relatório ENSAIO DE HEMAGLUTINAÇAO INDIRETA

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INTRODUÇÃO
A doença de Chagas é uma infecção parasitária causada pelo Trypanosoma cruzi, um protozoário cujo ciclo de vida inclui a passagem obrigatória por vários hospedeiros mamíferos, para os quais são transmitidos pelo inseto vetor, o barbeiro. Essa doença também pode ser considerada uma antropozoonose resultante das alterações produzidas pelo ser humano no meio ambiente e das desigualdades econômicas.
A transmissão da doença de Chagas pela via vetorial é considerada o mecanismo de transmissão de maior relevância epidemiológica. A infecção por T. cruzi também pode ocorrer, em menor escala, através de transfusão de sangue e, muito raramente, por transmissão oral, congênita, manuseio de animais silvestres e domésticos, transplantes de órgãos e acidentes em laboratórios e hospitais.
Os triatomíneos, como são conhecidos os insetos vetores, são considerados os vetores mais importantes da doença. Este inseto possui hábitos noturnos e apresenta em sua saliva propriedade anestésica e anticoagulante, tornando assim indolor sua picada. Uma vez contaminado com o parasito, o triatomíneo continua infectado por toda sua existência, variando seu potencial de infecção de acordo com a cepa do parasito e peculiarmente com a sua capacidade em aderir-se ao espaço domiciliar.
O Trypanosoma cruzi, quando eliminado pelas fezes do barbeiro, apresenta-se na forma de uma célula alongada com um flagelo que lhe facilita o movimento, chamada tripomastigota. Estes tripomastigotas são chamados metacíclicos, tipo ocorrente no organismo dos barbeiros. Após a entrada no organismo do hospedeiro vertebrado, ocorre a infecção de células próximas ao local da picada. Dentro da célula, os tripomastigotas assumem uma forma ovóide e sem flagelo, chamada amastigota, a qual se multiplica rapidamente. O grande número de parasitos provoca o rompimento celular e os tripanossomídeos entram na corrente sanguínea e no sistema linfático. Nesse momento, eles reassumem novamente a forma flagelada, sendo chamado de tripomastigotas sanguíneos, tipo ocorrente nos vertebrados. Assim, espalham-se pelo organismo e infectam mais células em novos ciclos, causando lesões principalmente em tecidos musculares cardíacos e lisos, podendo levar a graves problemas, como a insuficiência cardíaca, e também ao óbito. 
O diagnóstico da infecção pode ser feito pelo exame microscópico em uma gota de sangue, chamado gota espessa, para a eventual identificação do parasito. É realizada também a detecção de anticorpos anti-Trypanossoma cruzi pelos imunoensaios, sendo amplamente empregado o método de hemaglutinação indireta. Este método tem como fundamento o emprego de eritrócitos de aves sensibilizados com componentes antigênicos do Trypanossoma cruzi altamente purificados, sendo aglutinados pelos anticorpos anti-Trypanossoma cruzi presentes na amostra analisada. 
OBJETIVO
Realizar a técnica de Hemaglutinação indireta, determinação qualitativa, para detecção de anticorpos anti-Trypanossoma cruzi no soro.
 PARTE EXPERIMENTAL
3.1. MATERIAIS E REAGENTES
Kit para determinação qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos anti-Trypanossoma cruzi contendo:
- Suspensão de hemácias;
- Diluente;
- 2-mercaptoetanol;
- Controle positivo e controle negativo;
- Placa de microtitulação contendo 96 poços de fundo em “V”.
Pipeta;
Luva de procedimento; 
Gases;
06 amostras;
3.2. PROCEDIMENTOS
Preparo do Diluente de Uso: 
No momento do uso, misturar 7µL de 2-Mercaptoetanol com 1000µL de Diluente.
 TESTE QUALITATIVO
Colocamos a placa de microtitulação sobre uma gaze umedecida para neutralizar as forças eletrostáticas.
Utilizamos uma cavidade da placa por amostra, incluindo os controles positivo e negativo, conforme a figura abaixo.
Figura 1: Ilustração da placa de microtitulação.
Deve-se diluir em tubo de ensaio (diluição 1/32): 10µL de soro + 310µL de diluente de uso. (no momento do procedimento já estavam devidamente diluídos)
Pipetamos 50µL de controle positivo, controle negativo e da diluição 1/32 de cada amostra nas respectivas cavidades da placa.
 
Figura 2: controles positivos e negativos.
Adicionamos 25µL de suspensão de hemácias e homogeneizamos em cada cavidade.
Figura 3: suspensão de hemácias.
Agitamos a placa batendo com os dedos nas bordas da placa por 3 a 4 minutos.
Em seguida deixamos a placa em repouso por 1 a 2 horas à temperatura ambiente, livre de vibração, para posterior leitura das reações.
Figura 4: microplaca após 1h em temperatura ambiente.
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As amostras: C que estava diluída em 1/64; D em 1/128; E em 1/256; G com 1/1024 e H com 1/2048 não houve a aglutinação, e sim a formação de um botão no fundo da microplaca que é o indicativo de que não se tem anticorpos presente ou se tem uma quantidade que é irrelevante. Devido a isso as amostras C, D, E, G e H são negativas.
Somente a amostra F que estava diluída em 1/512 houve a aglutinação ou a formação de um tapete filamentoso que foi á ligação de anticorpos presente na amostra com as hemácias sensibilizadas dando um resultado positivo.
Calculo das diluições:
C: 1/32*2= 1/64 (Não reagente)
D: 1/4*2=1/128 (Não reagente)
E: 1/128*2=1/256 (Não reagente)
F: 1/256*2=1/512 (Reagente)
G: 1/512*2=1/1024 (Não reagente)
H: 1/1024*2=1/2048 (Não reagente)
 TITULO: 1/512.
Como a amostra F houve a aglutinação caracterizando um resultado positivo então devemos realizar o TESTE SEMI-QUANTITATIVO, onde devemos:
preparar diluição do soro com resultado positivo no teste qualitativo a 1/32 conforme foi feito no item 3 do procedimento de teste qualitativo.
Pipetar 50µL o diluente a partir da segunda cavidade da placa até a diluição que se pretende testar. Ex.: se pretender diluir o soro até 1/512, pipetar 50µL do diluente nas cavidades A2, A3, A4, e A5. Não pipetar na A1. 
Pipetar 50µL o soro diluído a 1/32 na primeira e segunda cavidades (A1 2 A2). Homogeneizar bem o soro com diluente de uso na segunda cavidade (A2) (diluição 1/64) e transferir 50µL para terceira cavidade (diluição 1/128) e assim sucessivamente, desprezando 50µL no final.
 Pipetar 25µL da suspensão de hemácias e homogenizar em todas as cavidades. 
Agitar a placa por vibração mecânica (agitador de placa) ou batendo com os dedos nas bordas da placa por 3 a 4 minutos. 
Deixar em repouso por 1 a 2 horas à temperatura ambiente em local livre de vibrações.
*OBS: o teste semi-quantitativo descrito acima não foi realizado durante a aula pratica. 
CONCLUSÃO
A partir deste ensaio concluímos que as hemácias e as partículas inertes podem ser sensibilizadas por adsorsão passiva, devida aos contatos diretos com os Ag solúveis. São utilizados como suportes na adsorção de proteína solúvel e Ag polissacarídeos, funcionando como sistema indicador da reação Ag-Ac.
 REFERÊNCIA
ARGOLO ANA MARIA; Et.al. DOENÇA DE CHAGAS E SEUS PRINCIPAIS VETORES NO BRASIL. Fundação Oswaldo Cruz, Programa Integrado de doença de Chagas. Rio de Janeiro, 2008.
COSTA, M.; TAVARES, V.; AQUINO M.; MOREIRA D. DOENÇA DE CHAGAS: UMA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. Goiás, 2013. 
Doença de Chagas – Triagem e diagnóstico sorológico em unidades hemoterápicas e laboratórios de saúde publica. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/cd07_08.pdf> Acesso em: 08/06/2015.