Relatório Aprendizado sobre Conduta Geral no Laboratório Técnica e processo de assepsia Como trabalhar com o microscópio Coloração de Gram

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CENTRO DE ENGENHARIAS E CIÊNCIAS EXATAS
CURSO DE ENGENHARIA QUÍMICA
Aprendizado sobre Conduta Geral no Laboratório
Técnica e processo de assepsia
Como trabalhar com o microscópio
Coloração de Gram
TOLEDO- PARANÁ
26 DE SETEMBRO DE 2018
ÉDEN ROCKENBACH
MARLLON FELIPE SCHWARZER
VICTORIA LANZANA
Trabalho entregue a Professora Jacqueline Ferandin Honorio como avaliação da disciplina de Microbiologia Industrial do curso de Engenharia Química da Universidade Estadual do Oeste do Paraná – Campus Toledo.
	
TOLEDO- PARANÁ
26 DE SETEMBRO DE 2018
INTRODUÇÃO 
 Condutas geral no laboratório e técnicas e processos de assepsia
O laboratório de microbiologia deve ser considerado como um local sujeito a possíveis fontes de contaminação, bem como aos mais variados tipos de acidentes envolvendo materiais, substâncias químicas e microrganismos, representando, portanto, um risco em potencial para todos os envolvidos no trabalho e manuseio. Desta forma, é de extrema importância que além das condutas básicas, como organização e desinfecção de materiais e bancada, o uso de jaleco e luvas, evitar transitar pelo ambiente desnecessariamente, não comer e beber, as técnicas de assepsia sejam aplicadas para que acidentes desnecessários sejam evitados e que não haja contaminação dos experimentos e que os laboratoristas fiquem livres de doenças e infecções. Todas essas medidas tomadas se resumem ao termo “contenção”, que visa reduzir ou eliminar a exposição da equipe laboratorial ou o meio ambiente de agente perigosos. A contenção pode ser subdividida em primária e secundária, onde a primária se refere a proteção da equipe do laboratório, com equipamentos como: luvas, jaleco, máscaras, e a proteção pessoal, que seriam as vacinas. Já a contenção secundária consiste na proteção do meio ambiente externo do laboratório, contra a exposição aos materiais infecciosos, como: projeto de instalações e das práticas operacionais e práticas e técnicas laboratoriais (UFRJ, 2015).
As técnicas de assepsia são exemplos também de contenção secundária. O local de trabalho, vidrarias e as mãos dos laboratoristas devem ser os primeiros a passarem pelo procedimento de assepsia. O bico de Bunsen é utilizado durante os experimentos também como técnica de assepsia, na qual destacam-se a utilização da área de segurança, a qual consiste em um raio de 10 cm em torno da chama que reduz o risco de contaminação e também limita a área de trabalho, e a flambagem, que utiliza a o calor da chama do bico de Bunsen para reduzir o número de microrganismos presentes no utensílio. Este método é considerado rápido e efetivo, porém o gás resultante da queima pode conter partículas virais ou gases tóxicos, por isso recomenda-se o uso de “capelas” com fluxo de ar controlado ou máscaras. Por conta do uso do fogo durante maior parte do tempo no laboratório é importante que mantenha o cabelo preso e longe da chama, que tenha cuidado ao manusear produtos inflamáveis e, claro, que não fume (SALVATORI et al, 2013). 
	Em caso de acidentes, como derramamento de algum material infeccioso sobre alguma bancada ou no chão, deve-se cobrir imediatamente a área com um desinfetante adequado e deixar de 15 a 30 minutos antes da limpeza. Caso haja contato desse tipo de material com as mucosas, é necessário imediatamente contatar o professor ou o responsável presente (ROTEIRO, 2018). 	
	Mesmo que pareçam muitos e detalhados, os cuidados e práticas citadas anteriormente representam um nível básico de contenção, e abrangem somente o primeiro de quatro níveis de biossegurança, os quais são uma maneira de classificar as precauções que devem ser tomadas para a prática de uma ciência mais segura. Neste primeiro nível o trabalho envolve agente biológico da classe de risco 1. O nível de biossegurança 2 exige que o trabalho envolva agentes biológicos da classe de risco 2 (organismos patogênicos, porém geralmente não apresentam um perigo sério para os indivíduos). Exige-se nesse nível a aplicação das condutas básicas, uso de equipamentos de proteção individual específicos e certo nível de treinamento dos laboratoristas. O nível 3 é aplicável aos locais onde forem desenvolvidos trabalhos com agentes biológicos da classe de risco 3 (microrganismos que causam doenças humanas graves, mas que que possuem tratamento). Além das medidas usadas no nível dois, os profissionais devem ser registrados junto a autoridades sanitárias nacionais e todos os procedimentos que envolverem a manipulação de agente biológico devem ser conduzidos dentro de dispositivos de contenção física. O último e quarto nível, deve ser usado sempre que o trabalho envolver agentes da classe de risco 4 ou com potencial patogênico desconhecido. A equipe do laboratório, supervisionada pelo profissional responsável, deve possuir treinamento específico, direcionado para a manipulação de agentes patogênicos extremamente perigosos. O laboratório deve ser em uma edificação construída separadamente de outras edificações ou localizada em uma zona completamente isolada, devendo possuir características específicas quanto ao projeto para prevenção de disseminação de agentes no meio ambiente. Estes laboratórios de contenção máxima só funcionam com autorização e fiscalização das respectivas autoridades sanitárias. 
 Como trabalhar com microscópio
Até ao início do séc. XVII o conhecimento dos seres vivos limitava-se, fundamentalmente, a organismos macroscópicos. A descoberta da célula só foi possível quando o avanço técnico permitiu o aperfeiçoamento das lentes e a construção do microscópio óptico composto (MOC). O microscópio é um instrumento utilizado para ampliar e observar estruturas pequenas dificilmente visíveis ou invisíveis a olho nu. O microscópio ótico utiliza luz visível e um sistema de lentes de vidro que ampliam a imagem das amostras. Este equipamento é constituído por uma componente mecânica de suporte e de controlo da componente ótica que amplia as imagens. Os microscópios atuais que usam luz transmitida partilham os mesmos componentes básicos (Imagem 1).
Figura 1 - Componentes do microscópio
	A intensidade da luz pode ser regulada diretamente através do reóstato que atua na própria fonte luminosa ou indiretamente através do condensador e do diafragma: a intensidade aumenta se subir o condensador e abrir o diafragma e diminui se descer o condensador e fechar o diafragma. A ampliação é função conjunta do poder de ampliação da lente objetiva e da lente ocular utilizadas. A ampliação total é o produto da ampliação da objetiva pela ampliação da ocular (exemplo, ampliação da ocular 10x, ampliação da objetiva 20x, ampliação total é 10 x 20 = 200x). 
A imagem observada depende também do poder de resolução, isto é, a capacidade que as lentes têm de discriminar objetos muito próximos. O poder de resolução depende do comprimento de onda da luz utilizada, e o seu valor teórico para um microscópio ótico é de cerca de 0,2 µm (dois objetos têm de estar pelo menos a uma distância um do outro de 0,2 µm para poderem ser discriminados ao microscópio ótico). 
A placa com amostra é colocada na platina e fixa com o auxílio das pinças. Com os parafusos existentes na platina move-se a placa até a amostra estar sobre a abertura por onde passa a luz. Olhando através da ocular (monocular ou binocular, respetivamente com uma ou duas lentes) e com a objetiva de menor ampliação foca-se a imagem, preferencialmente no centro do campo de visão, utilizando os parafusos macrométrico e micrométrico. Após esta primeira focagem, podem-se utilizar objetivas de maior poder de ampliação, de forma sequencial repetindo todo o processo já descrito. A imagem final observada será ampliada, virtual e invertida. Dependendo do microscópio, em alguns casos, a imagem final pode ser direita e não invertida. 
 Coloração Gram 
O método tintorial predominante utilizado em bacteriologia é o método de Gram. A coloração de Gram recebeueste nome em homenagem a seu descobridor, o médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: Gram positivas e Gram-negativas. 
O método consiste no tratamento de um esfregaço, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo, Cristal Violeta-Iodo (C.V-I.), insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o C.V-I. é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. 
A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente provoca a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade.
Por fim, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. 
OBJETIVOS 
Aprender como se deve portar dentro do laboratório de Microbiologia, com base nas normas de segurança e de conduta; conhecer os procedimentos básicos da técnica e processos de assepsia realizados em laboratório de Microbiologia para evitar contaminações; conhecer o funcionamento de um microscópio ótico e as partes que o compõem, visando aprofundar os conhecimentos que o cercam sobre a microbiologia industrial; realizar a técnica de coloração Gram, e compreender a sua importância. Relacionar os resultados da coloração com a parede celular das bactérias.
MATERIAIS E MÉTODOS 
Materiais:
Lâminas; 
Alças e agulhas; 
Bico de Bunsen; 
Bateria da coloração de Gram; 
Culturas bacterianas em meio líquido e sólido; 
Óleo de imersão; 
Microscópio. 
Microrganismos:
Staphylococcus aureus
Saccharomyces
Escherichia coli
Métodos
O esfregaço foi feito sobre uma lâmina, a qual foi seca na chama do bico de Bunsen e então submetida à técnica da coloração de gram. Inicialmente adicionava-se o primeiro corante (cristal violeta), aguardava 1 min e lavava com água para retirar o excesso de corante. Após isso, adicionou-se o lugol (fixador), aguardou-se 1 min e lavou-se com água. Na etapa seguinte lavou-se a lâmina com álcool até que não saísse mais corante e por fim adicionou-se o ultimo corante (fucsina) e então lavou-se a lâmina com água para retirar o excesso de corante. Após as lâminas serem secas foram analisadas no microscópio.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Condutas geral no laboratório
Ao iniciar o trabalho no laboratório é obrigatório a lavagem das mãos e antebraço com detergente apropriado, completando-se a desinfecção com a aplicação de álcool 70%. Deve-se limpar a bancada de trabalho antes e após a realização do procedimento. Após a limpeza, é feita a desinfecção utilizando, por exemplo papel descartável e álcool 70° GL ou solução de hipoclorito de sódio. Faz parte da limpeza da bancada, o descarte de resíduos utilizados em um recipiente adequado (lixo comum quando não apresentar risco de contaminação), e a retirada de materiais, amostras, reagentes e equipamentos após o término da tarefa. 
No procedimento de limpeza e desinfecção das vidrarias os frascos utilizados para amostragem são colocados de molho em solução de hipoclorito de sódio e sabão líquido por no mínimo 24 horas. Lavados com água corrente, detergente e esponja, retirando todos os resíduos do seu interior. Já no piso do laboratório de microbiologia é necessário que seja limpo e desinfetado diariamente com 5 mL de solução de hipoclorito de sódio a 2%, em um litro de água (SALVATORI et al, 2013).
	O descarte de amostras, segundo Salvatori et al. (2013), deve ser feito no término da análise, sendo que as amostras processadas são armazenadas em sacos adequados e destinadas à esterilização em autoclave a 121±1ºC por 20 min. Em seguida, o material é destinado para o lixo orgânico da instituição. O mesmo procedimento deve ser feito com alíquotas para as diluições nos processos analíticos.
	As vidrarias quebradas com meio de cultura são autoclavadas antes do descarte e acondicionadas em recipientes apropriados (Becker de 1000 mL, potes plásticos). Para o descarte de materiais tóxicos e contaminantes, o ideal é que estes sejam acondicionados em caixa coletora própria, sendo seu recolhimento efetuado quando atingida a capacidade da mesma. Já o descarte de vidrarias danificadas, o procedimento é a armazenagem em caixas coletoras próprias e destinadas a usina de reciclagem. No caso de descarte de materiais não reutilizáveis, como as placas de petri e ponteiras, aconselha-se a estas a autoclave, e em seguida o descarte conforme determinado na Instituição (SALVATORI et al, 2013).
4.2 Técnicas e processo de assepsia
Quando uma população de bactérias é submetida ao calor, suas proteínas são desnaturadas. Há fluidificação dos lípideos na presença de calor úmido. Os microrganismos são considerados mortos quando perdem a sua capacidade de se multiplicar de forma irreversível. Dessa forma, a fim de garantir uma maior esterilização e limpeza de todo o espaço e amostra utilizada, pode-se realizar também a técnica de flambagem (PORTAL EDUCAÇÃO, online).
4.3 Como utilizar o microscópio
A microscopia de campo claro pode ser definida por ter um tipo de iluminação e trajetória produzidas em microscópios compostos comuns. Este tipo de microscopia mostra as estruturas internas e contornos do revestimento interno.
	Para definir um bom microscópio analisa-se o número de abertura, pois quanto maior for, menor será seu limite de resolução. Neste sentido, quanto maior o poder de resolução melhor é o microscópio, e este parâmetro é inversamente proporcional ao limite de resolução (TORTORA, 2012).
4.4 Coloração Gram
De modo geral, a reação que ocorre na coloração Gram resulta essencialmente das interações do complexo, cristal violeta ou violeta de genciana e iodo, com o peptideoglicano da parede celular na presença de ribonucleato de magnésio, sendo essa mediadora da fixação do corante.
	A troca da fucsina fenicada pela safranina como corante secundário (ou corante de fundo) foi a modificação mais importante. Essa mudança foi estabelecida baseada no espectro de cores, onde a safranina mantém-se mais distante da violeta no espectro de cor, diferenciado com maior nitidez as bactérias Gram-negativas que se destacam das Gram-positivas e da coloração de fundo, que assume a cor vermelho-claro (Ministério da Saúde, online). Elas se diferem bioquimicamente da seguinte forma: a safranina é um corante ácido, pertencente ao grupo das triarilpirazinas e solúvel em água, enquanto a fucsina é um corante básico, do grupo dos triarilmetanos e insolúvel em água. 
	O preparo do corante violeta de metila é realizado da seguinte forma: separa-se uma amostra de violeta-de-metila e mistura-se com uma alíquota de álcool metílico e uma alíquota de álcool etílico. Reserva-se a mistura, deixando-a descansar por alguns minutos e misturando, repetindo esse processo até alcançar completa dissolução do corante.
Na maioria das vezes o controle de qualidade se faz necessário quando se utiliza a técnica da coloração de Gram. Para isso, é preciso utilizar cepas bacterianas padrão (gram-positivas e gram-negativas), além de observar com frequência o aspecto dos reagentes utilizados.Exemplos de cepas de controle são: S. pyogenese E. coli, que têm como resultados esperados bacilos gram-negativos rosas e cocos gram-positivos violeta escuros. 	Nas análises realizadas com saccharomyces, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, com o auxílio do microscópio apenas conseguimos identificar a saccharomyces (Figura 2).
Figura 2 - Saccharomyces
Na figura 2, podemos identificar e classificar a saccharomyces através da cor roxa característica, indicando que esta é Gram-positiva, como previsto na literatura. Os outros micro-organismos não foram possíveis visualizar, devido provavelmente a erros experimentais durante o procedimento de coloração.
Existem diversas outras técnicas de coloração empregadas na análise de microrganismos, como: coloração simples, método de Ziehl-Nielsen, coloração negativa, imuno-citoquímica, coloração supra-vital e reativo de Schiff.
CONCLUSÃO
	Através do procedimento experimental, pode-se concluir que as bactérias quando submetidas à técnica de coloração de Gram podem ser classificadas em: Gram-positivas e Gram-negativas, e que este resultado depende da parede celular do microorganismo, sendo a diferenciação observada nas etapas da adição de álcool e adição de fucsina. Os resultados obtidos experimentalmente foram condizentes com os relatados pela literatura, pois observou-se a coloração roxa característica para uma amostra de saccharomyces após a adição de álcool, e análise em microscópio óptico, indicando que esta era uma bactéria Gram-positiva. Não foi possível observar no microscópio as bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli provavelmente por conta de alguma alteração ou erro no procedimento, várias placas foram preparadas com essas culturas e em nenhuma delas foram observados os microrganismos. Mesmo que apenas uma bactéria do tipo Gram positiva foi observada, foi possível ter certeza de que o microscópio é um instrumento de trabalho essencial em um laboratório de microbiologia, visto que contorna a limitação presente na visão humana para verificação de culturas. Ao manusear diversas bactérias concluiu-se a importância de boas condutas e jamais pular etapas e procedimentos de assepsia, os mesmos podem interferir de forma significativa nos resultados finais.
REFERÊNCIAS
BIOMEDICINA BRASIL. Coloração de Gram. Disponível em: <http://www.biomedicinabrasil.com/2011/06/coloracao-de-gram.html> Acessado em: 24 de Setembro de 2018.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Técnica de coloração de Gram. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf>. Acesso em 21 de setembro de 2018.
MENDONÇA, C. P., et al. Estudo Comparativo Entre Métodos de Coloração para a Pesquisa do Bacilo Álcool-Ácido Resistente em Secreções Pulmonares. Rev. Saúde pública., S. Paulo, 9:7-10, 1975.
MORIYA, T., MÓDENA, J. L. P. ASSEPSIA E ANTISSEPSIA: TÉCNICAS DE ESTERILIZAÇÃO. Simpósio: Fundamentos Em Clínica Cirúrgica - 1ª Parte. Medicina, Ribeirão Preto, ano 3, v. 41, p. 265-73, 2008.
Normas De Segurança No Trabalho No Laboratório De Microbiologia da UFMT. Disponível em <http://araguaia2.ufmt.br/professor/disciplina_arquivo/42/20131022713.doc>. Acesso em 21 de setembro de 2018.
PORTAL EDUCAÇÃO. Esterilização de materiais. Disponível em < https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/direito/esterilizacao-de-materiais/50938>. Acesso em 21 de setembro de 2018.
PROVIDA. Coloração de Gram. Disponível em: <http://www.provida.ind.br/site/index.php/bacterias/bacterias/122-tecnica-de-gram.html> Acessado em: 24 de Setembro de 2018.
Roteiro para realização das Práticas em Microbiologia Industrial. Universidade Estadual do Oeste do Paraná, 2018.
TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L., Microbiologia. 10ª Edição. Capítulo 3.
TRABULSI, L. R., ALTERTHUM, F., GOMPERTZ, O. F., CANDEIAS, J. A. N. Microbiologia. Editora Atheneu, São Paulo, 1999. 
SALVATORI, R. U.; WOLF, G. A. K.; DRESCH, F.; STROHSCHOEN, A. A. G. Laboratório de microbiologia: normas gerais, instruções de trabalho e procedimentos operacionais padrões. Editora UNIVATES, 2013.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO. Desinfecção e esterilização. Escola de Química, Microbiologia Industrial, 2015. Disponível em < http://www.eq.ufrj.br/biose/nukleo/aulas/Microbiol/eqb353_aula_07.pdf>. Acesso em 21 de setembro de 2018.
VIEIRA, FERNANDES Microbiologia Aplicada. IFG; Santa Maria: Universidade Federal de Santa Maria, 2012. 90 p. Disponível em < http://estudio01.proj.ufsm.br/cadernos/ifgo/tecnico_acucar_alcool/microbiologia_aplicada.pdf> Acessado em 24 de setembro de 2018.