AULA 1 A AULA 9 MICRO E IMUNO

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AULA PRÁTICA 1:
NORMAS DE BIOSSEGURANÇA
VIDRARIAS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS EM LABORATÓRIO
DISCIPLINA: FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
PROFESSORAS: Adeliane Castro da Costa
Graciele Nunes
Pamella Diniz
NORMAS DE BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO
Utilizar os equipamentos de proteção individua (EPIs):
Jaleco manga comprida com punho e na altura do joelho (protege o vestuário de contaminação e de manchas provocadas pelos reagentes);
Luvas;
Máscara;
Óculos de proteção;
Sapatos fechados;
Estar vestido com calça comprida e sapatos fechados;
Usar cabelos presos;
Realizar a lavagem e higienização das mãos: 
Devem sempre ser realizadas ao iniciar o turno de trabalho;
 Sempre depois de ir ao banheiro;
Antes e após o uso de luvas;
 Após a manipulação de material biológico e químico; 
Ao final das atividades;
Antes de deixar o laboratório. 
Não se encostar nas bancadas;
Não passar a mão nos objetos e voltar ao seu corpo;
Não cheirar ou provar soluções;
Evitar colocar objetos pessoais na bancada;
Não levar à boca o material de trabalho (lápis, canetas, etc) e evitar colocar as mãos na boca, nos olhos e no nariz;
Evitar o uso de adereços;
Evitar permanecer sozinho em área de laboratório;
Sentindo-se mal, comunique ao responsável;
Grávidas, somente com consentimento da coordenação;
Não são admitidas no laboratório pessoas suscetíveis a infecções, imunocomprometidas ou imunodeprimidas (recomendação);
Não permitir entrada de estranhos;
Não pipetar com a boca;
Não se alimentar, beber ou fumar no laboratório;
Jamais utilizar instrumentos do laboratório para guardar comidas, cosméticos, medicamentos...
Só manipular equipamento ou utensílio se tiver conhecimento;
Manter o bico de gás aceso somente quando necessário;
Ao final do trabalho guardar todos os reagentes, descartar e higienizar adequadamente as amostras, materiais e vidrarias que foram utilizadas para a aula prática; 
Ao sair do laboratório, verificar se todos os equipamentos estão corretamente desligados e desconectados de suas tomadas;
VIDRARIAS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS EM LABORATÓRIO
Faça uma pesquisa sobre o nome e a utilização das vidrarias e equipamentos ilustradas abaixo. Bom trabalho!
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AULA PRÁTICA 2: 
PREPARO DE MATERIAIS
DISCIPLINA: FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
PROFESSORAS: Adeliane Castro da Costa
Graciele Nunes
Pamella Diniz
Limpeza e Montagem de Material
1. Objetivo
Padronização dos procedimentos de lavagem, secagem e montagem do material de uso no laboratório.
2. Aplicação
Aplica-se à limpeza e/ou esterilização correta do material utilizado no Laboratório para as aulas práticas da disciplina de Fundamentos de Microbiologia e Imunologia (Lab. 105).
3. Conceitos Básicos
3.1- Desinfecção: Processo que envolve o uso de agentes químicos em objetos inanimados como superfícies de trabalho, pisos, material uso e/ou equipamentos.
3.2- Esterilização: Processo que garante eliminação de qualquer forma de vida. Usualmente usa-se a autoclavação (calor úmido sob pressão).
OBS: Qualquer material que entre em contato com fluídos biológicos de qualquer origem deve passar por processo de descontaminação antes da sua reutilização ou encaminhamento para descarte final.
O desinfetante químico mais utilizado, para paredes, vidrarias, bancadas e outro material, é o hipoclorito de sódio a 2,0%, exceto para desinfetar objetos ou superfícies de metal. Para desinfecção de metais, pode-se usar álcool etílico a 70%. 
As bancadas devem ser desinfetadas antes e logo após a realização da sua rotina de trabalho.
4. Material
-Detergente líquido Extran diluído 1x
-Escova própria para tubos
-Esponja
-Recipientes plásticos para descarte das pipetas de vidro
-Recipientes plásticos para descarte de vidrarias e para ponteiras
-Álcool 70%
-Álcool 96°C
-Hipoclorito a 2%
-Água tipo III
-EPI’s: Luvas próprias para lavar material, avental plástico, óculos de proteção e outros.
5. Procedimento para Lavagem e descontaminação
Antes de iniciar a lavagem do material, usar os EPIs para sua proteção e seguir as normas para desinfecção e lavagem de material que entra em contato com fluídos biológicos:
5.1. Material com crescimento de microrganismos e material biológico amostras de material biológico coágulos e sangue total devem ser previamente autoclavado:
Coloque tubos, ependorfs e outros em recipiente de metal (lata), ou saco plástico especial, para uso em autoclave e em seguida faça autoclavação deste material (ver POP 02-uso de equipamentos). Terminada a autoclavação, acondicione o material biológico em saco plástico branco, identificado com o símbolo do risco biológico para descarte em lixo hospitalar. Em seguida lavar as vidrarias, frascos, ependorfs e outros em recipientes com água e sabão neutro (ex. Extran 1x.), enxaguar em água corrente 10x e depois em água destilada. Pôr para secar na estufa 37°C (para plásticos) e 56° (para vidrarias).
5.2.Material que entrou em contato com fluídos biológicos (exceto sangue total e coágulos) 
São previamente descontaminados com solução de hipoclorito a 2% por 24h em recipientes identificados, com tampa e paredes rígidas. Após 24h drenar o hipoclorito na rede de esgoto, com a torneira aberta para diluir o hipoclorito. Usar sabão neutro e enxaguar em água corrente 10x e depois em água destilada. Colocar para secar na estufa 37°C (para plásticos) e 56°C (para vidrarias).
5.3.Pipetas de volume fixo e ajustável, pinças e outras superfícies metálicas
Devem ser desinfectadas com álcool 70% (p/p), antes e após o uso.
OBS.: obedecer Ao volume variável da pipeta: por exemplo: p20 (volume varia de 2 a 20 µl): p200 (volume varia de 20 a 200 µl) sempre em escala decimal. volume menor ou maior pode danificar a pipeta e medirá um volume inexato.
5.4.Pipetas de vidro 
Devem ser mergulhadas em recipiente próprio contendo água, extran e hipoclorito para descontaminação. Para enxaguar as pipetas, fazer conecção do recipiente com a torneira e deixar enxaguar (no mínimo 10 ciclos). Por último enxaguar em água destilada e pôr para secar na estufa.
6. Procedimento para montagem de material 
O material limpo e seco deve ser preparado antes de ser guardado. Calçar luvas para evitar contaminação do material.
6.1.Material não estéril
Frascos, béquers, provetas, garrafas e vidros devem ter sua abertura protegida por papel plástico ou com tampas próprias. Em seguida são armazenados no armário no local destinado (ver etiquetas de identificação).
6.2.Material Estéril
São aqueles destinados a autoclavação ( vide POP.01- Uso de equipamentos: autoclave)
6.2.1.Pipetas de vidro
Colocar algodão hidrófobo na ponta larga da pipeta. São embrulhadas com tiras de papel (jornal) marcar o volume da pipeta no papel depois de embrulhado, usar fita crepe e fita de identificação da autoclavação. Autoclavar e colocar na estufa a 37°C para total secagem. Armazenar em local apropriado.
6.2.2.Vidrarias (garrafas e frascos com tampa)
Colocar a tampa sem enroscá-la totalmente. Colocar um pedaço de papel. Alumínio sobre a tampa e gargalo do frasco e sob este colocar papel pardo, amarrando com liga ou cordão. Colocar fita de identificação da autoclavação. Autoclavar, colocar na estufa para secagem total e armazenar em localapropriado.
6.2.3.Pipetas de Pasteur 
	Colocar um pedaço de algodão hidrófobo na ponta larga da pipeta, são enroladas em alumínio uma a uma e em seguida embrulhadas em papel pardo em grupo de 5, marcar com a fita de identificação da autoclavação. Autoclavar, colocar na estufa para total secagem. Armazenar em local apropriado.
6.2.4.Tubo de Falcon
	Colocar a tampa sem enroscá-la totalmente. Embrulhar em papel pardo. Usando fita crepe e fita de identificação da autoclavação. Autoclavar e colocar na estufa para total secagem. Armazenar em locar apropriado.
	6.2.5.Tubos de vidro
	Embrulhar grupos de 10, em papel alumínio, e em seguida papel pardo. Marcar com fita de identificação de autoclavação. Autoclavar, colocar na estufa para total secagem e armazenar em local apropriado.
	6.2.6.Ponteiras para pipetas automáticas
	São armazenadas em caixas próprias ou em potes de vidro com tampa larga. Embrulhar em papel pardo, identificar o tipo de pipeta (ex. amarelas= pequenas, azuis=grandes ou brancas= volume de 10µL ou menor). Colocar fita de identificação de autoclavação, autoclavar e pôr para secar na estufa. Armazenar em local apropriado
AULA PRÁTICA 3: 
PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
DISCIPLINA: FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
PROFESSORAS: Adeliane Castro da Costa
Graciele Nunes
Pamella Diniz
INTRODUÇÃO
Para o cultivo e identificação de microrganismos, usam-se soluções e substâncias nutritivas chamadas meios de cultura, que devem atender às exigências nutricionais das espécies a serem cultivadas.
OBJETIVO
Preparar diferentes meios de cultura a serem utilizados para o cultivo de microrganismos.
MATERIAL
1-Meio decultura desidratado;
2- Béqueres;
3-Balões Volumétricos; Água Destilada; Balança;
4-Placas de Petri.
MÉTODO
Pesar o pó, seguindo o protocolo indicado, e adicionar separadamente à água destilada, tomando-se o cuidado de homogeneizar a cada componente adicionado. Os meios de cultura mais utilizados em laboratórios de microbiologia estão disponíveis comercialmente, já na forma desidratada. Nestes casos, pesar a quantidade de mistura especificada na embalagem do produto e acrescentar à água destilada.
Ágar MacConkey 
Indicação: Ágar MacConkey é um meio de cultura destinado ao crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a fermentação de lactose. 
Materiais:
Ágar MacConkey ----------- 50g
H2O destilada ----------- 1000 mL
Método:
Dissolver o MacConkey na H2O destilada e agitar bem;
Ferver em micro-ondas ou placa aquecida agitando sempre para dissolver na água por 1 minuto.
O pH final é de 7,0 ± 0,2.
Autoclavar em erlenmeyer a meia rosca por 15 minutos a 121º C/1 atm.
Distribuir em placas ainda quente, antes de solidificar.
Agar Cled 
Indicação: Para isolamento, enumeração e identificação presuntiva de microrganismos presentes na urina e e indicar a fermentação de lactose. Cor natural do meio é um verde.
Resultado: Amarelo (lactose +) Verde (lactose -)
Materiais:
Ágar Manitol ----------- 36g
H2O destilada --------1000ml 
Método:
Dissolver o Cled na H2O destilada e agitar bem;
Aquecer em micro-ondas ou placa aquecida agitando sempre para dissolver na água por 1 minuto;
O pH final é de 7,3 ± 0,2.
Autoclavar em erlenmeyer a meia rosca por 15 minutos a 121º C/1 atm.
Distribuir em placas ainda quente, antes de solidificar.
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Ágar Manitol (HIMEDIA)
Indicação: Para cultivo de qualquer microrganismo (cresce Gram +).
Materiais:
Ágar Manitol ----------- 27,8g
H2O destilada -------------- 1000ml
Método:
Dissolver o Manitol na H2O destilada, agitar bem;
Aquece em micro-ondas ou placa aquecida agitando sempre para dissolver na água até a ebulição;
Autoclavar em erlenmeyer a meia rosca por 15 minutos a 121º C/1 atm;
Distribuir em placas ainda quente, antes de solidificar.
Ágar nutriente 
Indicação: O Ágar Nutriente é utilizado para o cultivo de uma ampla variedade de micro-organismos.
Sumário e Explicação do Produto: No início do século 20, a Associação Americana de Saúde Pública (American Public Health Association, APHA, por sua sigla em inglês) sugeriu a fórmula do Ágar Nutriente como o meio de cultura padrão para o teste em água. O Ágar Nutriente continua sendo o meio de propósitos gerais amplamente utilizado para o crescimento de micro-organismos não exigentes. Quando necessário, enriquecimentos podem ser adicionados a esse meio. O Ágar Nutriente é indicado em muitos procedimentos de métodos padrões para a análise de alimentos, produtos lácteos, água e outros materiais.
Princípios do Procedimento: O nitrogênio, carbono, vitaminas e aminoácidos no Ágar Nutriente são fornecidos pela Digestão Enzimática de Gelatina e Extrato de Carne Bovina. O ágar é o agente solidificante.
Fórmula:
Digestão Enzimática de Gelatina....................5 g
Extrato de Carne bovina……………………….3 g
Ágar …………………………………………..15 g
Materiais:
Ágar Nutriente ----------- 23g
H2O destilada -------------- 1000ml
Método:
Aqueça em micro-ondas, agite e ferva por 1 minuto para dissolver completamente o meio.
Autoclave a 121°C por 15 minutos.
Resposta Esperada de Cultivo: Resposta esperada no Ágar Nutriente a 35 ± 2°C após 18 - 24 horas de incubação.
	Micro-organismo
	InóculoAproximado (UFC)
	Resposta
	Bacillus subtilis ATCC 9372
	10 - 300
	Crescimento
	Escherichia coli ATCC 25922
	10 - 300
	Crescimento
	Salmonella typhimurium ATCC 14028
	10 - 300
	Crescimento
	Staphylococcus aureus ATCC 25923
	10 - 300
	Crescimento
	Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
	10 - 300
	Crescimento
	Streptococcus pyogenes ATCC 19615
	10 - 300
	Crescimento
Os organismos listados são os mínimos que devem ser avaliados para o teste de controle de qualidade.
Ágar sabouraud dextrose 
Indicação: O Ágar Sabouraud Dextrose é utilizado para o cultivo de fungos. 
Sumário e Explicação do Produto: O Ágar Sabouraud Dextrose (SDA) é uma modificação do Ágar Dextrose descrito por Sabouraud. SDA é utilizado para o cultivo de fungos patogênicos e comensais e leveduras. A alta concentração de dextrose pH ácido da fórmula deste ágar permitem a seletividade dos fungos. Para aprimorar o meio, George adicionou cicloheximida, estreptomicina e penicilina para produzir um meio excelente para o isolamento de dermatófitos.
O Ágar Sabouraud Dextrose é utilizado para a determinação do conteúdo microbiano em cosméticos, na avaliação de fungos em alimentos e em diagnósticos de infecções causadas por fungos.
Fórmula:
Digestão Enzimática de Caseína.............................................. 5 g
Digestão Enzimática de Tecido Animal ..................................5 g Dextrose.................................................................................. 40 g Ágar.............................................................................................15g
Materiais:
Ágar Sabouand Dextrose ----------- 65g
H2O destilada -------------- 1000ml
Método:
Aqueça em micro-ondas, agite e ferva por 1 minuto para dissolver completamente o meio.
Autoclave a 121°C por 15 minutos
Resposta Esperada de Cultivo e Teste de Promoção de Crescimento USP/EP/JP: Resposta de Cultivo utilizando o Ágar Sabouraud Dextrose nas temperaturas e tempos de incubação.
	Micro-organismo
	Inóculo Aproximado (UFC)
	Resposta
	Aspergillus niger ATCC® 16404
	Inoculação pontual
	Crescimento
	Candida albicans ATCC® 10231
	10 - 100
	Crescimento
	Microsporum canis ATCC® 36299
	Inoculação pontual
	Crescimento
	Penicillium roquefortii ATCC® 10110
	Inoculação pontual
	Crescimento
	Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533
	Inoculação pontual
	Crescimento
Os organismos listados são os mínimos que devem ser avaliados para o teste de controle de qualidad
AULA PRÁTICA 4:
SEMEADURA
DISCIPLINA: FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
PROFESSORAS: Adeliane Castro da Costa
Graciele Nunes
Pamella Diniz
Técnicas e Semeadura e isolamentode microorganismos
CONCEITOS IMPORTANTES
Isolamento de um microrganismo: O isolamento consiste na obtenção de uma cultura pura (colônias isoladas de um único microrganismo, separando-o de outros que se encontram no mesmo material).
Finalidades do isolamento: Identificação de um microrganismo. A simples observação de características morfológicos não é suficiente para a identificação e classificação dos microrganismos. Para isto, são avaliadas várias características como: características bioquímicas, sorológicas, de patogenicidade, etc. O estudo destas características está na dependência do microrganismo que se pretende identificar.
Semeadura: Consiste na inoculação ou plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um material contaminado qualquer.
Repique: Consiste na transferência de um microrganismo de um meio de cultura para outro, considerando-se o esgotamento nutricional e acúmulo de metabólitos tóxicos no meio, considerando-se a dinâmica de crescimento bacteriano em sistema fechado.
TÉCNICAS DE SEMEADURA
Semeadura em Meio Sólidos
Semeadura em Tubos de Ensaio
Esgotamento de alça: técnica utilizada para obtenção de crescimento bacteriano e/ou para a observação de propriedades bioquímicas da bactéria. A semeadura é, geralmente, feita da base do meio para a extremidade do mesmo (pode também ser chamada de estriamento).
Figura 1: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela técnica do esgotamento (Ex. meio de cultura: TSI)
A semeadura também pode ser realizada da base para a extremidade do meio, de forma uniforme. Esta técnica é realizada para que haja crescimento bacteriano, bem como poderemos utilizá-la para observar funções metabólicas de algumas bactérias.
Figura 2: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela técnica supracitada (Ex. meio de cultura: Citrato de Simmons)
Em Picada: Esta técnica de semeadura é utilizada para que se possa observar funções metabólicas de alguns microrganismos (bactérias) que são submetidas a análise microbiológica.
Figura 3: Figura ilustrativa de dois meios de cultura semeados com a técnica em picada. No tubo à esquerda, observamos o momento da picada que é realizada com o auxílio de uma agulha de semeadura e à direita observamos a picada propriamente dita (Ex. meio de cultura: SIM).
Semeadura em Placas de Petri:
O material a ser semeado deverá conter poucos microrganismos porque o inóculo para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colônia formada na superfície de um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos. Quanto maior o número, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. Quando o inóculo for obtido a partir de meio sólido (inóculo pesado), este poderá ser diluído em salina estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento adequada.
Estrias Múltiplas para Isolamento: Consiste em espalhar o material com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra. Quando o material é muito denso, a alça deverá ser flambada. A semeadura poderá ser realizada em um sentido ou em vários, de acordo com a pessoa que realizará a técnica, lembrando-se sempre que o objetivo principal desta técnica de semeadura é a obtenção do isolamento bacteriano.
Figura 4: Figura ilustrativa de como se deve proceder para realizar a técnica de estrias múltiplas, onde a alça deverá ser deslizada sobre a região onde há um inóculo bacteriano e logo depois deve ser passada na superfície da placa para semeadura com movimentos em ZIG-ZAG, visando o isolamento bacteriano.
Alternativamente, para se obter um tapete uniforme de crescimento microbiano, ou colônias isoladas (após diluição) utiliza-se o método de “espalhamento” em placa. Consiste em espalhar o material (suspensão bacteriana na maioria das vezes) com o auxílio de um swab (para obtenção de tapete uniforme) ou alça de Drigalski (para obtenção de colônias isoladas após diluição), fazendo a semeadura por toda a superfície da placa de Petri a ser utilizada nesta técnica. Deve-se ter o cuidado para que toda a superfície da placa seja semeada, evitando regiões sem semeadura. Recomenda-se que faça o procedimento de semeadura com o swab em três direções distintas, com a alça em toda a superfície rodando a placa.
Alça de Drigalski
Figura 4: Figura ilustrativa do inoculo por esgotamento “espalhamento” microbiano em placa. O material deve ser inoculado girando-se a placa em torno do seu próprio eixo com leve pressão da alça de Drigalski sobre o meio. Alternativamente deve-se segurar a placa realizar movimentos circulares com a alça espalhando por toda a placa o material inoculado.
Em Profundidade ou Incoporação: “Pour-Plate” - técnica que consiste em se adicionar 1 mL de uma suspensão bacteriana que esteja sendo estudada (analisada) a 20 mL de um meio de cultura fundido e resfriado, com posterior homogeneização com movimentos circulares. É utilizada por alguns microbiologistas para quantificar microrganismos.
Figura 6: Figura ilustrativa do inoculo por incorporação microbiana e plaqueamento.
Técnica para semeadura em superfície (meios sólidos):
Retira-se uma alíquota microbiana (o inoculo) do tubo com a alça já flambada e fria;
Abre-se a placa, de modo que a tampa forme um chapéu com a placa;
Coloca-se o inóculo junto a parte superior da placa, procede-se então a técnica de semeadura escolhida;
A seguir a alça deve ser flambada ao rubro esfriada e acondicionada no suporte apropriado, ou a alça de Drigalski ou o swab devem ser desprezados em recipiente apropriado a ser posteriormente esterilizado. Depois de terminado a semeadura, fechar a placa e identificar, levando-a a seguir para incubação na estufa, com a tampa voltada para baixo.
Semeadura em Meio Líquidos:
Difusão: Técnica que consiste em acrescentar microrganismos através da alça ou agulha de platina em meios líquidos. Tem como principal finalidade a observação de propriedades bioquímicas através de testes microbiológicos, bem como poderá ser utilizada para o favorecimento do crescimento bacteriano, quando é realizada em meios que possibilitem o enriquecimento.
Figura 7: Figura ilustrativa de um determinado meio de cultura sendo semeado pela técnica de Difusão, que consiste apenas em colocar um microrganismo em estudo em contato com o meio de cultura.
Técnica para semeadura em meios líquidos:
Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás da chama para proteção do operador);
Retirar a rolha de algodão do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado (que deverá estar na mão esquerda) utilizando-se o dedo mínimo da mão direita. 
Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria;
Flambar novamente a boca do tubo e fechar;
Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar;
Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar;
Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa.
	
MATERIAL POR BANCADA
Todo o material a ser utilizado em cada análise deve ser planejado e preparado com antecedência.
Placas de Petri;
Tubos de ensaio;
Swab de algodão;
Alça bacteriológica;
Alça de Drigalski;
Pipetas;
Entre outros... 
EXECUÇÃO
Cada grupo deverá reproduzir as seguintes técnicas de semeadura:
Semeadura por estrias múltiplas;
Semeadura por espalhamento com swab de algodão e alça de Drigalski;
Semeadura em meio líquido com alça bacteriológica;
Os materiais devem ser identificados e incubadas a 37 °C, por 48h em estufa bacteriológica.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS E DISCUSSÃO
Avaliar o crescimento microbiano nos diferentes meios de cultura e relacionar o tipo de crescimento à técnica de semeadura realizada.
AULA PRÁTICA5: 
COLORAÇÃO DE GRAM
DISCIPLINA: FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
PROFESSORAS: Adeliane Castro da Costa
Graciele Nunes
Pamella Diniz
INTRODUÇÃO
A técnica de Gram, também conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de Gram-negativas.
O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.
A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de Microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. 
O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente provoca a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade.
Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta e as Gram-negativas em vermelho ou rosa.
OBJETIVOS
Realizar procedimentos microbiológicos seguindo as regras de Biossegurança;
Confeccionar esfregaços e fixá-los a partir de uma amostra bacteriana;
Identificar e executar as etapas da técnica de coloração GRAM;
Reconhecer as principais formas e arranjos bacterianos;
Classificar as bactérias de acordo com a técnica de coloração GRAM;
Materiais:
Culturas Bacterianas;
Micorscópios;
Luvas;
Papel absorvente;
Kit para Coloração de Gram;
Alças de platina;
Óleo de imersão;
Lamparina; 
Fósforo;
Lâminas;
Água destilada;
Método:
Flambar a alça corretamente;
Esfriá-la e, em seguida coletar o material na placa de petri;
Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca;
Espalhar o material sobre a lâmina, procurando obter um esfregaço fino e uniforme;
Secar a temperatura ambiente;
Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen (ou lamparina), passando a lâmina algumas vezes pela chama;
Coloração de gram:
Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!
Escorrer o cristal violeta.
Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto. Lavar a lâmina com água corrente.
Cobrir o esfregaço com álcool até que não haja desprendimento de corante primário. Lavar em água corrente.
Cobrir o esfregaço com fuccina por 30 segundos. Escorrer a fuccina e lavar com água corrente.
Secar a lâmina cuidadosamente com papel absorvente, TOMANDO O CUIDADO DE NÃO REMOVER O ESFREGAÇO.
Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!
Escorrer o cristal violeta.
Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto. Lavar a lâmina com água corrente.
Cobrir o esfregaço com álcool até que não haja desprendimento de corante primário. Lavar em água corrente.
Cobrir o esfregaço com fuccina por 30 segundos. Escorrer a fuccina e lavar com água corrente.
Secar a lâmina cuidadosamente com papel absorvente, TOMANDO O CUIDADO DE NÃO REMOVER O ESFREGAÇO.
Observação ao microscópio:
Observar ao microscópio óptico (inicialmente focalize nas objetivas de menor aumento 4X, 10X, 40X e em seguida, coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e encaixe a objetiva de 100X).
Analisar a reação tintorial das bactérias, além da forma e arranjo das mesmas.
AULA PRÁTICA 6: 
DESENHO DE MORFOLOGIAS E RELATÓRIO 
DISCIPLINA: FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
PROFESSORAS: Adeliane Castro da Costa
Graciele Nunes
Pamella Diniz
Faça um desenho esquemático das lâminas que foram visualizadas, descrevendo a forma e/ou arranjos observados e classificação segundo a coloração de Gram.
Como é a parede celular das bactérias Gram + e das Gram -?
Com relação à coloração de Gram, como se diferencia a célula Gram + da Gram -?
Descreva as etapas da coloração de Gram. Qual a função de cada etapa?
Técnica de Ziehl-Neelsen é uma técnica de coloração de bactérias mais agressiva que a técnica de Gram. Ela é usada em bactérias que coram mal com o Gram. Pesquise sobre a coloração de Ziehl-Neelsen, e responda as seguintes questões:
Descreva as etapas da técnica de coloração de Ziehl-Neelsen.
Cite as principais bactérias que devem ser
AULA PRÁTICA 7:
PREPARO DE MATERIAL/ANTIBIOGRAMA
DISCIPLINA: FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
PROFESSORAS: Adeliane Castro da Costa
Graciele Nunes
Pamella Diniz
Preparo de material (planejamento e preparo de todo material a ser utilizado);
Preparo de meio de cultura (Mueller Hinton)
Meio de cultura Mueller-Hinton	
Indicação: Meio de isolamento para testes de sensibilidade aos antimicrobianosutilização pretendida O meio gelosado de Mueller-Hinton é um meio sólido padronizado recomendado para a realização de testes de sensibilidade aos antimicrobianos pelo método de difusão em gelose ou pelo método de diluição em gelose.
Materiais:
Ágar Muller Hinton----------- 36g
H2O destilada -------------- 1000ml
Método:
Aqueça em micro-ondas, agite e ferva por 1 minuto para dissolver completamente o meio.
Autoclave a 121°C por 15 minutos
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AULA PRÁTICA 8: 
SEMEADURA/ANTIBIOGRAMA
DISCIPLINA: FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
PROFESSORAS: Adeliane Castro da Costa
Graciele Nunes
Pamella Diniz
DEFINIÇÃO
Técnica destinada à determinação da sensibilidade bacteriana in vitro frente a agentes antimicrobianos, também conhecido por Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA).
INTRODUÇÃO
A realização do antibiograma e sua interpretação não é uma tarefa fácil, por suas limitações e principalmente pela crescente descoberta de novos mecanismos de resistência, o que exige cada vez mais atualização e treinamento dos profissionais.
A metodologia de Kirby e Bauer para antibiograma é a mais difundida e utilizada até hoje na rotina de análises clínicas, devidoa sua praticidade de execução, baixo custo e confiabilidade de seus resultados. Apesar de sua relativa simplicidade de execução, a técnica de Kirby e Bauer exige que as instruções sejam seguidas rigorosamente de forma que os resultados obtidos correspondam à realidade e possam ser comparados com as tabelas internacionais.
Princípio da técnica: O procedimento consiste no preparo de uma suspensão de bactérias de cultivo recente, inoculação desta suspensão na superfície de uma placa de Agar Mueller Hinton, e adição dos discos de papel impregnados com antimicrobianos. Após a incubação em estufa, é analisado o padrão de crescimento ou inibição ao redor de cada disco, sendo então medido o tamanho de cada halo e o resultado pesquisado em tabelas apropriadas segundo a espécie bacteriana em análise.
MÉTODO
Retirar as placas (placas com o meio Mueller Hinton) e os frascos com os discos (antibióticos) da geladeira cerca de 20-30 minutos para que adquiram a temperatura ambiente antes da execução da prova;
Com uma alça bacteriológica em platina devidamente flambada e resfriada, tocar na colônia de uma amostra de microrganismos a ser analisada;
Suspender as colônias em solução salina estéril (NaCl 0,85%) até se obter uma turvação compatível com o grau 0,5 da escala Mac Farland (1x106 UFC/mL);
Embeber um swab estéril na suspensão bacteriana, comprimindo-o contra as paredes do tubo para tirar o excesso da suspensão, e semear em seguida de forma suave em todas direções na placa (cinco direções), procurando abranger toda a superfície;
Aguardar (não mais que 15 minutos) a superfície do agar secar;
Com auxílio de uma pinça flambada e resfriada, colocar os monodiscos ou multidiscos, sobre a superfície do meio inoculado, exercendo uma leve pressão com a ponta da pinça para uma boa adesão dos discos;
Tomar cuidado para não deixar um espaço muito pequeno entre um disco e outro, pois pode atrapalhar na interpretação dos resultados;
AULA PRÁTICA 9: 
INTERPRETAÇÃO DO ANTIOBIOGRAMA E RELATÓRIO
DISCIPLINA: FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
PROFESSORAS: Adeliane Castro da Costa
Graciele Nunes
Pamella Diniz
Interpretação dos resultados: Com o auxílio de uma régua, paquímetro ou dispositivo semelhante, medir o diâmetro dos halos inibitórios de cada disco, e consultar uma tabela apropriada para determinar se a bactéria em análise é sensível, intermediário ou resistente ao antimicrobiano testado.
Para mais informações: Consultar material de apoio anexo.