol, Dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2 Propanodiol
Não Permeáveis ou Extracelulares:
De baixo peso molecular: Sacarose, Glicose, Trealose.
De alto peso molecular: Ficol, PVP, Albumina Sérica Bovina (BSA).
3.3 Mecanismos de ação:
Não estão totalmente esclarecidos
Promove a desidratação celular pelo aumento da osmolaridade da solução de congelação, impedindo a formação de grandes cristais de gelo.
Diminui o ponto de congelação da solução permitindo uma desidratação mais eficiente.
Atua como solvente no interior da células substituindo a água, portanto, minimizando as lesões conseqüentes do Efeito Solução.
Ação reparadora na membrana celular.
Despolimerização do citoesqueleto celular (microtúbulos e microfilamentos) prevenindo danos irreversíveis.
4. MÉTODOS DE CONGELAÇÃO
De acordo com a velocidade de resfriamento e com a concentração de crioprotetores, os métodos de congelação podem ser divididos em:
Congelação lenta ou controlada
Congelação rápida
Vitrificação
4.1 CONGELAÇÃO LENTA OU CONTROLADA
A mais utilizada a campo. Método de eleição para a criopreservação de embriões de quase todas as espécies de animais domésticos.
O resfriamento para a congelação dos embriões é lento (0,5C/minuto), portanto, a técnica é a mais demorada e a mais laboriosa.
Necessidade de equipamento sofisticado e caro. Ex: Máquina para resfriamento.
Por ser a técnica mais antiga e mais utilizada, os protocolos estão mais estabelecidos e os resultados são mais confiáveis.
Utilização de baixa concentração de crioprotetor (1,5M)
4.1.1 Crioprotetor: 
Glicerol 1,4M (10%)
Etileno-glicol 1,5M (8,4%)
Observação: normalmente, estas soluções são preparadas em PBS - solução salina tamponada - acrescida de 10% de soro fetal bovino (SFB) ou 0,4% de albumina sérica bovina (BSA).
4.1.2 Metodologia:
I) Adição do crioprotetor: exposição dos embriões à solução crioprotetora por 10 a 15 minutos. Este período inclui o tempo gasto com o envase dos embriões. No caso de haver muitos embriões, recomenda-se começar o envase aos 5 minutos. Ao se colocar os embriões na solução crioprotetora, estes sairão do foco em função da imediata perda de água para a solução hiperosmótica de congelação.
II) Envase: são utilizadas palhetas Francesas de 0,25ml. Formar 3 colunas de líquidoseparadas por bolhas de ar. A coluna central deve conter os embriões. Os embriões devem ser envasados individualmente e as palhetas devidamente identificadas com marcação resistente a álcool (identificação dos “pais” do embrião, qualidade e estágio de desenvolvimento do embrião e método de congelação).
III) Imersão das palhetas na máquina de congelação com a temperatura do álcool estabilizada em - 7C. Deixá-las estabilizando por 5 minutos.
IV) Com auxílio de uma pinça resfriada em nitrogênio líquido, fazer a Indução da Cristalização (ou seeding).
V) Após 10 minutos da realização do seeding, iniciar o decréscimo da temperatura a uma velocidade de 0,5 C/minuto até - 25C.
VI) Após 10 minutos a - 25C, mergulhar as palhetas em nitrogênio líquido.
4.2 CONGELAÇÃO RÁPIDA
Utilização restrita a área experimental
Metodologia mais rápida e prática em relação à Congelação Lenta.
Resultados não convincentes.
Utilização de moderada concentração do crioprotetor (3,0M)
4.2.1 Crioprotetor:
Etileno-glicol 3,0M (17%) + Sacarose 0,3M (10%)
4.2.2 Metodologia:
I) Adição do crioprotetor: exposição dos embriões à solução crioprotetora durante 5 minutos.
II) Envase semelhante à Congelação Lenta: formar 3 colunas de líquido intercaladas por pequenas bolhas de ar.
III) Congelação pela exposição da palheta ao vapor de Nitrogênio (-170C) durante 2 minutos.
IV) Após este período, mergulhar as palhetas no nitrogênio líquido.
4.3 VITRIFICAÇÃO
Utilização restrita a área experimental
Metodologia mais rápida e prática em relação à Congelação Lenta.
Resultados não convincentes.
Utilização de alta concentração do crioprotetor (6,0M). Nesta elevada concentração, ocorre a vitrificação do meio (sólido semelhante ao vidro). Neste particular método de congelação não ocorre a formação de cristais de gelo.
Alternativa para congelação de embriões produzidos in vitro e embriões suínos.
4.3.1 Crioprotetor:
Etileno-glicol 20% (EG 20%)
Etileno-glicol 40% + Sacarose 10% + Ficol 18% (EFS)
4.3.2 Metodologia:
I) Adição do crioprotetor: é realizada em etapas devido a alta concentração dos crioprotetores. Primeiro, os embriões são expostos durante 3 minutos à solução EG20%. Posteriormente, eles são expostos à solução de vitrificação (EFS) por um período de 60 segundos. 
II) Envase semelhante à Congelação Lenta: formar 3 colunas de líquido intercaladas por pequenas bolhas de ar. No entanto, a coluna central que contém os embriões deve ser a menor possível. Quanto menor a coluna, mais rápido será o resfriamento e melhores serão os resultados. O envase deve ser realizado durante os 60 segundos de exposição dos embriões à solução EFS.
III) Após 60 segundos, mergulhar as palhetas no nitrogênio líquido. Para evitar a explosão das palhetas, as colunas das extremidades devem ser imersas lentamente e a do embrião rapidamente.
5. DESCONGELAÇÃO
10 segundos no ar. Esta prévia exposição ao ar reduz a ocorrência de fratura da zona pelúcida assim como a explosão da palheta.
20 segundos em banho-maria a 25C (esta temperatura pode variar de 25 a 37C, dependendo do protocolo utilizado).
Observação: Existem protocolos nos quais a descongelação é feita diretamente em banho-maria.
6. REMOÇÃO DO CRIOPROTETOR
Os crioprotetores Glicerol e Etileno-glicol possuem coeficientes de permeabilidade diferentes. O Etileno-glicol tem um coeficiente maior do que o Glicerol. Em outra palavras, ele entra e sai das células mais rapidamente que o glicerol. Portanto, dependendo do crioprotetor utilizado, devemos utilizar um ou outro método de remoção.
6.1) Remoção em etapas: trata-se de um método mais antigo e trabalhoso. É válido para aqueles protocolos que utilizam o glicerol como crioprotetor. Se colocarmos os embriões congelados em glicerol diretamente em PBS para remoção do crioprotetor, haverá uma entrada de água muito mais rápida do que a saída do crioprotetor, devido ao seu baixo coeficiente de permeabilidade. Isto acarretaria na morte do embrião. Portanto, utilizamos soluções com concentrações decrescentes de glicerol associado a sacarose. Esta última tem a função de manter a solução externa ao embrião hiperosmótica, evitando uma entrada abrupta de água.
6,6% Glicerol + 0,3M Sacarose 3,3% Glicerol + 0,3M Sacarose 0,3M Sacarose 
 
 PBS
Os embriões devem permanecer por 5 minutos em cada etapa.
6.2) Método one-step: quando a remoção do crioprotetor, após a descongelação, é feita dentro da palheta: este método de remoção permite a transferência direta do embrião para receptora tornando dispensável o uso de lupas no momento da descongelação. O processo torna-se mais prático, semelhante à Inseminação Artificial.
Se o crioprotetor for o etileno-glicol, devemos colocar PBS + 0,4% de BSA nas colunas das extremidades da palheta. Já para a transferência direta utilizando o glicerol, devemos utilizar uma solução de 0,5M de sacarose nas colunas das extremidades.
7. AVALIAÇÃO DA SOBREVIVÊNCIA EMBRIONÁRIA
Desenvolvimento in vitro: cultivo dos embriões em estufa de CO2. Realização de avaliações diárias acompanhando o desenvolvimento embrionário.
Desenvolvimento in vivo: transferência para receptoras sincronizadas com o estágio de desenvolvimento do embrião. Avaliação da taxa de prenhez.
Avaliação morfológica do embrião: integridade da zona pelúcida e dos blastômeros. 
Utilização de corantes supravitais: diacetato de fluoresceína (FDA).
8. FATORES IMPORTANTES NO SUCESSO DA TÉCNICA
origem do embrião: in vivo ou in vitro. Embriões produzidos in vitro possuem alta sensibilidade ao resfriamento lento (Congelação Lenta). Os melhores resultados são obtidos com a vitrificação.
Espécie e raça: cada espécie tem uma particularidade. É necessário descobrir o melhor crioprotetor e o melhor método para cada espécie. Exemplos: embriões suínos, devido a alta concentração lipídica de suas células, não sobrevivem à congelação lenta. As taxas de prenhez após a transferência de embriões Nelore congelados pelo método one-step com etileno-glicol são inferiores do que as obtidas com embrião de gado Europeu.
Qualidade do embrião: embriões de excelente qualidade proporcionam melhores taxas de prenhez.
Estágio de desenvolvimento: geralmente, quanto mais desenvolvido for o embrião maior será sua resistência à congelação.
Período compreendido entre a colheita e a congelação: este tempo não deve ser superior a 4 horas. 
Criopreservação de Pré-embriões Humanos - HIAE
Introdução 
 A primeira gestação obtida de pré – embriões congelados e descongelados em humanos foi em 1984.
 Hoje podemos obter em alguns programas de congelamento – descongelamento uma taxa de gestação similar aos programas de Fertilização in vitro.
 Um programa eficiente de congelamento – descongelamento nos permite oferecer a pacientes novas tentativas de transferência de pré – embriões sem a necessidade de uma nova hiperestimulação ovariana , também é a solução nos casos de Síndrome de Hiperestimulação Ovariana , onde todos os pré – embriões são criopreservados para futuras transferências .
Crioprotetores
 Os crioprotetores são substâncias que protegem as células de consequências adversas ao processo de congelamento.
 Os crioprotetores geralmente tem 3 propriedades : passar ativamente através da membrana , realizar a troca de água e em altas doses é tóxico . 
 Os mais utilizados em programas de Reprodução Assistida são : DMSO ( dimetyl sufoxida ) , glicerol e PROH ( propanediol ) .
- Desidratação
 
 Como regra os crioprotetores são utilizados na concentração de 1,5M . Isto significa que o pré – embriãono meio de cultura no qual o crioprotetor será adicionado sofrerá uma reação osmótica perdendo água, logo após a célula absorve os crioprotetores e então o volume é readquirido . Na prática a concentração e a normalização do volume celular é facilmente obtida . Quando o volume celular é normalizado o processo de congelamento pode ser iniciado.
- Reidratação	
 Durante a reidratação , após o descongelamento , a reação que ocorre é o inverso da desidratação.
 Este processo ocorre em etapas , no qual o pré – embrião é exposto em concentrações cada vez menores de crioprotetores . A cada etapa o volume embrionário aumentará com a adição e absorção da água e retornará ao normal nas etapas subsequentes.
Adição de substâncias não permeáveis
 Uma proteção extra contra os perigos do congelamento – descongelamento embrionário pode ser obtido pela adição de uma substância não permeável que aumenta a osmolaridade . Um exemplo destes componentes é a sacarose .
Tipos de congelamento
 Vitrificação ou congelamento rápido : propõem proteger a célula da formação de cristais de gelo . Para que isto ocorra os crioprotetores devem ser aumentados em cerca de 40% ou mais . Por causa da toxicidade dos crioprotetores a temperatura ambiente os crioprotetores são expostos a agentes a 0C. As amostras são submergidas diretamente no nitrogênio líquido sem a necessidade do seeding. Os pré – embriões vitrificados devem ser descongelados em água gelada , o que não é conveniente , sendo esta técnica ainda estudada em modelo animal .
 Congelamento lento : é a técnica mais utilizada em procedimentos com pré-embriões humanos e tem por objetivo dar tempo para que as mudanças de temperatura ocorrendo de maneira gradual e lenta permitam as trocas celulares com o meio de congelação e seus componentes, assim como as alterações de volume celular, obtendo a máxima segurança em termos de sobrevivência da célula e suas organelas. Torna-se necessário um “seeding” controlado e ou induzido para que a formação dos cristais de gelo ocorram no momento e na velocidade adequados com um mínimo de lesão celular.
TÉCNICA DE CONGELAMENTO DE PRÉ – EMBRIÕES HUMANOS - HIAE
1. Definição : 
Congelar pré-embriões ( 2PN, 2-8células ) pós procedimentos de Fertilização Assistida ( FIV ou ICSI ).
2.Objetivo : 
Congelar pré-embriões e criopreservá-los até posterior descongelamento e transferência.
 
3.Material : 
Sacarose ( Merck - 1.07651 ) 
Crioprotetor: 1,2 propanediol ( 1,2 PROH - Sigma P -1009 )
Substituto sintético de soro ( SSS Irvine Scientific 99193 ) 
Dulbeccos ( PBS Gibco 14040-133 ) 
Tubo de 5,0ml estéril ( Falcon )
Tubo de 10,0ml estéril ( Falcon ) 
Pipetas graduadas estéreis de 1,0ml ( Costar R4011 ), 
Pipetas graduadas estéreis de 5,0ml ( Corning 7075-2 ) 
Pipetas graduadas estéreis de 10,0ml ( Costar R4101 ) 
Placa de Petri ( Costar 3035 ) ou de NUNC 
Palhetas estéreis de 0,25ml 
Seringa de insulina
Tampões plásticos para palhetas estéreis
Filtros para soluções ( 0,22µm – Millipore ) 
Congeladora automática ( Planner – Kryos 10)
Cronômetro
Termômetro
Balança analítica
Incubadora de CO2 ( Forma – Scientific )
Microscópio invertido( Nikon – Diaphot )
Estereomicroscópio ( Nikon – SMZ-U )
Container de nitrogênio líquido
Capela de fluxo laminar 
Pinça anatômica ou outra que metálica com superficie de contato lisa 
Nitrogênio líquido 
Caixa de isopor
4. Descrição do Procedimento :
 
 Preparo das soluções:
 
Trabalhando em capela de fluxo laminar; colocar 6,0ml de PBS em um tubo de ensaio de 10,0ml, adicionar 1,0ml de SSS e homogeneizar(solução A - 7ml). 
Transferir 2,0ml da solução A para um tubo de 5,0ml e identificar como solução n 1. 
Aos 5,0ml restantes da solução A, adicionar 0,57ml de PROH e homogeneizar (solução B = 5,57ml).
Transferir 2,0ml da solução B para um tubo de 5,0ml contendo 0,0684g sacarose, homogeneizar (PBS + SSS + PROH + sacarose) e identificar como solução n 3.
Os 3,57ml restantes da solução B (PBS + SSS + PROH) identificar como solução n2.
Filtrar cada uma das soluções finais(ns 1, 2 e 3) em filtro 0,22µm.
solução n1 ( 2ml )
solução n2 ( 3,57ml )
solução n3 ( 2ml )
Obs.: Estas soluções podem ser armazenadas por sete dias em geladeira ( 4 a 8º C ).
Programa da congeladora :
Start:		temperatura ambiente
rampa 1 : 		-3C/min até -7C 
soak time: 		espera de 15 minutos na temperatura de -7C. 
seeding manual:	à -7C 
hold for: 		espera de 5 minutos à -7C.
rampa 2 : 		-0,3C/min. até -30C ,
rampa 3 : 		-50C/min. até -150C.
Congelamento: 
Identificar 3 placas de Petri com berço único ou os 3 poços laterais de uma plaqueta de Nunc com os números 1, 2 e 3 . 
Preenche-los com as respectivas soluções de congelamento.
Identificar com o nome da paciente. 
Distribuir as soluções em seus receptáculos respectivos e mante-las à temperatura ambiente ( 25C ) por 30 minutos, quando então se efetuarão os banhos nesta temperatura.
Com o auxílio de um capilar de vidro afilado ou um sistema de manipulação adequado, colocar os pré-embriões na solução n1 e observar ao microscópio as características morfológicas dos mesmos. 
Transferi-los a seguir à solução n2 deixando-os neste banho por período de 10 a 15’. Durante este, poder-se-ão observar primeiramente a retração celular e sua posterior recuperação morfológica ( inchaço ), fenômenos que representam a saída de água e a entrada do crioprotetor durante a rehidratação das células. 
Passá-los então à solução n3 e de imediato transferi-los às palhetas da maneira que se segue: 
Acoplar uma seringa de insulina à parte tamponada da palheta e sob visão de lupa aspirar 3,0cm da solução n3 pura, 1,0cm de ar e 1,5cm da solução n3 com os pré- embriões. 
Retirar a palheta do meio de congelamento e continuar aspirando ar até que o meio alcance o tampão de algodão da palheta .
Fechar a outra extremidade com o tampão de plástico colorido identificando-o, assim como a palheta, com o nome da paciente, data do congelamento e n de pré- embriões.
No momento em que os pré-embriões forem passados à solução n3 o container de nitrogênio líquido já deverá estar abastecido (mínimo 12 cm e máximo 25,0cm). 
Fechar a válvula de segurança do container e ligar a congeladora.
Aguardar para que a pressão interna do container alcance o nível de 0,5 bar ou 5,0 psi (ligar o botão sob a plataforma do container -aquecedor interno- caso esta pressão não seja alcançada espontaneamente). 
Em seguida, acionar a congeladora automática e selecionar o programa adequado para a criopreservação.
Quando esta acionar o sinal sonoro de pronta para iniciar o programa de congelamento, colocar as palhetas contendo os pré-embriões em seu rack adequado. 
Ao atingir a temperatura de -7C e ouvir-se o sinal sonoro do “seeding”, fazer o “seeding” manual, ou seja, colocar a extremidade distal da pinça metálica imersa em nitrogênio líquido, retirar ligeiramente o rack contendo a palheta da câmara de congelamento e tocá-la com a extremidade gelada da pinça por alguns segundos.
Reintroduzir o rack na câmara de congelamento e dar continuidade ao programa (“run”).
Quando o programa se encerrar e o sinal sonoro for ouvido, retirar o rack contendo os pré-embriões da câmara de congelamento e coloca-lo em uma caixa de isopor contendo nitrogênio líquido.
Com auxílio de uma pinça retirar a(s) palheta(s) do rack e transferir para o rack de armazenamento previamente identificado com o nome da paciente e data de congelamento.
Colocar este(s) último(s) no canister do container de armazenamento. 
Para finalizar, acionar novamente o programa para que a temperatura da congeladora retorne a temperatura ambiente e então se desligue o aparelho.
TÉCNICA DE DESCONGELAMENTO DE PRÉ – EMBRIÕES HUMANOS - HIAE
1. Objetivo : 
Descongelar pré-embriões criopreservados( 2PN -8 células ) para posterior transferência.
2. Material : 
Sacarose ( Merck-1.07651 )Dulbeccos ( PBS- Gibco-14040-133 ) 
Substituto de Soro Sintético ( SSS - Irvine Scientific –99193 ) 
Crioprotetor: 1,2 Propanediol ( PROH - Sigma P - 1009 )
Meio de cultivo ( HTF-Irvine Scientific )
Óleo mineral ( Sigma )
Tubo de ensaio estéril, de 10,0ml ( Falcon, Costar... )
Tubo de ensaio estéril de 5,0ml ( Falcon, Costar... )
Pipetas graduadas estéreis de 1,0ml ( Costar 4011 )
Pipetas graduadas estéreis de 5,0ml ( Corning 7075-2 )
Pipetas graduadas estéreis de 10,0ml ( Costar 4101 )
Placa de Nunc ou plaqueta ( Costar 3035 ) 
Capilares de vidro neutro e estéreis ou pipetas Pasteur
Filtros para soluções ( 0,22m-Milipore ) 
Microscópio estereoscópico ( Nikon Diaphot SMZ – U )
Microscópio invertido ( Nikon Diaphot )
Incubadora de CO2 ( Forma Scientific ) 
Banho-Maria à 30 C 
Balança analítica
Cronômetro
Êmbolo metálico para esvaziamento da palheta
Nitrogênio líquido
Container de Nitrogênio líquido
3. Descrição do Procedimento :
Preparo das soluções:
 
Trabalhando em capela de fluxo laminar, colocar 8,0ml de PBS em um tubo de ensaio 10,0ml, adicionar 2,0ml de SSS e homogeneizar (solução A – 10ml).
Transferir 2,0ml da solução A para um tubo de 5ml e identificar como solução n4 (PBS + SSS ). 
Aos 8,0ml restantes da solução A, adicionar 0,5472g de sacarose, lavar o recipiente onde foi pesada a sacarose e homogeneizar a solução resultante ( solução B = 8,0ml ). 
Colocar 2,0ml da solução B em um tubo de 5,0ml e identificar como solução n3 (PBS + SSS + sacarose 0,2M ). 
Transferir 1,0ml da solução B em outro tubo de 5,0ml identificando-o como solução C. 
Aos 5,0ml restantes da solução B adicionar 0,380ml de PROH , homogeneizar e identificar como solução n1 ( PBS + SSS + sacarose 0,2M + PROH 1M ). 
Retirar 1,0ml da solução n1 e adicionar à 1,0ml da solução C , homogeneizar e identificar como solução n2 ( PBS + SSS + sacarose 0,2M + PROH 0,5M ).
Filtrar cada uma das soluções finais (ns 1, 2, 3 e 4 ) em filtro de 0,22m.
solução n1 ( 4ml )
solução n2 ( 2ml )
solução n3 ( 2ml )
solução n4 ( 2ml )
Obs.: Estas soluções podem ser armazenadas por até sete dias em geladeira (4 a 8 º C).
 Descongelamento : 
Identificar 4 placas de Petri com berço único ou os 4 poços laterais de uma plaqueta de Nunc com os números 1, 2, 3 e 4.
Preenche-los com as respectivas soluções de descongelamento.
Identificar com o nome da paciente. 
Distribuir as soluções em seus receptáculos respectivos e mante-las à temperatura ambiente ( 25C) por 30 minutos, quando então se efetuarão os banhos nesta temperatura.
Verificar os pré-embriões a serem descongelados e localizar a(s) palheta(s) no container de nitrogênio líquido.
Uma vez fora do container deixar a(s) palheta(s) inicialmente por 40 segundos à temperatura ambiente. 
Posteriormente outros 40 segundos em banho-Maria a 30C .
Sob visão estereoscópica e após retirar o tampão plástico da palheta, com auxílio de um êmbolo metálico empurrar o tampão de algodão para depositar a solução com os pré-embriões sobre uma placa de Petri, identificando-os.
Imediatamente após, transferi-los para a solução n 1. Banhando-os por 5 minutos.
Passar pelas soluções seguintes n 2, 3 e 4 deixando-os sempre 5 minutos em cada uma delas e observar a sobrevivência a cada passo do procedimento.
Finalmente coloca-los em meio de incubação (HTF + SSS) e incuba-los a 37 C e 5% de CO2. 
Após o descongelamento permanecerão incubados por no mínimo 3 a 4 horas até a transferência. 
LABORATÓRIO DE MANIPULAÇÃO DE GAMETAS - URH HOSPITAL ISRAELITA ALBERT EINSTEIN
CONGELAMENTO DE PRÉ-EMBRIÕES
	NOME:
	
	CONGELAMENTO:
	SÉRIE:
	
	
	DESCONGELAMENTO:
	
	
	PROTOCOLO DEXEUS
	
	
	
	PROTOCOLO DEXEUS
	
	
	OUTRO:____________________
	DATA: / /
	
	
	OUTRO:_______________________
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	MEIO CRIOPROTETOR:
	
	
	
	MEIO DE DILUIÇÃO:
	
	
	1,2 PROPANEDIOL – Lote: 
	 Exp:
	
	
	DULBECCO´S – Lote: Exp
	
	
	DMSO – Lote:
	 Exp:
	
	
	SSS – Lote: Exp:
	
	
	GLICEROL – Lote: 
	 Exp:
	
	
	OUTRO: ______________________
	
	
	
	
	
	
	
	
N0 P.E.
	
CLASSIFICAÇÃO
	
LOCALIZAÇÃO
	DESCONGELAMENTO
HORA/DATA
	
CLASSIFICAÇÃO
	INCUBAÇÃO
HORA
	TRANSFERÊNCIA 
D/H/CLASSIFICAÇÃO
	
TRANSFERÊNCIA
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
CONG. EFETUADO
	
	
	
	
	
	
	
	
DESC. EFETUADO:
	
	
	
	
	
	
	
Técnicas e Protocolos de Criopreservação de Pré-Embriões
Tanit Sant'Anna, BS, TS
Fertility and IVF Center of Miami
USA
Embriões de mamíferos tem sido congelados e descongelados com sucesso desde 1972, quando Wittingham et al. (1) relataram o nascimento de ratos vivos. Em humanos, o primeiro bebê nasceu na Australia, em 1984, após a transferência de um embrião de 8 células criopreservado-descongelado (2). Desde de então, técnicas de criobiologia tornaram-se parte essencial em programs de FIV, pois o método aumenta a oportunidade de gravidez a partir de um único ciclo de estimulação ovariana. 
Atualmente, pré-embriões podem ser criopreservados em quase todas as fases de desenvolvimento, desde zigotos até blastocistos. Técnicamente, a escolha do estágio celular para criopreservacão determina o tipo de protocolo de congelamento a ser usado. Diferentes crioprotetores intracelulares são usados dependendo do estágio de divisão do pré-embrião. Zigotos e embriões multicelulares possuem taxas de sobrevivência e implação maiores quando DMSO ou 1, 2 Propanediol (PROH) são empregados, enquanto que mórulas e blastocistos sobrevivem melhor com glicerol (exemplos de protocolos em anexo). Todos estes três crioprotetores intracelulares possuem pequenas moléculas que permeam facilmente a membrana celular. Além disso, existem várias substâncias extracelulares que ajudam a desidratar e proteger as células. Sucrose é a substância mais usada porque possui moléculas grandes, não permeáveis, e produz um efeito ósmotico que acelera a desidratação celular (3). 
Congelamento – Descongelamento 
A meta principal para um programa de congelamento é fazer o máximo possível para não prejudicar os gametas e pré-embriões quando expostos a temperaturas não fisiológicas. Os protocolos usados hoje em dia são essencialmete “freeze-dry”, envolvendo desidratação da célula para previnir formação de gelo intracelular. A cristalização intracelular danifica membranas e organelas e é a principal causa da degeneração celular após a criopreservação (4). O congelamento deve ser feito lentamente, mantendo uma taxa constante de diminuição de temperatura, normalmente entre 0.1-0.3ºC/min.
Durante a criopreservação, a água é removida da célula para promover equilíbrio com o meio extracelular (5-6). Quando a solução “super cool” (esfriamento bem abaixo do ponto de congelamento sem a formação de cristais de gelo), as células não desidratam apropriadamente. Isto ocorre devido a não formação extracelular de cristais de gelo, não havendo aumento da pressão ósmotica. Portanto, é essencial que a cristalização seja iniciada acima do ponto de congelamento do crioprotetor. Esta cristalização é desencadeada pela introdução artificial de um cristal de gelo, processo chamado “seeding”. A maioria dos laboratórios de FIV iniciam o “seeding” na área do “meniscus” (região limite entre a solução de crioprotetor e o ar).
Cuidado especial também deve ser tomado com relação ao descongelamento. Se o esfriamento termina à níveis relativamente altos de temperatura (maior ou igual a – 30ºC), a célula carrega mais gelo intracelular do que em temperaturas mais baixas (menor ou igual a –