Aplicação das técnicas de diagnostico molecular

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 Diagnóstico clínico 
• Sinais (mensuráveis) e sintomas (subjetivo) 
• Origem 
• Etiologia 
• Natureza 
 
 Diagnóstico laboratorial 
• Identificação agentes envolvidos em patologias 
• Suporte para o diagnóstico/tratamento clínico 
• Investigação epidemiológica 
• Investigação científica 
Microscopia Cultivo
Provas 
bioquímicas
Sorologia
• Aglutinação 
• Fixação do 
complemento
• ELISA
Biologia 
Molecular
Hibridização 
Amplificação 
Ac. nucléicos
Diagnóstico definitivo
Antibiograma
Tratamento
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Microscopia Cultivo
Provas 
bioquímicas
Sorologia
• Aglutinação 
• Fixação do 
complemento
• ELISA
Biologia 
Molecular
Hibridização 
Amplificação 
Ac. nucléicos
Diagnóstico definitivo
Antibiograma
Tratamento
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Aplicação das técnicas de 
diagnostico molecular 
Introdução de técnicas 
moleculares no laboratório 
• Qual organismo vai ser detectado? 
 
• Que amostras clínicas vão ser analisadas? 
 
• O teste é sensível, específico e de execução 
rápida e fácil? 
 
• Como padronizar a técnica? 
 
• É clinicamente útil? 
Introdução de técnicas 
moleculares no laboratório 
• Até recentemente, a execução dessas 
metodologias em laboratório clínico era 
considerada difícil e complexa... 
 
... compreensão de princípios gerais básicos de 
biologia molecular 
... disponibilidade de produtos para execução 
 
• A implantação de métodos moleculares se 
tornou-se acessível e de custo efetivo → a 
mesma infra-estrutura servirá para a pesquisa 
de diferentes agentes. 
• Sucesso da técnica → coleta da amostra clínica do 
paciente. 
 
• Qualquer amostras pode ser analisada. 
 
• A amostra mais adequada 
 será colhida considerando 
 o que se deseja investigar 
 ou qual a suspeita clínica. 
 
Ex: 
• hepatite → sangue 
• Meningite → líquor 
 
 
Medida de prevenção de contaminação 
• Apesar da alta sensibilidade e especificidade → detectar 
qualquer agente infeccioso → aplicação na prática médica 
ainda é limitada. 
 
 Resultados falsamente positivos e negativos. 
 
 • Mesmo os laboratórios que 
executam os métodos de 
diagnóstico com máxima 
precisão → erros inerentes à 
tecnologia. 
Falsos Negativos e Positivos 
• Falsos Negativos → são decorrentes da falta de 
amplificação. 
Nesse caso, a amostra clínica analisada possui o agente infeccioso, 
mas não amplifica pois a amostra possui substancias conhecidas 
como inibidoras de reação de PCR (hemoglobina e heparina). 
 
• Inibidores → devem ser totalmente removidas para 
evitar resultados falso negativos. 
Repetição do procedimento de extração de DNA → resolve o 
problema. 
Ideal é realizar as análises sempre em duplicata → dificultado pela 
quantidade insuficiente de amostra. 
 Nesse caso, recomenda-se que uma nova amostra do paciente seja 
solicitada. 
 
Falsos Positivos 
• Falso positivos → podem ocorrer principalmente em 
diagnósticos realizados com protocolos de PCR. 
Amplificação de um DNA diferente do DNA que se está pesquisando 
é a causa do erro. 
 
• Esse DNA pode ser resultado de uma contaminação 
cruzada e pertencer a outro paciente ou de DNA 
amplificado (amplicon) em reações anteriores. 
Os amplicons podem estar presentes → instrumentos, nas roupas, 
no ar, na pele e em outros objetos do laboratório. 
Esses problemas têm levado à elaboração de medidas de controle e 
protocolos de descontaminação que devem ser seguidos de forma 
rigorosa 
 
• Fluxo de trabalho → unidirecional 
 (técnico inicia o trabalho pela preparação de reagentes, inclusive da reação de PCR, 
depois realiza a amplificação com o DNA extraído anteriormente em outra área e, por fim, 
processa a análise de DNA amplificado). 
 
• Manipulação das amostra do paciente - preparação de reagentes - 
análise de DNA → salas separadas que contenham seu próprio material 
(pipetas, tubos, reagentes, etc) e equipamentos. 
• Inclusive a limpeza dessas áreas deve ser realizada com material 
individual. 
Medidas de prevenção de contaminação 
• Descontaminação de superfícies de bancadas, capelas e 
equipamentos → hipoclorito de sódio a 10% ou etanol 70% 
para superfícies metálicas. 
 
• Todo processo deve ser realizado com material plástico 
descartável e ponteiras com filtro para micropipetas. 
 
• Autoclavar as soluções estoque, com exceção de enzimas e 
oligonucleotídeos. 
 
• Água, material descartável (ponteiras e tubos) → livres de 
DNA e RNA (dnase e rnase free). 
 
Medidas de prevenção de contaminação 
• O recomendado é utilizar quatro controles, dois positivos 
e dois negativos, na etapa de extração de DNA e na 
etapa de análise de produto amplificado. 
 
• O monitoramento correto da presença de inibidores só é 
possível se um controle interno for incluído durante o 
procedimento de amplificação de todas as amostras ou 
no mínimo, com as amostras que forem negativas em um 
PCR anterior. 
 
Validação de novos métodos de 
diagnóstico 
• Quando o teste a ser implantado no laboratório for comercial, 
os técnicos devem ser devidamente treinados pelo fabricante. 
 
• Método in house → manter protocolos bem escritos e 
detalhados → garantir a reprodutibilidade dos ensaios. 
 
• O ideal é estabelecer um programa de qualidade dentro do 
laboratório com objetivo de monitorar e avaliar os resultados 
constantemente. 
 
• Calibração de termocicladores, micropipetas e equipamentos 
que amplificam sequencias de DNA → crucial. 
Principais doenças infecciosas 
Tuberculose 
 
• É a doença crônica de maior morbidade e mortalidade, e 
continua sendo um sério problema de saúde pública, 
apesar da disponibilidade de tratamentos eficazes. 
 
• OMS estima que: 
2002 a 2020: 
-1 bilhão de pessoas infectadas; 
- 150 milhões vão adoecer; 
- 36 milhões deverão morrer 
 
 
• Tuberculose pode envolver outros orgãos 
 
•Foco pulmonar inicial é a porção média ou inferior dos 
campos pulmonares 
Tuberculose miliar no fígado 
Doentes 
Baciloscopia 
positiva 
Sem confirm. 
baciloscópica 
Extra- 
pulmonares 
Extra- 
pulmonares 85% 
15% 
10% 
15% 
Sem confirm. 
baciloscópica 
Baciloscopia 
positiva 
Formas 
pulmonares 
Maiores 
de 15 a 
Formas 
pulmonares 
Menores 
de 15 a 
90% 
85% 
70% 
30% 
20% 
80% 
Tuberculose no Brasil 
segundo a idade e a 
forma clínica 
Métodos de diagnóstico 
• Detecção da doença na sua fase inicial é de grande 
importância → tratamento efetivo, evitar utilização 
inadequada de medicamentos potencialmente tóxicos. 
 
• Diagnostico clínico precoce → complicado (saudáveis – não 
ocorre sintomas; associado a outras enfermidades – HIV, neoplasias, 
pós-transplantes ) 
• Estima-se que 40% dos indivíduos infectados por HIV são coinfectados 
por M. tuberculosis. 
 
• Baciloscopia e cultura 
• Moleculares 
 
 
Principais técnicas moleculares 
• Confirmação de isolados em cultura obtidos de amostras 
clinicas utilizando sondas de DNA. 
 
• Detecção direta de M. tuberculosis em amostras de 
escarro e outras amostras clínicas utilizando ensaios de 
amplificação de ácidos nucleicos. 
 
PCR para Mycobacterium tuberculosis 
• Escarro, lavado bronco alveolar, 1º urina da manhã, líquido pleural, 
secreção orofaringe, líquor, líquido ascítico, líquido sinovial e 
fragmento de biópsia. 
 
 Critérios derejeição: 
• Material de secreção de orofaringe enviado em swab 
• Escarro com grande quantidade de saliva. 
• Líquido ascístico sanguinolento 
• Biópsia colhidas e conservadas em formol 
• Material sangue 
• Urina 24horas 
 
• Preço: R$ 113,30 
• Preço particular: R$ 350,00 
HPV 
• 13 tipos de HPV são considerados 
oncogênicos → maior risco ou 
probabilidade de provocar infecções 
persistentes e estar associados a 
lesões precursoras → tipos 16 e 18 
estão presentes em 70% dos casos de 
câncer do colo do útero. 
Métodos de diagnóstico 
Captura Híbrida 
Hibridização com sondas 
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase 
PCR 
Captura hibrida 
HIV 
• Doença que ataca o sistema imunológico devido à destruição 
dos linfócitos T CD4+. 
• Considerada um dos maiores problemas da atualidade pelo seu 
caráter pandêmico e sua gravidade. 
 
• Muitas pessoas com HIV desconhecem as infecções: 
Estigma 
Longos períodos de incubação 
Frequência dos testes 
 
• Cerca de 40% dos indivíduos que adquirem a infecção pelo HIV 
são diagnosticados tardiamente, desenvolvendo a AIDS dentro 
de um ano 
 
 
 
 
HIV 
Diagnóstico imediato é essencial por muitas razões: 
 
• Tratamentos → amenizam a queda de função do sistema 
imune → associados com a queda na mortalidade e morbidade 
associada ao HIV. 
• Pessoas infectadas apresentam maior risco para outras 
infecções (Pneumocystis jiroveci, toxoplasma, Mycobacterium 
avium complex , tuberculosis, pneumonia bacteriana) 
• Detecção precoce permite o encaminhamento do paciente 
para grupos educacionais e de apoio, prevenindo a 
transmissão para outras pessoas 
Métodos de diagnóstico 
• HIV caracteriza-se por ter como material genômico um RNA. 
• A infecção pode ser diagnosticada → por meio da detecção 
direta de componentes do vírus (antígeno p24, RNA viral) ou 
anticorpos. 
• Dependendo da fase da infecção → o HIV pode ser 
encontrado como RNA no sangue (como componente da 
partícula viral livre ou RNA intracelular). 
 
• RNA: 
• Qualitativo 
• Quantitativamente. 
Métodos de diagnóstico 
PCR qualitativo: 
 Existência de infecção (resultado positivo ou negativo) 
• Identificação de indivíduos infectados durante a janela imunológica 
(antes da soroconversão); 
• Pacientes com sorologia positiva ou indeterminada; 
• Pacientes com antecedentes de uso de drogas endovenosas; 
• Profissionais de saúde após exposição ocupacional; 
• Crianças nascidas de mães HIV-1 positivas, já que os anticorpos 
maternos podem persistir de 5 a 14 meses em níveis detectáveis; 
• Pacientes imunossuprimidos. 
 
• Preço Particular: R$ 294,00 
 
 
Métodos de diagnóstico 
PCR quantitativo: 
• Teste de amplificação de ácidos nucléicos in vitro destinado 
à quantificação do RNA do HIV no plasma humano 
 
Indicações clínicas do teste quantitativo são: 
• Avaliação do prognóstico de um paciente por determinação da carga 
viral inicial (artes do início do tratamento); 
• Avaliação da resposta viral à terapêutica antiretroviral, determinada 
através de alterações dos níveis plasmáticos de RNA do HIV durante o 
tratamento. 
 
 
Métodos de diagnóstico 
• Indivíduos com linhas basais de níveis de 
RNA de HIV abaixo de 5000 cópias/mL 
possuem menor risco; 
• Acima de 50000 cópias/mL possuem grande 
risco de progressão da doença. 
• Níveis de RNA de HIV podem auxiliar a 
estimar o início dos sintomas relacionados ao 
HIV que são preditivos de alto risco para a 
ocorrência de infecções oportunistas. 
 
• Preço Particular: R$ 399,00 
• Níveis de RNA de HIV são os mais importantes fatores 
preditivos da progressão da doença. 
Hepatite B 
• Doença transmitida por vírus, uma vez dentro do 
organismo humano, o vírus ataca os hepatócitos – as 
células do fígado – e começa a se multiplicar, levando à 
inflamação do órgão. 
 
• No Brasil, estima-se que 15% da população já foi 
contaminada e 1% é portadora crônica da doença. 
 
• Sintomas de hepatite B surgem entre dois a quatro 
meses após o contato com o vírus, e sua intensidade 
varia de pessoa para pessoa → cerca de 5 a 10% evolui 
para forma crônica da doença no fígado → cirrose e 
câncer. 
 
Métodos de diagnóstico 
• A infecção crônica pelo vírus B apresenta diagnóstico 
complexo, seja pela diversidade de marcadores seja pela 
grande capacidade de mutação do vírus. 
 
• Análises moleculares → identificação qualitativa (PCR) e 
quantitativa (PCR tempo real) 
 
• PCR convencional → sensível, rápido e direto → capaz 
de detectar entre 10 -100 cópias do vírus por mililitro de 
soro/plasma. 
 
• Preço Particular: R$ 165,00 
 
Métodos de diagnóstico 
• A quantificação do DNA viral é importante no 
monitoramento dos pacientes submetidos a tratamento 
com drogas antivirais. 
 
• PCR tempo real → fornece uma análise direta da 
quantidade de vírus circulante → informações sobre a 
progressão da doença (risco de progressão para doença 
hepática terminal). 
 
• Critérios de rejeição: amostra colhida em heparina 
 
• Preço: R$237,66 
• Particular: R$469,00 
 
Hepatite C 
• Doença viral que leva à inflamação do fígado e raramente 
desperta sintomas. 
 
• Maioria das pessoas não sabe que tem hepatite C → descobre 
através de uma doação de sangue ou exames de rotina, ou 
quando aparecem os sintomas de doença avançada do fígado, o 
que geralmente acontece décadas depois. 
 
• Fundo Mundial para a Hepatite da Organização das Nações 
Unidas → cerca de 500 milhões de pessoas no mundo está 
infectada com os vírus para hepatite B e C → 5% delas sabem 
que tem a doença. 
 
• Brasil → 1,5 milhão de pessoas infectadas pela hepatite C →, 
70% das hepatites crônicas e 40% dos casos de cirrose 
Métodos de diagnóstico 
• Tempo médio para desenvolvimento de anticorpos após a 
infecção pelo vírus da Hepatite C → 8 a 12 semanas. 
• Neste período → o paciente apresenta grande quantidade de 
vírus circulante → assintomático e capaz de transmiti-lo. 
• Detecção do RNA viral → “padrão ouro” entre os métodos 
existente de identificação do HCV →permite a identificação do 
vírus 1 a 2 semanas após a infecção (janela imunológica). 
 
• Diagnóstico qualitativo → RT-PCR (reverse transcription) → 
necessário sintetizar uma fita de DNA complementar (cDNA) 
 
• Preço Particular: R$ 238,00 
 
 
 
Métodos de diagnóstico 
• PCR em tempo real → RT-qPCR 
 
• Relevância clínica limitada para o prognóstico; 
• O HCV-RNA quantitativo → útil na determinação da 
probabilidade de resposta a tratamento antiviral. 
• Investigações recentes demonstraram que diminuições precoces 
(dentro de 2-12 semanas) dos níveis de RNA do HCV após o início 
do tratamento são altamente indicadores do resultado eficiente da 
terapia. 
 
• Preço: R$ 362,44 
• Particular: R$399,00 
Meningite bacteriana 
• Infecção severa do sistema nervoso central (SNC) e 
constitui uma das principais emergências médicas. 
• A infecção ocorre dentro do espaço subaracnoideo, e os 
sintomas mais comuns incluem a cefaleia, vômitos, febre, 
rigidez de nuca, sonolência e enjoos. 
• Consiste basicamente na inflamação das meninges e pode 
ser causada por agentes virais, fungos ou bactérias. 
 
 • Meningite bacteriana (piogênica) → 
compromete o sistema nervoso e 
pode causar graves sequelas. 
Meningite bacteriana 
• Devido à gravidade dos casos → diagnóstico precoce → 
fundamental para o tratamento, a fim de se evitarem sequelas 
neurológicas e, nos casos mais graves, a evolução ao óbito do 
paciente. 
 
• Meningitebacteriana → problema de saúde pública → países em 
desenvolvimento. 
 
• Cerca de 5% a 40% das crianças ainda morrem → idade do 
paciente e do patógeno envolvido. 
• Sequelas neurológicas → ocorrem em 5% a 30% dos 
sobreviventes → retardo no estabelecimento do diagnóstico e 
no início do tratamento antimicrobiano eficaz. 
 
Métodos de diagnóstico 
• Streptococcus pneumoniae (pneumococo) 
• Neisseria meningitidis 
• Haemophilus influenzae 
• Listeria monocytogenes 
 
• Amostra: Líquor – colhido por punção lombar 
• Meningite bacteriana – aspecto purulento ou turvo 
 
PCR convencional 
PCR multiplex: 
• Streptococcus pneumoniae (pneumococo) 
• Neisseria meningitidis 
• Haemophilus influenzae 
 
Infertilidade 
• DST’s → são um grupo de doenças 
infecciosas responsáveis por 25% das 
causas de infertilidade – 15% para as 
mulheres e 10% para os homens. 
 
• Clamydia trachomatis 
• Neisseria gonorrhoeae 
• Ureaplasma urealyticum 
• Micoplasma genitalis 
• Micoplasma hominis 
• Clamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae → Infecções 
assintomáticas: 50% dos homens e 70 % das mulheres : 
• não detectada; 
• não tratada 
• não reportada 
 
Impacto no sistema reprodutivo feminino 
•25% infecções não tratadas levam à DIP 
•20% casos de DIP infertilidade 
•18% dor pélvica persistente 
•9% gravidez ectópica 
 
 
 
Métodos de diagnóstico 
• PCR qualitativo para cada microrganismo. 
 
• PCR Multiplex → capaz de detectar, em uma única reação, a maioria 
das bactérias associadas às infecções do trato genital: C. trachomatis, 
N.gonorrhoea, M.hominis, M. genitalis e U.urealyticum. É de grande 
valia no diagnóstico diferencial das uretrites, cervicites. 
 
• Amostra: urina 1º jato da manhã, secreção uretral, vaginal e endocervical 
 
• Preço: R$114,00 
• Particular: R$ 350,00 
 
 
 
 
ARTIGO 
Métodos convencionais e moleculares para o 
diagnóstico da tuberculose pulmonar: um estudo 
comparativo 
 
J Bras Pneumol. 2008;34(12):1056-1062 
Mycobacterium tuberculosis 
• Bacilos aeróbios estritos 
• Parede celular rica em lipídios: 
Álcool-ácido-resistentes (Baar) 
Crescimento lento – tempo de geração de (15 a 20h) 
Resistentes à ação de detergentes e a antibióticos 
 
 
Incidência mundial da tuberculose (em 2008) 
Brasil: 
 
• 35 - 45 milhões de 
pessoas estão 
infectadas; 
 
• Cerca de 100 mil casos 
novos a cada ano; 
 
• 4 – 5 mil mortes 
ocorrem anualmente; 
 
• Últimos anos, o MS 
passou a considerar a 
TB como problema 
prioritário no Brasil . 
Perguntas 
• Qual a relevância do tempo para diagnosticar a doença? 
 
• Foi observado cultura positivo e PCR negativo, porque 
isso pode ter acontecido? 
 
• O PCR pode ser usado para o acompanhamento do 
tratamento? 
 
• Quais são as vantagens e desvantagens do uso do PCR 
para identificação da tuberculose? 
 
Técnicas de diagnóstico molecular, geralmente caras, não devem ser 
usadas no lugar de técnicas convencionais que são reconhecidamente 
rápidas, sensíveis, reprodutíveis e que possuem um alta relação custo 
benefício. 
 
 
 A decisão por um diagnóstico molecular deve levar em 
consideração principalmente o impacto da nova técnica na 
prática clínica e a economia de gastos associados à intervenção 
e para o paciente. 
 
 A detecção rápida de S. aureus ou M. tuberculosis 
multirresistente pode resultar em um isolamento mais rápido do 
paciente, terapia mais apropriada e diminuição da 
infecciosidade do paciente. 
Contenção do 
espalhamento da 
infecção 
diminuição do 
tempo de 
morbidade do 
paciente 
custo-benefício da 
utilização de técnicas 
moleculares para 
diagnóstico 
+ = 
• Apesar de toda rapidez e sensibilidade, o diagnóstico 
molecular não pode substituir os métodos culturais e 
sorológicos convencionais em todos os momentos. 
 
• Os resultados do diagnóstico molecular e dos métodos 
culturais e sorológicos têm significado diferente. 
A detecção ou amplificação de ácidos nucléicos determinam 
se existe DNA ou RNA de um organismo particular em uma 
amostra biológica 
 
 
 Não revela dados sobre a viabilidade do organismo 
 
 Não diz se um microrganismo está envolvido em um 
processo infeccioso 
 
 Permite avaliar a clonalidade dos diferentes organismos e 
permite avaliação de surtos e geração de conhecimento 
epidemiológico 
 
 
 
 
 
 
 
Contato: Juliana A. Resende 
ju.alves.resende@gmail.com