Aula 2 - Bioquímica Farmacêutica (revisão regulação enzimática e glicólise)

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30 de Março de 2015
Bioquímica Farmacêutica
Km (constante de michaelis menten): Concentração do substrato que leva metade da velocidade máxima da enzima. Concentração do substrato equivalente à ½ V. máx.
Velocidade máxima: a maior atividade da enzima, onde todos os sítios ativos, de todas as enzimas de uma solução, estão ativados por um substrato. Isso quase nunca acontece, e por isso, é uma medida extrapolativa. Não é obtida por experimento, mas sim por uma equação à partir do gráfico. Por isso que, no gráfico, ela é mais alta do que a curva de ação da enzima.
O Km da Hexocinase para atp é de 1mM: isso significa que com 1mM de ATP a Hexocinase alcança metade da sua V.máx. A PFK-1 também utiliza ATP, porém seu Km é de 5mM. Isso significa que a Hexocinase possui maior afinidade pelo substrato, pois com menos substrato ela já alcança metade da sua V.máx.
Na célula viva:
As reações acontecem quando/onde a velocidade depende da [ ] do substrato. Nesse local, uma variação na [ ] do substrato significa uma grande variação na atividade da enzima (No gráfico: A1e S1 x A2 e S2). Ou seja, se o substrato muda, a concentração do substrato e a atividade da enzima também mudam: REGULAÇÃO!
A regulação pode ser positiva ou negativa, e é essencial para as células vivas. Então, essas enzimas vão trabalhar sempre nessa primeira parte do gráfico da cinética, onde pequenas mudanças na [ ] causam grandes mudanças na atividade da enzima. Pra mais ou pra menos.
Inibidores:
Enzima, Substrato dessa enzima e seus inibidores.
Podem ser um análogo do substrato, ou seja, parece muito com a parte do substrato que interage com o sítio ativo da enzima (Inibidor Competitivo). Ou pode ser uma molécula completamente diferente (Inibidor Não Competitivo).
Inibidor competitivo: Compete com o substrato pelo sítio ativo. Apenas um dos dois vai se ligar. Se ligar o substrato, gera um produto. 
Se ligar um inibidor, não gera produto.
Obs.: A quantidade de produto com inibidor sempre será menor do que sem o inibidor.
Curva Azul (Controle): Tem enzima, substrato e tudo que ela precisa para funcionar. NÃO TEM INIBIDOR.
Curva Rosa (Com inibidor): Tem enzima, substrato e INIBIDOR COMPETITIVO (quantidade fixa, por exemplo 10mM). Atividade da enzima reduzida.
5mM de Substrato: 5mM do S. contra 10mM do I. A atividade da enzima vai estar bem abaixo da linha azul, pois é uma questão de competição. O inibidor tem mais probabilidade de se ligar pois está em maior quantidade, logo a atividade da enzima vai estar bem reduzida
7,5mM de S.: A atividade da enzima continua abaixo da linha azul, porém mais alto do que o ponto anterior, pois o inibidor continuou em 10mM mas o substrato aumentou. Ainda tem uma probabilidade maior de ligar o inibidor, mas tem um pouquinho mais de substrato. 
10mM de S.: Continua abaixo da linha azul e acima dos pontos anteriores. Isso porque, entre 10mM de inibidor e 10mM de substrato, a probabilidade de um dos dois se ligar será 50%. Atividade da enzima aproximadamente 50% inibida.
20mM de S.: Abaixo da linha azul, mas agora o ponto está bem mais alto pois existe duas vezes mais chance do substrato se ligar (20mM) do que o inibidor (10mM).
40mM de S.: Abaixo da linha azul e mais alto do que os outros pontos.
50mM de S.: Abaixo da linha azul e mais alto do que os outros pontos.
70mM de S.: A inibição foi sendo revertida devido o aumento da [ ] do substrato. Aumentou a probabilidade da enzima se ligar ao substrato e gerar o seu produto.
Podemos observar que na inibição competitiva, em baixas concentrações de substrato, a atividade é menor pois a enzima está inibida. À medida que a [ ] do substrato aumenta, a probabilidade do substrato se ligar à enzima também aumenta e, portanto, a atividade final é igual a da curva sem inibidor.
O Km é utilizado para medir a inibição da enzima. A velocidade da enzima não se alter, só o Km.
Na presença do inibidor competitivo o Km aumenta pois a afinidade diminui. Quanto maior o Km, menor a afinidade. Isso acontece porque a enzima só possui um sítio ativo (cinética michaeliana).
Curva Preta: O competidor não competitivo não tem nada a ver com o substrato. Ele se liga a uma outra região da enzima, que não é o sítio ativo, e faz com que essa enzima se abra ou se feche. De alguma maneira, a sua conformação se altera, prejudicando a ligação do substrato e diminuindo a atividade da enzima. 
A diferença entre o competitivo e o não competitivo é a velocidade máxima. Na presença de um I.C. a enzima não consegue alcançar a sua V.máx., pois não há competição por sítio. Ele não altera em nada a capacidade e a afinidade da enzima pelo substrato. O problema é que o substrato tem tanta dificuldade de interagir que ele não gera produto e a atividade diminui. Por isso que, mesmo em altas [ ] de substrato, a enzima nunca vai atingir 100% de sua capacidade. A V.máx. se altera e o Km é exatamente o mesmo da curva sem inibidor, porque o INIBIDOR NÃO COMPETITIVO NÃO ALTERA O SÍTIO ATIVO DA ENZIMA, ele se liga em um outro lugar e diminui a capacidade da enzimar de converter substrato em produto. Não se altera a afinidade.
Na cinética alostérica, a diferença é que a enzima possui mais de um sítio ativo (exemplo da hemoglobina).
Semelhante ao gráfico de dose e resposta, onde varia a concentração do fármaco na abscissa e o efeito dele. K0,5 e S0,5 são sinônimos de Km, mas são usados para cinética alostérica.
Curva azul é a enzima fator alostérico (tipo uma base). Quando alguma coisa ajuda essa enzima alostérica a funcionar, ou seja, quando ela está no estado “relax” pode existir alguma coisa que faça ela ficar no estado tense mais rapidamente acelerando sua atividade. Esse fator é chamado de fator alostérico positivo, que diminui a fase lag (esqueci de desenhar no gráfico, mas é na abscissa, do 0 até o pontilhado azul). Desloca o gráfico para a direita, sofreu o efeito de cooperação (curva verde). A curva verde está favorecida pois em menor quantidade de substrato já alcança metade da V.máx. (S0,5 ou K0,5 é menor).
A curva rosa representa a atividade da enzima com um efetor alostérico negativo. Diminuindo a afinidade e aumentando o K0,5.
Glicose 
A Glicose é uma piranose. Açúcar primordial do plasma dos humanos
É uma molécula extremamente polar, pois possui 5 hidroxilas (OH)!! Jamais permeia a membrana por difusão passiva. Necessita de uma proteína para realizar o seu transporte. 
GLUT: Transportador de glicose. Existem 5 famílias e as mais importantes são GLUT1 (específico do Córtex Cerebral), GLUT2 (Pâncreas - células beta pancreáticas e Fígado - hepatócitos) e GLUT4 (Músculo esquelético, Adipócitos e Miocárdio).
A diferença entre os três tipos de GLUT mais importantes é que o 4 é o mais especial. Isso porque ele é extremamente dependente de insulina, ou seja, o músculo esquelético, os adipócitos e o miocárdio só transportam glicose na presença de insulina (Momento metabólico pós-prandial). 
Para que a glicose seja internalizada nas células, é preciso que sua concentração plasmática aumente. Quando isso acontece, o GLUT2 das células pancreáticas (está na membrana o tempo inteiro, tendo insulina ou não). É como se a membrana estivesse furada, deixando a glicose passar. A única coisa que determina se a glicose vai entrar ou sair da célula é o gradiente de concentração, se aumentar do lado de fora, ela entra e se diminuir do lado de fora, ela NÃO sai! HAHA
O único tecido que do nosso corpo que consegue controlar a glicemia é o Fígado. É o único que expressa a última enzima da via gliconeogênica para exportar glicose (Glicose-6-fosfatase). Por isso o fígado é chamado de cérebro metabólico.
Então, o GLUT 2 não depende de insulina pois está sempre na membrana da célula. O GLUT 1 está no córtex e tem uma afinidade muito maior por glicose. Isso, porque todos os tecidos do nosso corpo usam ácidos graxos e corpos cetônicos, menos o córtex cerebral que só utiliza glicose. Os outros tecidos utilizam ácidosgraxos e corpos cetônicos para poupar a glicoase pro córtex utilizar. Apenas depois de 45 dias sem glicose disponível o córtex seria capaz de utilizar ácidos graxos (passam a expor o transportador para AG). Como ninguém aguentaria esse tempo sem comer, consideramos que O CÓRTEX UTILIZA APENAS GLICOSE e possui um GLUT de altíssima afinidade.
O GLUT4 é dependente de insulina pois fica guardado em grânulos, dentro da célula beta pancreática. A partir da sinalização de insulina, aumentam os níveis de cálcio que levam as vesículas à membrana e o GLUT fica na membrana, possibilitando o transporte da glicose.
 Glicólise
Se nada acontecer com a molécula de glicose ao entrar na célula, qualquer célula (Não só as do fígado) vai colocá-la de volta pra fora. O transportador está lá ativo, do mesmo jeito que ela entrou, pode sair. Para isso não acontecer, para o tecido ser obrigado a utilizá-la, a primeira reação que acontece para "prender" a glicose na célula é uma reação de fosforilação.
1ª Reação:
 
A hexocinase adiciona 3 cargas negativas (PO4-3) à glicose transformando-a em glicose-6-fosfato (ou glicose-6-p). Essa reação utiliza ATP como substrato e é o primeiro ponto de regulação da via glicolítica.
Regulação da Hexocinase:
Inibição pelo produto: quanto mais glicose-6-p tiver na célula, a enzima vai estar inibida. Quando acumula o produto a enzima é inibida. (Obs.: A glicocinase não é inibida pelo produto).
Expressão: enzimas são de natureza protéica e, portanto, pode ter sua expressão regulada. Esta expressão é aumentada pela insulina.
Isoformas (Hexocinase x Glicocinase): 
A Glicocinase possui menor afinidade pela glicose. Sua curva possui um Km extremamente alto (Km alto = Afinidade baixa). Já a Hexocinase possui afinidade alta.
Outra diferença entre elas é a Velocidade Máxima, ou seja, uma fosforila mais do que a outra, gerando mais glicose-6-p.
Relação entre a concentração de glicose (interna e Externa) e a atividade dos transportadores de glicose.
O transportador de mais alta afinidade (GLUT4) está expresso no mesmo local em que a enzima de mais alta afinidade (Hexocinase). Enquanto o transportador de mais baixa afinidade (GLUT2) está expresso no mesmo local em que a enzima de mais baixa afinidade (Glicocinase). 
	Vamos supor que um tecido tenha GLUT2 (baixa afinidade), mas expressa a Hexocinase. O receptor, por possuir BAIXA AFINIDADE, custaria muito para transportar tanta glicose e nesse momento a enzima já está ativa. Porém, este transportador possui ALTA CAPACIDADE/ATIVIDADE, ou seja, ele demora muito para transportar pois sua afinidade por glicose é baixa, mas ele se liga à várias glicoses e joga todas pra dentro da célula de uma vez só.
	Numa célula normal, a Glicocinase pegaria toda essa glicose e ia fosforilar tudo, pois apesar de ter baixa afinidade, ela tem alta capacidade . Porém, nesse caso, a Hexocinase que tem baixa capacidade, não conseguiria fosforilar todas as glicoses. A glicose não fosforilada voltaria para o plasma.
	Por isso que existe esse equilíbrio: tecido que expressa GLUT4 tem que expressar Hexocinase, e tecido que expressa GLUT2 tem que expressar Glicocinase. Para que toda glicose que entrar, seja fosforilada.
	O ΔG0 da reação da hexocinase é aproximadamente -18 KJ/mol. Isso significa que ela é uma reação irreversível e, por isso, ela é um ponto de regulação. Todas as reações irreversíveis geralmente serão pontos de regulação de vias metabólicas.
		2ª Reação
Mutase = Isomerase. Isomerização de função. O anel pirano vai ser convertido em um anel furano.
Isomero de função quer dizer que, ao abrir o anel pirano em projeção de ficha, ele se torna um aldeído (aldose). Enquanto que, ao abrir o anel furano, ele se torna uma cetona (cetose).
Essa reação possui um ΔG0 de aproximadamente +1,7 (consertem, pq na foto eu coloquei -1,7), o que significa que está muito próxima do equilíbrio. A única forma de regular uma reação reversível, ou uma reação próxima do equilíbrio, é atravéz das concentrações de reagentes e produtos, ou seja, se aumentar as [ ] de glicose-6-p a reação desloca no sentido da frutose e se aumentar a frutose, desloca no sentido da glicose. Portanto, essa enzima não é regulada pois é de uma etapa reversível.
3ª (PFK1) e 4ª (PFK2) Reações
	PFK1 cataliza uma reação irreversível e, portanto, é regulada. É uma enzima gigantesca, cheia de sítios catalíticos e, portanto, se comporta de maneira alostérica. A PFK1 é o segundo ponto de regulação.
Regulação da PFK1:
Expressão aumentada por insulina.
A PFK possui um sítio para ATP e um sítio para a frutose-6-p. Estes sítios são catalíticos/ativos, que se unem e formam a frutose-6-BP. 
Além destes sítios, ela possui um sítio negativo para ATP. A diferença entre os dois é que o de baixo é catalítico e o de cima é um sítio de efetor alostérico negativo. O ATP quando se liga ao sítio negativo, diminui a atividade da PFK1.
Como a enzima diferencia se o ATP vai ligar no sítio catalítico ou no sítio negativo?? O ATP é substrato da PFK1 e também é seu inibidor, porém, o sítio catalítico tem mais afinidade do que o negativo. Dessa forma, o sítio negativo tem um K0,5 maior.
Vamos supor que o catalítico tenha um K0,5 de 0,5mM e o negativo de 2mM. Nesse caso, se houver 0,5mM de ATP vai se ligar no sítio catalítico e se tiver 2mM de ATP vai ligar no negativo. Porém, a [ ] normal de ATP na célula viva humana é de 1 a 2mM. Isso significa dizer que a PFK1 está sempre inativa. Então, tem que acontecer alguma coisa para que essa enzima se torne ativa.
	
F-2,6-BP
ATP, Citrato
 4ª Reação
Este mesmo substrato da PFK1 pode sofrer a ação de uma outra enzima, que também é reversível, chamada de enzima bifuncional. Ela possui, ao mesmo tempo, função cinase e fosfatase. Pode atuar como fosfofrutocinase 2 (PFK2) ou frutose-2,6-Bifosfatase. A mesma enzima é capaz de adicionar ou remover fosfato dos seus substratos.
Como essa enzima vai saber se é para adicionar ou remover fosfato de seu substrato? Atravéz da sua regulação. Esta enzima é o 3º ponto de regulação. Exige uma atenção especial pois a sua primeira forma de regulação se dá por isoforma.
Regulação da PFK2/F-2,6-BPase:
Isoformas “L” (liver) e “M” (muscle): Uma isoforma expressa no fígado e outra, no músculo.
Isoforma “L” quando fosforilada, ativa a F-2,6-BPase e quando defosforilada ativa a PFK2
Isoforma “M” quando fosforilada ativa a PFK2 quando defosforilada ativa a F-2,6-BPase.
Esse momento em que a glicose entra na célula é pós-prandial. No músculo, a isoforma M está expondo a PFK2, então, quando a frutose-6-p sofre ação da PFK2 e não da PFK1, ela forma frutose-2,6-BP(em vez de fosforilar o carbono 1, fosforila o carbono 6). 
Qual é a importância disso? Voltando para a PFK1, aquela coisa que tinha que acontecer para ativar a PFK1 é a frutose-2,6-BP. Isso porque, a PFK1 tem um sítio para a frutose-2,6-BP que quando se liga, muda a conformação da PFK1, leva o K0,5 do ATP inibitório para 10mM e, portanto liga a enzima.
No gráfico, ficaria assim:
A curva do meio é a enzima normal. A presença de ATP desloca a curva para a direita e a presença de ATP + F-2,6-BP desloca para a esquerda. Portanto, a PFK1 só funciona se tiver F-2,6-BP.
A quebra da frutose-1,6-BP resulta em um aldeído (gliceraldeído3-PO4-3) e uma cetona (Dihidroxiacetona fosfato - DHAP). O aldeído é mais reativo do que a cetona e, por isso, a cetona se transforma em aldeído pela Triose Fosfato Isomerase (TFI) e o aldeído continua a reação por ser mais reativo.
O gliceraldeído vira 1,3-Bifosfo glicerato (1,3-BPG) pela enzima fofogliceratocinase (PGK), e produção de ATP. A piruvato cinase é o 4° Ponto de regulação.
Regulação da PK:
Isoformas “L” (liver) e “M” (muscle): M é a única regulada por fosforilação.
Isoforma “M”: quando fosforilada está ativada
Aumentada por F-1,6BP.
	A PK é a última enzima da via glicolítica e transforma o PEP em piruvato. A F-1,6-BP, que é um metabólito lá do meio davia, estimula a última enzima por uma questão de escoamento, ela estimula logo a última reação da via, para que as outras possam fluir sem “engarrafamento”.