Seminário sobre Pirosequenciamento

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APRESENTAÇÃO DEFINITIVA 
PRIMEIRO SLIDE: INTRODUÇÃO 
Como já é sabido, o sequenciamento de DNA consiste num processo de determinação 
da sequência de nucleotídeos em um pedaço de DNA. O Pirosequenciamento é uma 
dessas técnicas, só que é considerado um Sequenciamento de Segunda Geração ou 
Próxima Geração de Sequenciadores. 
Esses novos sequenciadores têm como principais características o aumento da escala 
de análises genômicas, sequenciando e genotipando milhares de regiões do genoma 
de interesse em um único passo, gerando grande volume de dados biológicos. Essas 
novas plataformas possuem como características comuns um poder de gerar 
informação muitas vezes maior que o sequenciamento de Sanger, com uma grande 
economia de tempo. 
SEGUNDO SLIDE: HISTÓRICO 
A técnica do Pirosequenciamento foi criada no ano de 1986 por Pål Nyrén no Conselho 
de Pesquisa Médica de Biologia Molecular (LMB) no Reino Unido. 
Pål Nyrén em seu Pós-Doutorado, em dado momento se deu conta de que a detecção 
do pirofosfato poderia ser utilizada para o sequenciamento do DNA. 
Um de seus projetos foi isolar e sequenciar o gene da proteína portadora de fosfato 
mitocondrial bovino. Ele fez o sequenciamento de Sanger manualmente utilizando 
nucleotídeos marcados radioativamente e géis finos de acrilamida para a detecção e 
separação. Como o processo de sequenciamento era muito trabalhoso ele pensava que 
seria ótimo poder simplificar, tornando o processo mais rápido e menos cansativo. 
Durante o tempo em que ele permaneceu como estudante de doutorado na 
Universidade de Estocolmo (Suécia), ele trabalhos extensivamente com a 
modificação e simplificação de uma variedade de métodos, bem como a criação 
de novos procedimentos. Num certo dia ele teve a ideia de uma técnica alternativa de 
sequenciamento de DNA em que o conceito básico era acompanhar a atividade da 
DNA polimerase durante a incorporação de nucleotídeos em uma fita de DNA, 
analisando o pirofosfato liberado durante o processo. Só que essa técnica só foi 
completamente desenvolvida 10 anos depois. 
TERCEIRO SLIDE: HISTÓRICO- POR QUE A DETECÇÃO DO PIROFOSFATO? 
Outro Projeto desenvolvido por ele foi a respeito do isolamento e estudo de uma enzima 
endógena de uma bactéria fotossintética. A enzima era a pirofosfatase inorgânica de 
translocação de prótons e ela está envolvida na foto fosforilação e cataliza a síntese do 
pirofosfato movido a luz. Anos depois ele desenvolveu um método luminométrico muito 
sensível capaz de acompanhar a síntese de pirofosfato em tempo real. 
Durante o decorrer dos 10 anos até a conclusão da técnica, ele sofreu com muita 
dificuldade para a obtenção de financiamento e suporte para a ideia, assim como para 
resolver os problemas que surgiram conforme o projeto evoluía 
QUARTO E QUINTO SLIDES: COMO FUNCIONA O PIROSEQUENCIAMENTO? 
No Pirosequenciamento 4 enzimas são utilizadas: DNA Polimerase I, ATP sulfurilase, 
Luciferase e Apirase. Dois substratos para a ação das enzimas são utilizados: 
adenosina 5' fosfossulfato (APS) e luciferina. Um molde de sequenciação com um 
iniciador hibridado também é usado como material de partida para a DNA polimerase. 
No pirosequenciamento, a reação de sequenciamento é monitorada através da 
liberação de um pirofosfaro durante cada incorporação de nucleotídeos. O 
pirofosfato liberado é usado em uma série de reações químicas que resultam na geração 
de luz. 
Quatro enzimas convertem a síntese da molécula de DNA em um padrão de sinais de 
luz. O alongamento do DNA catalisado por DNA polimerase, que é acompanhada da 
liberação de pirofosfato. A ATP sulfurilase converte o pirofosfato em ATP. A 
luciferase oxida a luciferina e converte o ATP em um sinal de luz, que é gravado. 
Finalmente a Pirase remove quaisquer nucleotídeos que não forem incorporados que 
permaneceram na reação. O sinal de luz é proporcional a quantidade de nucleotídeos 
incorporados a fita de DNA sintetizada. Quando 3 nucleotídeos são incorporados pela 
DNA polimerase, três moléculas de pirofosfato são gerados, e estas moléculas são 
convertidas em três moléculas de ATP. O poder oxidativo da luciferase sobre a luciferina 
provoca a geração de luz e com isso é registrado um pico triplo por conta dos três 
nucleotídeso que foram adicionados. Os nucleotídeos que permaneceram não 
incorporados na molécula são removidos para o início de uma nova incorporação. 
Nucleotídeos são adicionados na reação em uma ordem de distribuição predefinida. Se, 
durante a dispensação, nenhum nucleotídeo for incorporado, nenhum pirofosfato é 
gerado e consequentemente nenhum sinal de luz é gravado. Os nucleotídeos que não 
são incorporados não ocasionam sinais de luz justamente por não gerar piroposfato, e 
consequentemente não gerar ATP e luz. Outra adição de nucleotídeos ocorre, só que 
dessa vez dois nucleotídeos são gerados. O pirofosfato gerado é convertido em ATP e 
um sinal de luz correspondente é gravado, só que dessa vez um duplo pico ocorre. O 
padrão dos sinais de luz gravados são facilmente interpretados e representam as 
verdadeiras sequências de nucleotídeos do DNA analisado. 
No entanto, o alto custo de reagente e a taxa de erro sobre cadeias de 6 ou mais 
homopolímeros reduziram suas aplicações. 
SEXTO SLIDE: APLICAÇÕES 
ARTIGOS 
Massively parallel pyrosequencing in HIV research (Bushman et al, 2008) 
O artigo demonstra a importância do Pirosequenciamento sobre os locais de integração 
do HIV no genoma humano, utilizando o método de Sanger, foram encontrados 500 
locais de integração, já com a técnica de pirosequenciamento foram encontrados cerca 
de 40.000 locais. Cada aumento no número de locais de integração, leva a novas 
descobertas a respeito do mecanismo de ação do HVI sobre os humanos. Essas 
informações obtidas são de extrema importância para a terapia gênica. 
Application of next-generation sequencing technologies in virology (Radford et al. 
2012) 
O artigo demonstra a importância e o impacto das informações geradas nos 
procedimentos de sequenciamento para as áreas da virologia, desde o diagnóstico até 
a patogênese, e desde o criação da vacina até a evolução viral e a ecologia do vírus. O 
crescimento da quantidade de bases sequenciadas de vírus e fagos em cerca de 20-
24% anualmente. 
Em decorrência de algumas limitações existentes nas metodologias de Primeira 
Geração como o grande custo quando aplicado a genomas grandes e sua constante 
dependência de métodos como a PCR novos métodos foram desenvolvidos: Os 
métodos de Segunda geração que revolucionaram a arte de sequencias, podendo gerar 
várias bases em um curto espaço de tempo, quando comparados as tecnologias 
anteriores e permitindo uma maior acessobilidade aos campos da biologia. 
Application of pyrosequencing technique for improved detection of K-Ras 
mutation in formalin-fixed and paraffin-embedded prostate carcinoma tissues in 
Chinese patients (SHA et al, 2012) 
No estudo em questão, o pirosequenciamento foi utilizado para a detecção de mutações 
relacionadas ao câncer de próstata, e ele se mostrou mais eficiente do que o 
sequenciamento de Sanger (8,91% vs. 3,96%), por não requerer eletroforese, marcação 
de nucleotídeos ou de primers, dentre outras características. Em outros estudos em 
outros tipos de câncer, o Pirosequenciamento se mostrou mais eficaz na detecção de 
mutações. 
Através do estudo também foi concluído que a mutação estudada (PCa K-Ras) são mais 
frequentes na população chinesa do que nos EUA, mas a frequência é muito semelhante 
com a de outros países asiáticos, assim, é possível inferir que tais mutações 
desempenham um papel étnico-específico na patogenia do câncer de próstata. 
SÉTIMO SLIDE: PRÓS E CONTRAS 
PRÓS• Pode ser automatizada; 
• Alto rendimento; 
• Tempo de análise curto; 
• Ilimitado número de amostras; 
• Leitura em tempo real (pequenas faixas de DNA); 
• Preparação rápida da amostra 
CONTRAS 
• Custo elevado; 
• Grande conhecimento de bioinformática; 
• Taxa de erro relativamente alta (0,0098). 
OITAVO SLIDE: NOTÍCIA 
Pesquisadores do Instituto de Microbiologia da UFRJ, coordenados pelos 
professores Alexandre Rosado e Raquel Peixoto, realizam uma pesquisa sobre 
micro-organismos da Antártica, com o auxílio do Programa Antártico Brasileiro 
(Proantar). 
As amostras foram isoladas de plantas vasculares (plantas com tecidos especializados 
para o transporte de água e seiva) e outros ambientes típicos da região. 
Devido ao clima único, a Antártica possui ecossistemas terrestres e marinhos com 
micro-organismos que possuem características especiais como resistência a baixas 
temperaturas (psicrófilos). Outra propriedade já descrita é a alta resistência a radiações. 
Uma espécie de Deinococcus sp. isolada da Antártica pode suportar 5.000 vezes mais 
radiação do que qualquer outro micróbio conhecido. Com o auxílio da técnica de 
pirosequenciamento, milhares de sequências de DNA foram analisadas e muitas novas 
espécies descobertas, demonstrando a grande diversidade microbiana da Antártica. 
Parte desses resultados foi publicado na revista ISME Journal, que faz parte do grupo 
de publicações da Nature. Essa pesquisa comprova o grande potencial dessas amostras 
para estudos biotecnológicos. Micro-organismos psicrófilos têm grande aplicação 
em vários setores industriais como na produção de biosensores, enzimas, 
processos de biorremediação e na indústria de alimentos. Por produzirem 
substâncias bioestabilizadoras, podem ser utilizados na indústria de cosméticos 
e são fonte para pesquisa de novos antibióticos