Produção de Lisina por Fermentação

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Lisina
Giovana Feitosa
Mélanli Zytkowski
Mônica Sato
Suellen Tosin
Tópicos abordados
● Histórico
● Micro organismos
● Matérias primas
● Esterilização
● Processo
● Controles
● Separação e Purificação do produto
● Tratamento de efluentes
● Método de obtenção 
● Usos e aplicações
● Bioquimismo do processo 
● Mercado
● Artigo
Introdução
➔ Lisina é um aminoácido com cadeia lateral muito polar, 
 o que a torna hidrofílica.
➔ Essencial, não sintetizado pelo organismo, deve ser obtido pela 
alimentação
➔ Usado pela indústria agropecuária para crescimento e ganho de peso dos 
animais
➔ A forma comercial predominante é lisina HCl 
Fonte: Google imagens 
Histórico
➔ Descoberta em 1889, por Dreschel, primeiro a isolar a partir da 
caseína do leite
➔ 1892: elucidação de sua estrutura 
➔ 1902: Fischer e Weigert realizaram a síntese tratando o éster 
7-cianopropylmalônico com ácido nitroso
➔ 1928: preparo da lisina cristalina 
➔ 1960: introduzida comercialmente como aditivo alimentar 
 
Fonte: Google imagens
MSG- Glutamato monossódico
➔ Aumento do interesse para produzir aminoácidos;
➔ 1907: Na Universidade Imperial de Tóquio foram feitos estudos 
com objetivo de identificar e purificar o sabor principal das algas 
 extrato de MSG
➔ Ajinomoto Co. começou extrair MSG e vendê-lo como realçador de 
sabor
Ajinomoto Animal Nutrition 
➔ Empresa multinacional japonesa, no Brasil desde 1956,
no estado de São Paulo
➔ Pioneira na América Latina, sendo a maior produtora de 
aminoácidos do mundo
➔ Produção de glutamato monossódico e L-lisina por fermentação 
Fonte: Google imagens
Mercado
➔ Estimativas apontam que no período de 2015-2020 o segmento de 
aminoácidos deve crescer cerca de 7,3% ao ano, chegando aos US$12,6 
bilhões em 2020
➔ O mercado de aminoácidos para aplicações em rações está projetado 
para crescer a uma taxa maior (5,4% ao ano), passando de US$4,4 
bilhões de 2013 para US$5,7 bilhões em 2018
O mercado mundial de L-lisina, atualmente, gira em torno de 1.300.000 ton ao
ano, com um crescimento médio anual de 8% ao ano. Os maiores produtores são
a japonesa Ajinomoto (com cerca de 24% da produção mundial) e a sul coreana
CJ CheilJedang (cerca de 23% da produção mundial) ambas com plantas 
industriais em solo brasileiro. 
Fonte: IHS Markit
Usos e Aplicações 
➔ Suplemento na alimentação animal otimização do crescimento de porcos, frangos
➔ Agentes nutricionais no cuidado neonatal
➔ Terapêuticas para herpes 
➔ Aditivo para melhorar o balanço de aminoácidos de proteínas vegetais
➔ Componente para alimentos para a saúde e nutrição esportiva
➔ Ajuda no crescimento ósseo, auxiliando na formação de colágeno
➔ Produtos para os cabelos como xampus e condicionadores e o seu sal de ácido láurico 
é adicionado a cosméticos 
Fonte: Google imagens
Fonte: Google imagens
Fonte: Google imagens
Dieta 
➔ Carnes
➔ Peixes
➔ Lacticínios 
➔ Soja
A necessidade diária de um adulto do sexo
masculino é 12mg por kg de peso corporal
Micro organismos 
➔ Fungos:
◆ Ustilago maydis
➔ Bactérias 
◆ Corynebacterium glutamicum
◆ Escherichia coli
➔ Leveduras 
◆ Pichia
Corynebacterium glutamicum
➔ Produz vários aminoácidos como: L-glutamato, L-fenilalanina, 
L-treonina, L-triptofano, L-lisina, entre outros;
➔ São usadas técnicas de engenharia genética, envolvendo mutações 
pontuais, para melhorar os genes relacionados à produção de 
aminoácido;
◆ Permite uso mais amplo de fontes de carbono e também o 
glicerol;
◆ Aumentar o rendimento do aminoácido alvo
Fonte: WITTMAN, C.; BECKER, J., 2007
Matérias primas
➔ A escolha depende em grande parte da disponibilidade, que depende da 
localização geográfica da planta de produção
➔ O custo da fonte de carbono, afetará o custos totais de fermentação, como 
para, produtos a granel de baixo preço, como a L-lisina. 
Matérias-primas
➔ Substratos:
SUBSTRATO ARTIGO
Hidrolisado de semente de jaca - ANSUREE, M.; NAMPOOTHIRI, M., 
2015.
Melaço de cana, beterraba - LIU, C. Y. et al., 1992.
Hidrolisado de amido - TOSAKA, O.; ENEI. H.; HIROSE, Y., 
1983.
Batata doce 
Farelo de soja 
Milho, trigo ou mandioca
➔ O preço do açúcar está numa crescente em todo o mundo e têm um 
impacto severo na economia e no processo de fermentação.
➔ Existe um interesse crescente no uso de produtos alternativos, 
não-alimentares e de baixo custo, fontes de carbono, como soro de leite, 
lignocelulose e metanol, como matéria-prima em fermentações 
microbianas para a produção de produtos químicos como 
biocombustíveis, biopolímeros e aminoácidos.
Fonte: REVISTA ESPACIOS ,The international trade of sugar 
commodity in the XXI century: Main political aspects, 2016
Lignocelulose
➔ Polímeros de carboidratos celulose e hemicelulose estão fortemente 
ligados à lignina.
➔ O C. glutamicum pode naturalmente consumir uma variedade de 
diferentes açúcares, mas o nível de produção de L-lisina nos açúcares 
varia.
Metanol
➔ Metanol é uma matéria prima pura que pode ser completamente utilizado 
em processos de fermentação bacteriana
➔ Espera-se que os preços do metanol permanecerá em um nível 
relativamente baixo nos próximos anos, desde que as reservas de gás 
natural estejam disponíveis.
➔ Baixo custo, disponibilidade, alta pureza e solubilidade em água
Processo de produção 
➔ São classificados em três tipos diferentes:
◆ Extração: Como a extração depende da disponibilidade de matérias-primas naturais 
ricas em proteínas, como queratina, soja, é difícil atender à crescente demanda por 
aminoácido
◆ Síntese química: gera uma mistura de formas D e L de aminoácidos e um passo de 
resolução óptica é necessário para obter a L-isômero biologicamente ativo. Devido aos 
altos custos de produção associados a esta etapa de resolução, poucos aminoácidos são 
produzidos por tais métodos.
◆ Métodos biotecnológicos: Dividido em síntese enzimática e fermentação
Processo de produção 
● Síntese enzimática: vantagem de produzir L-aminoácidos opticamente 
puros em concentrações mais elevadas e com menos subprodutos, 
simplificando assim os processos de purificação. 
Não é um método significativo, não foi tão popularizada comparada a 
fermentação, levando a poucos processos novos.
Processo de obtenção
● Fermentação: microrganismos convertem os açúcares do substrato 
em aminoácidos.
● Vantagens:
○ Método econômico
○ Produz somente a forma L-aminoácidos facilita a 
purificação
○ Permite a produção em larga escala industrial 
○ Sob condições brandas prevene a degradação
● Temperatura para crescimento: 30°C
● pH para crescimento: 7
● Oxigênio: aerobiose e agitação
Condições ideais
Fonte de carbono: frutose < sacarose < glicose, ribose, manose, maltose, glicerol
Fonte de nitrogênio: sulfato de amônio controle de pH 
Agente tamponante: carbonato de cálcio
Vitaminas: Biotina
Esterilização: Autoclave 120°C , 20 min
Biorreator: até 500–1000 m3 são padrão em produção de aminoácidos a granel
Processo: 
Descontínuo não é mais o método preferido, ainda usado em pequenas plantas, 
desvantagem: uma quantidade limitada de fonte de carbono pode ser usada no meio de crescimento, e 
isso limita a concentração máxima de produto de L-lisina no processo.
Descontínuo alimentado processo preferido,usada para separar o crescimento e a fase 
de produção da cultura, e isso normalmente leva maior rendimento e produtividade de L-lisina, em 
batelada, depois de reator cheio, maior parte da cultura de células é removida, porém uma quantidade é 
mantida e serve como inóculo para a próxima rodada, tempos de preparação reduzido (isto é, 
esvaziamento, lavagem e esterilizaçãode fermentadores)
 
Contínuo apesar de seu potencial para aumentar a produtividade e reduzir os custos de 
investimento, tem até agora uma aplicação limitada para produção industrial de L-lisina, desvantagem é 
maior risco de contaminação
Bioquímica
● 2 vias foram identificadas:
○ Via da glicólise;
○ Via das pentoses fosfato (PPP).
Fonte: Fonte: WITTMAN, C.; BECKER, J., 2007
Bioquímica
● Ciclo do ácido tricarboxílico
● Via do aspartato;
Fonte: Fonte: WITTMAN, C.; BECKER, J., 2007
Bioquímica
● Estudos sobre a otimização da produção de Lisina:
○ modificação de enzimas como: exportador de lisina e 
aspartato-quinase.
● Aspartato-quinase: enzima chave para o controle metabólico da via, pois 
faz inibição por meio de feedback por treonina e lisina
○ Mutação pontual libera a enzima do feedback aumenta lisina
Bioquímica
Fonte: Fonte: WITTMAN, C.; BECKER, J., 2007
Purificação 
● lisina é extracelular-> centrifugar-> utilizar sobrenadante;
● Filtração a vácuo;
● Evaporação e secagem por pulverização ;
● Membranas carregadas eletricamente (separa aminoácidos entre si);
● Cristalização e recristalização;
● Cromatografia 
Tratamento de efluentes
➔ Remoção de corantes da indústria têxtil por biossorção a partir de biomassa residual do processo 
de fermentação da lisina
Artigo
● Estudos comparativos para a produção biotecnológica de L-Lisina por 
células imobilizadas de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 e 
geneticamente modificada MH 20-22 B
Introdução
● A produção de aminoácidos por meio da fermentação é feita por 
aproximadamente 50 anos;
● L-lisina é o segundo aa mais produzido
○ suplemento alimentares;
○ uso terapêutico;
○ aditivo para melhorar crescimento de aves e suínos.
● Pesquisas sobre:
○ otimização de bioprocessos;
○ rotas biossintéticas;
○ busca por outros microorganismos.
Introdução
● O processo biotecnológico para produção de lisina por C. glutamicum 
requer melhoria contínua, com atenção especial na otimização do 
processo e engenharia genética;
● Objetivo: analisar o bioprocesso e estudos comparativos da produção de 
L-lisina por células imobilizadas, em biorreator de tanque com agitação.
Materiais e Métodos 
● C. glutamicum ATCC 13032 e C. glutamicum MH 20-22 B foram 
cultivadas em ágar contendo
○ peptona
○ extrato de carne
○ NaCl
○ água destilada
○ pH = 7
Materiais e Métodos 
● Composição do meio:
○ Glucose
○ Extrato de carne
○ peptona
○ NaCl
○ água destilada 
○ pH = 7
● Inóculo: 50mL, agitador por 48h, 30°C
Método de imobilização
● 72mL da cultura foram imobilizadas com alginato de cálcio. 
● Consiste em aprisionar o microorganismo em uma matriz como o alginato.
○ Confere maior estabilidade das células;
○ Inóculo com elevado número de células;
● As duas cepas foram imobilizadas
Processo de produção
● Método: descontínuo;
● Esterilização: autoclave, 120°C por 20 min;
● pH= 7
● Temperatura: 30°C;
● Biorreator: tanque com agitação;
● Células imobilizadas foram adicionadas ao meio de fermentação e foram 
avaliados diferentes parâmetros;
Estimativa analítica de L- lisina e substratos 
➔ A concentração celular foi determinada por espectrofotômetro em 660 nm
➔ Sobrenadante da fermentação foi usado para quantificação de substratos e produtos que 
foram obtidos por separação da biomassa por centrifugação
➔ A L-lisina foi quantificada por método colorimétrico;
➔ A concentração de glicose foi determinada por método de hidrólise ácida de carboidrato: a 
quebra do carboidrato em açúcares menores gerando um composto colorido. 
➔ Açúcar residual foi determinado por método colorimétrico
➔ Biomassa no caldo foi estimado por centrifugação de 1mL da amostra que foi levada ao forno 
a 105ºC até peso constante.
Efeito do tempo de fermentação na produção de 
L-lisina 
● Observaram que à medida que o tempo de fermentação aumenta a concentração da glicose 
residual diminui entre 40 e 120 h.
● Concentração de L-lisina foi relativamente menor para as primeiras 70 hrs e as células foram 
multiplicadas com rápido crescimento de biomassa.
● Como a fermentação prossegue o consumo de glicose e produção de L-lisina aumentou em 96 h 
com alta utilização de açúcar e concentração máxima de L-lisina. Após 96 h, o produto máximo 
alcançou uma tendência de queda, A concentração de L-lisina e os rendimentos foram encontrados 
para ser diminuído; apesar de um aumento no tempo de fermentação devido a depleção de 
nutrientes
Os resultados apresentados nas Figs. 1 e 2 mostram que a produção 
de L-lisina foi boa em 96 h, o que é o melhor tempo de fermentação 
para a produção de L-lisina por células imobilizadas de C. 
glutamicum MH 20-22 B.
Efeito da temperatura na produção de L-lisina
➔ A taxa de crescimento do microorganismo bacteriano depende da 
temperatura 
➔ Qualquer alteração na temperatura pode levar a alteração da taxa de 
utilização do substrato, desequilibrando a quantidade de nutrientes do meio 
em relação a taxa de crescimento
➔ Para ambas as cepas a temperatura de 30°C foi a que obteve maior 
concentração de Lisina
➔ Temperaturas mais elevadas podem afetar as atividades celulares, alterando 
as atividades enzimáticas
 
Efeito do pH na produção de L-lisina
 pH pelo acúmulo de subprodutos NaOH, CaCO3 controle 
➔ Cultura de lisina varia de 5 a 8, o pH ótimo é de 7,5
Efeito da concentração de glicose na produção de 
L-lisina
➔ A capacidade de crescimento das células depende da disponibilidade de glicose no reator.
➔ O efeito da concentração de glicose no rendimento de L-lisina foi expresso com base de lisina 
produzida por unidade de substrato utilizada
➔ maior concentração de glicose inibiu o crescimento bacteriano juntamente com baixo 
rendimento
➔ Como a concentração de glicose é aumentada simultaneamente concentração de biomassa 
também é aumentada.
➔ concentração excessiva de substrato presente no caldo de fermentação leva a diminuir na 
concentração do produto
Efeito da taxa de fluxo de ar na produção de 
L-lisina
➔ Se o excesso de oxigênio for fornecido, pode levar à formação de outros metabólitos como ácido 
succínico e ácido láctico e baixa disponibilidade de oxigênio diminuir a produção do produto alvo
➔ 1,0 vvm foi considerado como o melhor fluxo de ar
Efeito da taxa de agitação na produção de L-lisina
Homogeneidade espuma leva caldo para fora o biorreator contaminando o sistema
➔ ótima taxa de agitação para alta a produção de L-lisina é de 200 rpm, Assim, a aeração e a 
agitação ideais devem ser operadas, o que minimiza a formação de espuma e maximiza a 
taxa de produção de lisina.
Conclusão
➔ Foram analisadas sob várias condições físicas e químicas parâmetros do processo.
➔ Concluímos que as células imobilizadas do C. glutamicum mutante MH 20-22 B produziu mais 
lisina em comparação com tipo selvagem C. glutamicum ATCC 13032.
Referências
ANSUREE, M.; NAMPOOTHIRI, M.; Biosynthesis, recovery and purification of l-lysine from jackfruit seed 
(JFS) hydrolysate by Corynebacterium glutamicum DM 1729. Biocatalysis and Agricultural 
Biotechnology. v. 4, n. 4, p. 506-513, out. 2015.
D’ ESTE, M., MORALES, M. A., ANGELIDAK, I.; Amino acids production focusing on fermentation 
technologies – A review. Biotechnology Advances. v. 36, n. 1, p. 14-25, fev. 2018.
LIU, Y. C. et al; On-line State Estimation for L-Lysine Fermentation. IFAC Proceedings Volumes. v. 25, n. 
2, p. 279-282, mar. 1992.
WITTMAN, C.; BECKER, J.; The L-Lysine Story: From metabolic pathways to industrial production. 
Alemanha, fev. 2007. Disponível em: 
<http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.321.2447&rep=rep1&type=pdf>Acesso em 10 
jun. 2018.
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