Roteiro Cocos Gram Positivos Atualizado

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
Centro de Ciências da Saúde 
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas 
Microbiologia Clínica – ACT 0039 
 
Professores: Ivanaldo Amâncio da Silveira 
 Maiza Rocha de Abrantes 
 
 
 
 
 
ROTEIRO DE AULA PRÁTICA 
 
 
 
Dentre os cocos Gram positivos serão enfatizados na aula prática os 
gêneros: estafilococos, estreptococos e enterococos. 
Para a identificação de cocos Gram positivos, é necessária a avaliação 
preliminar da característica macroscópica da colônia microbiológica, bem como 
a realização do esfregaço e coloração de Gram confirmando a presença de 
CGP em microscópio óptico (objetiva 1000X – imersão). Ao microscópio, estes 
microrganismos apresentam forma arredondada (cocos) e coloração roxa ou 
azulada. Podem apresentar arranjo em pares ou cadeias (estreptococos) ou 
em forma de “cachos de uva” (estafilococos). Além disso, esses 
microrganismos podem apresentar dois tipos de hemólise em ágar sangue: β-
hemólise, que consiste na hemólise total das hemácias e α-hemólise, que 
consiste na hemólise parcial. Além de ser possível a presença de γ-hemólise 
(ausência de hemólise). 
 A identificação e diferenciação dos gêneros dos cocos Gram positivos se 
inicia com a prova da catalase, cuja finalidade é verificar a presença da 
enzima catalase que decompõe H2O2 em H2O e O2 e, dessa forma, distinguir 
os grupos estafilococos (catalase +) dos estreptococos e enterococos 
(catalase -). 
 COCOS GRAM POSITIVOS / CATALASE POSITIVA 
Após a realização da prova da catalase é necessário realizar a prova da 
coagulase cuja finalidade é verificar se o microrganismo possui a coagulase 
(ou fator aglutinante) que reage com o fibrinogênio do plasma produzindo a 
rede de fibrina. Podem ser produzidas duas formas diferentes de coagulase: a 
ligada e a livre. A coagulase ligada, também conhecida como fator de 
aglutinação, permanece ligada à parede celular do microrganismo. A coagulase 
livre consiste numa enzima extracelular produzida quando o microrganismo é 
inoculado em tubo de ensaio contendo plasma de coelho. A prova da 
coagulase é utilizada para diferenciar Staphylococcus aureus (coagulase +) 
dos estafilococos coagulase negativa. 
COCOS GRAM POSITIVOS 
O teste da DNase tem por finalidade verificar se o microrganismo possui 
a enzima desoxirribonuclease, a qual degrada o ácido nucléico (DNA). A 
formação de halo claro ao redor do crescimento bacteriano após a deposição 
do ácido clorídrico 1N identifica Staphylococcus aureus. Crescimento 
bacteriano sem formação de halo identifica os estafilococos coagulase 
negativa. 
O teste da Novobiocina tem por finalidade verificar se o microrganismo 
apresenta resistência a esse antimicrobiano. Prepara-se uma suspensão 
bacteriana que é distendida em Ágar Mueller-Hinton e depois faz a inoculação 
de um disco de novobiocina. A formação de um halo de inibição ≤ 16 mm 
identifica Staphylococcus saprophyticus. 
COCOS GRAM POSITIVOS / CATALASE NEGATIVA 
A classificação do tipo de hemólise é fator primordial para indicar quais 
as provas de identificação devem ser realizadas a fim de chegar as espécies 
de cocos Gram positivo, catalase negativa. Vários testes de identificação 
bioquímica são realizados na rotina diária do laboratório de Microbiologia para 
identificação dos cocos gram positivos. 
A Prova da Bacitracina deve ser realizada para as colônias beta-
hemolíticas em Agar Sangue para avaliar a sensibilidade dos estreptococos à 
Bacitracina 0,04 Unidades. Prepara-se uma suspensão bacteriana que é 
distendida em Agar Sangue e se inocula um disco de bacitracina 0,04 
unidades. Qualquer halo produzido se considera como sensível à bacitracina. 
O Teste de Camp deve ser realizado para as colônias beta-hemolíticas 
suspeitas de serem Streptococcus agalactiae que produzem uma proteína 
(fator camp) que atua sinergicamente com cepas ATCC (American Type 
Culture Collection) de Staphylococcus aureus 25923 produtoras de beta-lisina. 
Realiza uma estria da cepa ATCC de Staphylococcus aureus e perpendicular à 
mesma faz outra estria com a possível cepa de Streptococcus agalactiae. Se 
for produzida após incubação uma seta na interseção das duas estrias , o teste 
é considerado positivo. 
O Teste do Hipurato de sódio é utilizado para identificação da 
presença da enzima hipuricase ou hipurase produzida pelas cepas de 
Streptococcus agalactiae que fazem a hidrólise do hipurato de sódio. 
A Prova da Optoquina deve ser realizada para as colônias alfa-
hemolíticas em Agar Sangue com suspeita de serem Streptococcus 
pneumoniae que normalmente são sensíveis a esse composto, assim como a 
prova da bile solubilidade que promove a solubilização dos cocos em Agar 
Sangue. 
O teste em ágar Bile-Esculina diferencia os Enterococcus spp. de 
outros Streptococcus spp., tendo como princípio a hidrólise da esculina 
presente no meio de cultura bile-esculina pela bactéria, formando esculetina e 
dextrose. A esculetina reage com sais de ferro presente no meio de bile-
esculina tornando-o enegrecido. A presença de cor enegrecida na superfície do 
meio bile-esculina, identifica Enterococcus spp. Quando o meio permanece 
inalterado, identifica outros Streptococcus spp. 
O teste de crescimento em NaCl 6,5% determina a capacidade do 
microrganismo de crescer em altas concentrações de sal. A turvação ou 
mudança de cor (no caso da adição de indicador) indica crescimento de 
Enterococcus spp. 
O teste de PYR determina a atividade da enzima pirrolidonil arilamidase 
produzida pelo Streptococcus pyogenes, mas não pelos demais estreptococos 
β-hemolíticos. Colônias β-hemolíticas de enterococos podem ser confundidas 
com S. pyogenes, pois ambas apresentam positividade neste teste. Teste de 
PYR positivo apresenta o desenvolvimento de coloração vermelha. Os 
Streptococcus pyogenes e os Enterococcus spp. são PYR positivo. 
 
 
 
 
1. Em lâmina de vidro seca, colocar 2 gotas de peróxido de hidrogênio e a 
partir do crescimento de colônias na placa de Agar Manitol Salgado, 
adicionar as mesmas ao peróxido de hidrogênio H2O2 e observar se 
ocorre a formação de bolhas ou efervescência que caracteriza a 
presença da enzima Catalase. 
 
2. Em caso de positividade, adicionar 3 a 4 colônias da bactéria em estudo 
em plasma de coelho diluído contido em um tubo de ensaio pequeno e 
incubar durante 3 horas em estufa de cultura, observando depois se 
houve a formação ou não de coágulo – Coagulase livre. Da mesma 
placa de Agar Manitol Salgado retirar colônias e colocar em uma gota de 
plasma de coelho fazendo homogeneização e movimentos rotatórios e 
observar se ocorre a formação de grumos – Coagulase ligada. 
 
 
3. Utilizando as mesmas colônias que deram teste da coagulase positivo, 
fazer semeadura em estria reta em uma placa pequena de Ágar DNase 
e incubar à 35ºC ou 37ºC durante 24 horas. A partir do crescimento após 
24 horas, promover a revelação da presença da enzima Dnase 
utilizando solução de Ácido Clorídrico 1N. Observar a formação de um 
PROCEDIMENTO 
halo claro ao redor do crescimento bacteriano que indica a 
despolimerização do DNA contido no meio de cultura. 
 
4. A partir do crescimento de colônias em Agar Cled, preparar suspensão 
bacteriana utilizando salina estéril. A seguir, realizar semeadura por 
distensão em placa pequena de Agar Mueller-Hinton utilizando swab 
estéril. Deixar a placa em repouso e com auxílio de uma pinça colocar 
um disco de novobiocina com a finalidade de identificar Staphylococcus 
saprophyticus que é resistente a esse antimicrobiano. 
 
5. Observar o crescimento de colônias em Agar Cled provenientes de 
infecção do trato urinárioe realizar semeadura em estria reta ou sinuosa 
em tubo de ensaio contendo Bile-Esculina e fazer semeadura em 
difusão em caldo de cloreto de sódio a 6,5%. A seguir, incubar em estufa 
de cultura à 35°C durante 24 horas. Decorrido esse tempo, observar se 
ocorreu hidrólise da Bile-Esculina caracterizada pelo aparecimento de 
cor negra, enquanto que o tubo contendo cloreto de sódio modifica cor 
de lilás para amarelo. 
 
 
 
6. Para a realização da prova do PYR utilizar um disco de papel de filtro 
impregnado com L-PIRROLIDONIL BETA NAFTILAMIDA obedecendo a 
seguinte sequência: umedecer o papel de filtro com água estéril ou 
salina também estéril;com auxílio de uma alça estéril retirar colônias do 
meio de cultura e passar na superfície do papel de filtro. Deixar em 
repouso por 3 a 5 minutos e decorrido esse tempo utilizar o reativo 
revelador da presença da enzima L- pirrolidonil arilamidase que é o N-N 
DIMETIL-CINAMALDEÍDO e observar o surgimento de cor rosa ou 
avermelhada no disco de papel indicando a positividade do teste. 
 
ANTIBIOGRAMA: 
 
1. Com auxílio de uma alça bacteriológica, retirar 3 a 4 colônias da 
placa com Agar Manitol Salgado, Agar Cled e colocar em salina 
estéril fazendo a comparação turbidimétrica com tubo de ensaio 
contendo Sulfato de Bário, correspondente à escala 0,5 de Mc 
Farland (105 UFC). 
 
2. Introduzir um swab estéril na suspensão, retirar o excesso de líquido 
nas paredes do tubo e semear pela técnica de distensão na placa de 
Agar Mueller-Hinton em três direções; deixar a placa em repouso 
para que ocorra a absorção da suspensão pelo meio de cultura. 
 
3. Inocular os discos contendo antibiótico em várias concentrações 
utilizando pinça estéril que deve ser flambada na chama 
rapidamente; pressionar levemente os discos para sua fixação no 
meio de cultura e se ocorrer a queda de algum disco não fazer a 
remoção visto que a difusão da droga é imediata; colocar 12 discos 
na placa de 150mm e 5 discos na placa de 90mm. 
 
4. Incubar as placas de forma invertida (tampa para baixo) durante 18 a 
24 horas na estufa de cultura à 35°C em aerobiose e se necessário 
promover atmosfera de CO2 para determinadas bactérias mais 
exigentes do ponto de vista nutricional; após o período de incubação, 
proceder a leitura das placas fazendo a medida do diâmetro do halo 
formado utilizando paquímetro(halômetro) ou régua milimetrada. 
Anotar e depois consultar a tabela dos antibióticos para enquadrar 
nas categorias: SENSÍVEL, INTERMEDIÁRIO, RESISTENTE. 
Lembrar que na leitura fazer a interpretação dos resultados 
considerando os mecanismos intrínsecos de resistência das 
bactérias e informar a detecção fenotípica de formas de resistência 
bacteriana.